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    總25-羥基維生素D磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析法的建立及性能評價(jià)*

    2020-10-13 03:23:28卜玲姚孝明張譽(yù)嚴(yán)韓霜李光
    臨床檢驗(yàn)雜志 2020年8期
    關(guān)鍵詞:生物素化學(xué)發(fā)光衍生物

    卜玲,姚孝明,張譽(yù)嚴(yán),韓霜,李光

    (1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬老年醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京210024;2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 江蘇省中醫(yī)藥研究院檢驗(yàn)科,南京210028;3. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫214122)

    維生素D是一種人體必需的脂溶性類固醇[1],具有生物惰性,必須經(jīng)過羥基化步驟去激活。在人體內(nèi),其存在2種形式:維生素D3和維生素D2。人體只能合成維生素D3,而維生素D2需要通過外界諸如食品、片劑等來補(bǔ)充。血清中總25-羥基維生素D(25-OH Vitamin D,25-OH VD)濃度為25-OH VD2和25-OH VD3的濃度之和[2-4]。因此,其血液濃度可用于評估總體維生素D的狀態(tài)。

    目前的25-OH VD檢測方法學(xué)以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和ELISA法為主。ELISA法易實(shí)現(xiàn)自動化操作,適合于在常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室開展,但對基質(zhì)敏感,容易與其他非目標(biāo)化合物發(fā)生交叉反應(yīng),降低檢測的特異性,且酶促反應(yīng)的結(jié)果受到反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及加樣準(zhǔn)確性等因素的影響[5-6],檢測速度相對較慢。LC-MS/MS被公認(rèn)為檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[7],也被作為其他檢測方法驗(yàn)證校對的參考依據(jù),具有非常高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性,但儀器昂貴、對操作人員專業(yè)度要求較高,且需要自行開發(fā)檢測方法。目前國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院沒有配備相關(guān)儀器和專業(yè)人員的能力,限制了LC-MS/MS法在臨床的應(yīng)用推廣。

    化學(xué)發(fā)光免疫分析是將發(fā)光反應(yīng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合,用來檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫檢測技術(shù)[8],具有穩(wěn)定性強(qiáng),重復(fù)性好,靈敏度高,特異性強(qiáng),檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)。因此本研究通過化學(xué)發(fā)光平臺,建立一種檢測25-OH VD的磁微?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法。

    1 材料與方法

    1.1主要儀器與試劑 MULTISKAN FC酶聯(lián)儀(美國賽默飛世爾公司);SMART 6500全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(重慶科斯邁公司)。比對試劑:25羥基維生素D檢測試劑盒[ELISA法,英國Immunodiagnostic Systems(IDS)公司]。

    1.2主要原材料 25-OH VD單克隆抗體(英國Bioventix公司),25-OH VD衍生物(廈門同仁心公司),25-OH VD抗原、過碘酸鈉、NHS-Biotin、EDC(美國Sigma公司),硼氫化鈉(上海麥克林公司),25-OH VD解離液(上海漢尊公司),鏈霉親和素磁微粒(美國GE公司),堿性磷酸酶(瑞士羅氏公司),3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)發(fā)光底物液(美國貝克曼公司)。

    1.3方法

    1.3.1實(shí)驗(yàn)流程與原理 用競爭法,首先用25-OH VD解離液90 μL將30 μL樣本中的25-OH VD從結(jié)合蛋白中解離,震蕩反應(yīng)90 min,形成游離態(tài)。與生物素化25-OH VD衍生物共同競爭結(jié)合堿性磷酸酶標(biāo)記的25-OH VD單克隆抗體,37 ℃反應(yīng)40 min后,再將生物素化25-OH VD衍生物結(jié)合至鏈霉親和素磁珠上,37 ℃反應(yīng)30 min后,形成抗體-抗原衍生物-磁珠的復(fù)合物,最后在電磁場中對標(biāo)記抗體-抗原衍生物-磁珠的復(fù)合物進(jìn)行分離洗滌,棄上清,用250 μL洗液洗滌3次后加入AMPPD發(fā)光劑200 μL,室溫避光放置20 min后,用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測發(fā)光強(qiáng)度,根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化測定25-OH VD濃度,競爭法中樣本濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈反比。

    1.3.225-OH VD校準(zhǔn)品的溯源 使用商品化的25-OH VD抗原純品作為原料配制校準(zhǔn)品(0 ng/mL、6.5 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL、100 ng/mL),對建立的方法進(jìn)行溯源。用SMART 6500全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行賦值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用校準(zhǔn)品配制成已知不同濃度的質(zhì)控標(biāo)本,進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證,并對常規(guī)標(biāo)本進(jìn)行檢測,驗(yàn)證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    1.3.3堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的制備 參考杜曄等[9]使用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法,并作如下改良:(1)將2 mg堿性磷酸酶溶于1 mL 0.1 mol/L pH 8.0的碳酸氫鈉緩沖液中;(2)加入500 μL 0.2 mol/L的過碘酸鈉并輕輕混勻,4 ℃避光反應(yīng)30 min;(3)加入1.5 mL 0.1 mol/L乙二醇,輕輕混勻后4 ℃避光反應(yīng)45 min,終止氧化反應(yīng);(4)加入1 mg抗體,再加入150 μL 0.5 mol/L pH 9.6的碳酸氫鈉緩沖液,在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸氫鈉緩沖液中4 ℃避光透析過夜;(5)加入1 mg NaBH4,4 ℃避光反應(yīng)2 h;(6)在0.01 mol/L pH 7.2 PBS溶液中4 ℃透析24 h;(7)取出透析物,在4 ℃、3 000×g條件下離心30 min取上清液,用蛋白質(zhì)濃度測定儀測定其蛋白質(zhì)濃度為1.1 mg/mL;(8)加入等體積甘油,-20 ℃避光保存。

    1.3.4生物素化25-OH VD衍生物的制備 (1)用無水二甲基甲酰胺(DMF)將NHS-Biotin溶解至1 mg/mL,分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆茫?2)取500 μL 2 mg/mL的25-OH VD衍生物溶液,加入5倍于25-OH VD衍生物物質(zhì)的量的NHS-Biotin(1 mg/mL),并用0.5 mol/L pH 9.6的碳酸氫鈉緩沖液將反應(yīng)總體積補(bǔ)足至1 mL,室溫反應(yīng)1 h;(3)在0.1 mol/L PBS緩沖液透析中4 ℃透析24 h;(4)取出透析物,用蛋白質(zhì)濃度測定儀測定其蛋白質(zhì)濃度為5.8 mg/mL;(5)加入等體積甘油,-20 ℃避光保存。

    1.3.5試劑最佳工作濃度 用棋盤滴定法,將標(biāo)記抗體稀釋為1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL和6.0 μg/mL 4個濃度,將生物素化25-OH VD衍生物稀釋為25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL 3個濃度,分別交叉測試。用25-OH VD純品,配制0濃度樣本(S0)和91.5 ng/mL的高值樣本(S1)進(jìn)行篩選。

    2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

    2.1校準(zhǔn)品的賦值 根據(jù)ELISA法已知的線性范圍,配制校準(zhǔn)品濃度為0 ng/mL、6.5 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL、100 ng/mL,經(jīng)賦值后的校準(zhǔn)曲線見圖1。

    2.2試劑最佳工作濃度的確定 當(dāng)S1與S0的信號值之比(抑制率)小于10%,說明該組試劑濃度下的樣品可以拉開較大梯度。當(dāng)標(biāo)記抗體濃度為1.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物濃度為25 ng/mL,標(biāo)記抗體濃度為2.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物濃度為25 ng/mL,標(biāo)記抗體濃度為1.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物濃度為50 ng/mL,標(biāo)記抗體濃度為2.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物濃度為50 ng/mL時,S1與S0的信號值之比(抑制率)小于10%。同時,標(biāo)記抗體濃度為2.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物濃度為50 ng/mL時S1與S0的信號值的絕對值又大于抑制率小于10%的另外3組,樣品之間有更寬的信號空間,故選擇該組試劑濃度為最佳工作濃度。見表1。

    圖1 25-OH VD校準(zhǔn)曲線

    表1 25-OH VD試劑最佳工作濃度確定

    2.3性能驗(yàn)證

    2.3.1準(zhǔn)確度 用25-OH VD純品配制高值98.75 ng/mL和低值3.17 ng/mL 2個濃度的檢測樣本,進(jìn)行連續(xù)測定,每天對高水平和低水平樣本進(jìn)行3次重復(fù)測定,連續(xù)測定5 d。分別取測試結(jié)果均值,計(jì)算相對偏差。結(jié)果顯示,相對偏差分別為-2.09%、-0.63%,均在±10%范圍內(nèi),證明建立的方法準(zhǔn)確度符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

    2.3.3線性試驗(yàn) 根據(jù)NCCLS EP6-A2文件[11],用25-OH VD純品配制高值98.75 ng/mL和低值3.17 ng/mL 2個濃度的檢測樣本,按體積比1∶5、2∶4、3∶3、4∶2、5∶1混合成5個濃度梯度,作為預(yù)測值。將每個濃度樣本重復(fù)測定3次,計(jì)算其平均值作為實(shí)測濃度,將平均值(X)和預(yù)測值(Y)作線性回歸分析。建立的方法在3.17~98.75 ng/mL內(nèi)實(shí)測值與預(yù)測值之間線性關(guān)系良好(Y=0.975 8X+0.517 7,r2=0.999 9)。見表2。

    表2 25-OH VD線性試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.4干擾試驗(yàn) 根據(jù)CLSI EP7-A2[12]文件實(shí)驗(yàn)方案,將配制好的同稀釋濃度干擾測試樣本重復(fù)檢測2次,用低、中、高3個濃度水平的樣本作為基礎(chǔ)樣本,將每個基礎(chǔ)樣本分為5份,其中一份加入不含干擾物的樣本稀釋液為對照樣本,另外4份中加入等體積的不同濃度干擾物質(zhì)作為分析樣本,每份樣本重復(fù)測定3次取平均值,計(jì)算干擾率。干擾率=(分析樣本測定濃度平均值-基礎(chǔ)樣本測定濃度平均值)/基礎(chǔ)樣本測定濃度平均值×100%。計(jì)算添加干擾物后與無干擾物時的干擾效應(yīng),以偏倚≤10%為判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示,當(dāng)生物素濃度為250 nmol/L、三酰甘油濃度為1 500 mg/dL、血紅蛋白濃度為1 500 mg/dL、膽紅素濃度為200 mg/dL時,干擾率均小于8%,說明本方法的抗干擾能力較強(qiáng)。見表3。

    表3 25-OH VD干擾試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.5穩(wěn)定性 將生物素化25-OH VD衍生物-20 ℃避光保存,堿性磷酸酶標(biāo)記的25-OH VD單克隆抗體4 ℃避光保存,3個濃度的檢測樣本(濃度分別為6.5 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL)-20 ℃保存。首次測定后,分別于7、14、21、30 d進(jìn)行測定,每個樣品重復(fù)測定3次,求得平均值。以首次測定結(jié)果(0 d)為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算穩(wěn)定性,以90%~110%作為試劑穩(wěn)定的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。25-OH VD化學(xué)發(fā)光法檢測試劑在4 ℃條件下21 d內(nèi)穩(wěn)定性均在90%~110%內(nèi),具有較好的穩(wěn)定性,21 d后25-OH VD穩(wěn)定性明顯下降。見表4。

    表4 25-OH VD穩(wěn)定性(%)

    2.3.6準(zhǔn)確度方法學(xué)比對 根據(jù)NCCLS EP9-A2[13]文件實(shí)驗(yàn)方案,由江蘇省省級機(jī)關(guān)醫(yī)院提供200例臨床樣本,同時使用比對方法(ELISA法)和建立的方法進(jìn)行測定,以ELISA法所測結(jié)果為X軸,本文方法所測結(jié)果為Y軸,進(jìn)行回歸分析?;貧w方程為Y=1.006 2X-0.166 3,r2=0.9792。對截距a和斜率b分別作t檢驗(yàn),由200例樣本數(shù)查得95%置信區(qū)間t0.05/2=1.972,ta=-0.3542<1.972,說明截距a無限接近于0,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;tb=94.310 7>1.972,說明斜率b不等于0,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明兩者的測定結(jié)果有良好的一致性。

    3 討論

    維生素D是人體必須的脂溶性維生素。在兒童中,嚴(yán)重缺乏會導(dǎo)致佝僂??;在中老年人中,缺乏維生素D會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,易引發(fā)骨折等問題。此外,有研究表明,25-OH VD還與糖尿病、癌癥、心血管疾病和自身免疫性疾病有關(guān)[14-16],大劑量補(bǔ)充維生素D的維生素D匱乏人群來說,更需要定期監(jiān)測體內(nèi)25-OH VD的含量以防過量導(dǎo)致中毒[17],因此準(zhǔn)確監(jiān)測25-OH VD的總量至關(guān)重要。

    本文建立的方法采用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,且使用生物素-鏈霉親和素信號放大體系,使25-OH VD的測定更便捷、快速,靈敏度更高。本研究對準(zhǔn)確度、精密度、線性、干擾、穩(wěn)定性和方法學(xué)比對進(jìn)行了系統(tǒng)研究。其中,準(zhǔn)確度偏差和批內(nèi)、批間精密度均小于10%,滿足臨床需求,具有較好的重現(xiàn)性及可靠性;在3.17~98.75 ng/mL之間測量值與靶值之間線性良好;在生物素濃度不大于250 nmol/L、三酰甘油濃度不大于1 500 mg/dL、血紅蛋白濃度不大于1 500 mg/dL、膽紅素濃度不大于200 mg/dL等干擾下,不產(chǎn)生明顯干擾作用。研究表明,分別用ELISA法和金標(biāo)準(zhǔn)LC-MS/MS法進(jìn)行25-OH VD的方法比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC-MS/MS法測定的25-OH VD數(shù)值明顯低于ELISA法,表明ELISA法低估了體內(nèi)維生素D的缺乏,但保證嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)條件下,ELISA法可作為篩查25-OH VD的方法,且ELISA法與LC-MS/MS法具有較好的相關(guān)性,可經(jīng)公式方程互換[18]。鑒于ELISA法在常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛使用,因此,我們將本文建立的方法與英國IDS公司開發(fā)的25-OH VD檢測試劑盒(ELISA法)同時測定200例臨床樣本,比對結(jié)果表明2種方法結(jié)果具有較好的相關(guān)性。磁微?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法具有穩(wěn)定性強(qiáng),重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),克服了ELISA法結(jié)果受反應(yīng)溫度、反時間及加樣等因素影響的缺陷,并且省時、快速。

    綜上所述,本研究建立的25-OH VD磁微?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法可應(yīng)用于臨床定量檢測人血清中25-OH VD的含量,其準(zhǔn)確度、精密度、線性、抗干擾能力以及穩(wěn)定性均滿足臨床要求。

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