艱難梭菌感染的實驗室診斷技術研究進展 *

袁寶玉，沈芳

(復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院檢驗科，上海 200240)

艱難梭菌作為人類腸道正常菌群，是一種專性厭氧革蘭陽性芽孢桿菌，由于其較難在實驗室中分離和生長而被命名為艱難梭菌。腸道菌群的平衡對于維持人體健康至關重要，而廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑或化療藥物的大量使用會引起菌群失調(diào)，導致艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)及相關性腹瀉，嚴重時可導致偽膜性結(jié)腸炎、暴發(fā)性結(jié)腸炎、中毒性巨結(jié)腸甚至死亡[1]。近年來，CDI發(fā)病率顯著增加，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全。有數(shù)據(jù)表明2003年美國出院人群CDI發(fā)病率為7.5‰，2012年增加到13.5‰[2]，平均每年有453 000人感染、29 000人死亡[3-4]，由CDI導致的經(jīng)濟負擔為4.36～30億美元[5]。目前，CDI已成為重要的醫(yī)院感染之一，及早、正確地根據(jù)相關癥狀及實驗室檢查結(jié)果診斷CDI，不僅有助于臨床診療和疾病預防，還可降低不必要的醫(yī)療費用支出。本文就常用的艱難梭菌實驗室診斷方法進行綜述，以期為CDI診斷提供方法學參考。

1 目前常規(guī)使用的艱難梭菌實驗室診斷方法

艱難梭菌的實驗室診斷技術一般分為3類：微生物培養(yǎng)、免疫學檢測(艱難梭菌毒素、谷氨酸脫氫酶)和分子生物學檢測。

1.1微生物培養(yǎng)

1.1.1艱難梭菌的厭氧培養(yǎng) 艱難梭菌是專性厭氧菌，對培養(yǎng)條件要求嚴格，在常規(guī)厭氧培養(yǎng)條件下不易生長，在環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂(cycloserin-cefoxitin-fructose agar, CCFA)培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24～48 h時，可形成白色或淡黃色、邊緣不整齊以及典型馬糞氣味的菌落，在紫外線照射下可見黃綠色熒光，因此使用CCFA進行培養(yǎng)后，可根據(jù)菌落形態(tài)、熒光特點、氣味和革蘭染色結(jié)果進行鑒定[6]。Kochan等[7]對傳統(tǒng)的CCFA培養(yǎng)方法進行一些改進，如在CCFA培養(yǎng)基中加入?；悄懰徕c或溶菌酶，可以進一步富集芽孢，提高敏感性。此外，顯色培養(yǎng)基也被用于艱難梭菌的培養(yǎng)及鑒定，如法國BioMérieux公司先后開發(fā)的IDCd培養(yǎng)基、CLO培養(yǎng)基和CDIF培養(yǎng)基[8]，艱難梭菌在此類培養(yǎng)基上可形成特征性黑色菌落，更易辨別[9]。

艱難梭菌分離培養(yǎng)作為一種傳統(tǒng)方法，不僅敏感性高，而且可獲取相應菌株用于分子分型和耐藥分析，能更全面地了解其流行病學特征，為臨床治療提供依據(jù)。但其缺點也不可忽視，分離培養(yǎng)耗時較長，不能明確區(qū)分產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株[5]，因此不能為臨床快速診斷提供依據(jù)，導致很難在臨床實驗室廣泛開展。

1.1.2細胞毒性試驗(cell cytotoxicity assay,CCTA) 艱難梭菌可分泌致病性毒素，CCTA是檢測毒素的重要方法?？扇』颊咝迈r糞便標本進行稀釋，經(jīng)離心、過濾后，將濾液滴加到微量滴定板上單層細胞中，培養(yǎng)24～48 h后觀察是否出現(xiàn)細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)，然后通過特異性抗血清中和試驗確定CPE的特異性，鑒定CPE是否由艱難梭菌相關毒素引起[10]。CCTA敏感性、特異性高，是檢測糞便毒素的金標準[11]，但結(jié)果易受多種因素影響，如細胞系種類、糞便濾液標本制備質(zhì)量和工作人員經(jīng)驗等[12]，此外，CCTA操作具有一定復雜性，且需要無菌環(huán)境和細胞培養(yǎng)設備，目前未在臨床實驗室中常規(guī)開展[13]。

1.1.3毒力生成培養(yǎng)試驗(toxigenic culture, TC) TC試驗包括艱難梭菌培養(yǎng)和毒素檢測兩部分，只有培養(yǎng)結(jié)果陽性才進行毒素檢測，主要有細胞毒性檢測、免疫學檢測毒素以及分子生物學檢測毒素基因等[12]。TC雖然是一種兼具高敏感性和高特異性的檢測技術，但由于僅檢測艱難梭菌的體外產(chǎn)毒能力，故不能用于反映菌株在高度可變的體內(nèi)產(chǎn)生毒素情況，不能區(qū)分產(chǎn)毒性菌株在體內(nèi)是否引起真正感染[13]。和CCTA類似，TC也會耗費大量時間，引起治療延遲，使患者癥狀加重，甚至死亡。因此，TC主要用于流行病學研究及新方法評估，一般不用于臨床[10]。

1.2免疫學檢測

1.2.1毒素的免疫學檢測 毒素A和毒素B是艱難梭菌發(fā)病機制中的關鍵毒力因子，被視為診斷CDI的重要指標。在美國，90%以上的實驗室均采用免疫學檢測方法[13-14]，包括酶免疫方法(enzyme immunoassays, EIAs)、熒光酶免疫測定(enzyme linked fluorescence assay, ELFA)等。

EIAs是以酶標記抗體作標志物檢測樣本中毒素A、B的分析技術。目前市面上有多種基于EIAs的商品化試劑盒[6,15]，其性能因廠家而異，其中比較常見的是采用ELISA雙抗體夾心法。盡管EIAs的敏感性受到標本儲存方式、運輸途徑等多種因素影響，但快速、簡單、價廉、設備技術要求不高等特點使其在臨床應用中具有獨特優(yōu)勢[16]。目前普遍認為EIAs是臨床應用頻率較高的檢測方法。

VIDAS CDAB檢測系統(tǒng)由法國BioMérieux公司研發(fā)，采用ELFA方法檢測毒素A、B[17-18]。VIDAS CDAB檢測系統(tǒng)技術成熟，性能穩(wěn)定，是一種定量檢測方法，15 min～2 h可報告結(jié)果，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，具有快速便捷、工作量少等優(yōu)點，但該檢測方法需要特殊儀器[19]。

1.2.2谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)的免疫學檢測 GDH是艱難梭菌表面大量表達的一種抗原性蛋白質(zhì)，數(shù)量多，穩(wěn)定性強，敏感性高，在各型艱難梭菌中具有高度保守性，因此GDH也為艱難梭菌檢測提供了一個方向。目前可采用膠體金免疫層析法、ELFA、EIAs等對GDH進行檢測。

德國Nadal公司研發(fā)的即用型檢測卡，即采用膠體金免疫層析法[20]，將稀釋后的樣本懸浮液在檢測卡上擴散，GDH與膠體金標記抗體反應，當移動至固定在硝酸纖維素膜上的抗體區(qū)域時，發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集，顯色，實現(xiàn)對GDH的目視化檢測。此外，還有采用ELFA的VidasC.difficileGDH Assay(法國BioMérieux公司)以及采用EIAs的Quik Chek-60(美國Techlab公司)[6,21]。

GDH檢測的優(yōu)越性不僅在于其廉價的成本、簡單快速的操作流程，還在于其高敏感性和較高的陰性預測值，然而，GDH并不是產(chǎn)毒性艱難梭菌所特有，非產(chǎn)毒性菌株以及梭菌屬其他細菌也可產(chǎn)生此酶，檢測特異性有待進一步提高，故不能單獨作為診斷方法，目前常用作篩查試驗[22]。

毒素和GDH檢測各有優(yōu)缺點，毒素檢測敏感性偏低，陽性預測值也不足以用于臨床診斷，而GDH檢測特異性偏低。在此基礎上研發(fā)出可同時檢測GDH和毒素A、B的試劑盒，例如C.difficileQuik Chek Complete(美國Techlab公司)、CERTESTClostridiumdifficileGDH+toxinA+B(法國Theradiag公司)、C.difficileGDH-toxins A-B(德國Orgentec公司)[15,23]，具有高敏感性和高準確性，可彌補單一方法的不足，且檢測周期短，無需其他檢測設備，可作為門、急診CDI的初篩試劑盒[19]。

1.3分子生物學檢測

1.3.1核酸擴增試驗(nucleic acid amplification tests, NAATs) 艱難梭菌致病性決定區(qū)(PaLoc)內(nèi)含有編碼毒素A和B的tcdA、tcdB基因，以及tcdR、tcdC及tcdE3種輔助基因。在致病性決定區(qū)外的二元毒素決定區(qū)(CdtLoc)內(nèi)則含有編碼二元毒素的cdtA和cdtB基因[6]。NAATs多是檢測毒素A、B及二元毒素的編碼基因。NAATs包括PCR、環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、依賴解螺旋酶恒溫擴增技術(helicase-dependent amplification, HDA)等，這些方法均是針對艱難梭菌的毒素基因進行檢測。

NAATs方法眾多，有采用PCR技術的BD GeneOhm、BD Max、ProDesse ProGastro Cd Assay、Cepheid GeneXpert C.difficile Assay等，采用LAMP技術的Meridian Illumigene等，以及采用HDA技術的Quidel AmpliVue C.difficile、Great Basin Portrait Analyzer等[6]。

這些技術一般先通過高溫或解旋酶將模板DNA變?yōu)閱捂?，再將引物與模板雜交，然后在聚合酶催化下延伸合成，反復循環(huán)，實現(xiàn)目的DNA的擴增。這幾種NAATs檢測方法雖然基本原理和操作過程等有所不同，但與免疫學檢測毒素和GDH相比，其敏感性、特異性更高，且可以快速獲取結(jié)果。雖然NAATs被認為優(yōu)于其他方法，但由于不能準確區(qū)分艱難梭菌的定植和感染，易導致對CDI的過度診斷和治療[12]，可能高估CDI發(fā)病率[24]，因此需要結(jié)合其他檢測方法以及臨床癥狀進行綜合判斷。

1.3.2分子分型 快速、準確的分子分型對艱難梭菌暴發(fā)流行的早期監(jiān)測和追蹤溯源具有重要意義。目前常用的分子分型方法包括限制性內(nèi)切酶分析分型(restriction endonuclease analysis typing, REA)、聚合酶鏈反應核糖體分型(polymerase chain reaction ribotypin, PCR RT)、脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、多位點序列分析(multilocus sequence typing, MLST)、重復序列PCR(repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction, rep-PCR)分型、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis, MLVA)和全基因組測序分析(whole-genome sequencing, WGS)等。

這些方法各有利弊，REA穩(wěn)定性好，PCR RT和PFGE分辨力強，但三者費時費力，且結(jié)果受實驗條件影響較大，不易推廣到各級醫(yī)院；MLST具有數(shù)字化優(yōu)勢，使不同實驗室之間的結(jié)果具有可比性，但較高的成本限制了MLST在臨床方面的應用；rep-PCR、MLVA和WGS分型能力強大，但前兩者較難進行室間數(shù)據(jù)交流，后者對生物信息分析能力要求較高，暫未被推薦常規(guī)使用[25]。隨著分子生物學技術不斷發(fā)展，艱難梭菌分子分型方法在分辨能力、可重復性、成本效益以及操作簡便程度上都會有更大的進步。依據(jù)艱難梭菌分子分型結(jié)果，能夠更快速地識別CDI暴發(fā)，更有效地制定CDI防控措施，更合理地指導臨床用藥。

1.4檢測策略——二步法成三步法 自艱難梭菌被發(fā)現(xiàn)以來，檢測該細菌的方法層出不窮，但每種方法都存在著優(yōu)缺點，不建議將任何一項檢測方法作為診斷CDI的獨立方法。綜合考慮各種方法的敏感性、特異性、費用、報告時間等因素，目前許多專家和一些指南支持采用二步法或三步法進行CDI診斷。歐洲臨床微生物學和傳染病學會更新的艱難梭菌感染診斷指南文件[23]中推薦二步法，即GDH 和毒素A/B EIAs同步聯(lián)合檢測，二者結(jié)果不一致時用NAATs或TC驗證。三步法先用GDH EIAs或NAATs初篩，陽性時進行毒素A/B EIAs試驗，若免疫學試驗陰性再用TC或NAATs確認[15]。2017年發(fā)表的我國成人艱難梭菌感染診斷和治療專家共識[26]推薦的實驗室診斷流程也基本如此，見圖1。相比其他常規(guī)檢測方法，二步法或三步法具有較高的敏感性、特異性和準確性，有助于減少NAATs引起的艱難梭菌過度診斷[27]，在整體效益上可明顯縮減醫(yī)療費用，有較大臨床應用前景。

目前用于CDI診斷的主要檢測方法的敏感性、特異性、費用、報告時間、檢測對象和應用評價的比較見表1。

注：A，艱難梭菌感染推薦檢測流程二步法；B，艱難梭菌感染推薦檢測流程三步法。1，我國成人艱難梭菌感染診斷和治療專家共識中推薦方法；2，歐洲臨床微生物學和傳染病學會更新的艱難梭菌感染診斷指南文件中推薦方法。

表1 目前用于CDI診斷的主要檢測方法

2 艱難梭菌實驗室診斷技術的發(fā)展

目前已有的艱難梭菌診斷技術存在一些不足，尋找更實用、更有效的實驗診斷方法仍是目前臨床面臨的一大難題。當前正研究一些新技術，未來有望應用于臨床。

2.1超高效液相色譜-質(zhì)譜法(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS)與代謝組學 UPLC-MS技術以超高效液相色譜作為分離系統(tǒng)，串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)。樣品在液相色譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)和電荷數(shù)的比值大小依次排列成譜記錄下來，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖，實現(xiàn)對復雜混合物準確的定量和定性分析。而物質(zhì)代謝是腸道菌群的重要功能， CDI伴隨著嚴重的腸道菌群紊亂，勢必引起腸道內(nèi)物質(zhì)代謝發(fā)生改變[28]。因此，研究人員嘗試利用UPLC-MS技術進行代謝組學綜合分析，以診斷CDI。雖然該方法存在儀器昂貴、操作和維護復雜、樣本通量有限等缺點，但分辨率高、敏感性高、特異性高、分析速度快，且進行代謝組學檢測性能穩(wěn)定，結(jié)果可靠，通過對相關代謝物及代謝通路進行深入分析，發(fā)現(xiàn)能反映機體代謝功能變化的“生物標志物群/譜”，可為研究CDI機制、篩查或治療提供一種新的思路[29]。

2.2拉曼光譜法(raman spectroscopy, RS) 樣品被激光產(chǎn)生的單色光照射，一些入射光子被透射或吸收，其他光子與樣品的分子相互作用后被散射；大多數(shù)散射光子具有與入射光子相同的能量，這種稱為彈性瑞利散射。發(fā)射的光子具有比入射光子更高或更低的能量，稱為非彈性散射。在106～108個光子中，只有約1個光子在光學頻率上與入射光子頻率不同(即非彈性散射)，產(chǎn)生拉曼光譜。拉曼光譜表明了分子中固有的振動、旋轉(zhuǎn)和其他低頻振動模式，被視為物質(zhì)的“指紋”，可用于確定待測物質(zhì)的性質(zhì)及成分[30]，已經(jīng)在疾病診斷和檢測等生物醫(yī)學領域顯示出潛在應用價值[31]。雖然這項技術有待完善，如研究對象是人為加入的毒素血清而非原始樣本，但快速、廉價、高特異性、高敏感性、無需標記等優(yōu)點使RS具有較大潛力，有望成為一種監(jiān)測患者體內(nèi)艱難梭菌毒素的床旁檢測工具[32]。

2.3單分子陣列(single-molecule array, Simoa)分析 研究表明，CDI嚴重程度與糞便中毒素水平相關，量化糞便中毒素對疾病預后和療效觀察具有一定價值[1]。Simoa技術的基本原理為包被于磁珠上的捕獲抗體與樣本中抗原結(jié)合，而后β-半乳糖苷酶標記的檢測抗體再與磁珠上的抗原結(jié)合，形成磁珠-抗原抗體復合物，將其轉(zhuǎn)導于單分子陣列微孔板上，保證每個微孔只含有1個復合物，檢測酶作用于底物產(chǎn)生熒光信號強度，從而獲得樣本抗原濃度，量化糞便中的毒素[33]。Simoa技術是一種數(shù)字化形式的ELISA，敏感性是ELISA方法的1 000倍[13]。目前，采用Simoa技術研究艱難梭菌還缺乏臨床大樣本的應用性研究，對低水平毒素的臨床意義還需探索(即定植與感染界限不明)，但是快速、廉價、高敏感性、高特異性、低樣本量、全自動化、高通量等優(yōu)點使國際上一直沒有間斷對其研究，這一技術有望促進CDI診斷。

3 結(jié)語

綜上所述，艱難梭菌常規(guī)檢測方法為微生物培養(yǎng)、免疫學檢測和分子生物學檢測，還有UPLC-MS、RS、Simoa等新技術在研發(fā)中。這些檢測方法均有利弊，應依據(jù)行業(yè)公認的檢測流程(二步法或三步法)嚴格操作，分層次、多渠道與臨床進行溝通交流，為臨床CDI診療提供實驗室依據(jù)。