天麻素注射液對(duì)大鼠缺血性腦卒中后癲癇發(fā)作及神經(jīng)保護(hù)作用的影響

郭迎樹(shù)

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病介入科，鄭州 450000)

缺血性腦卒中(cerebral arterial thrombosis)是由于腦動(dòng)脈狹窄或堵塞、腦組織供血不足而引起的腦組織壞死的疾病總稱，包括短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack，TIA)、可逆性缺血性神經(jīng)功能缺失(reversible ischemic neurologicdeficit，RIND)、進(jìn)展性腦卒中(progressive stroke，PS)、完全性腦卒中(complete stroke，CS)[1-2]。缺血性腦卒中后可因腦組織缺血缺氧，無(wú)法供給能量，使鈉離子大量?jī)?nèi)流，細(xì)胞膜出現(xiàn)過(guò)度去極化，導(dǎo)致腦部癲性放電，引起癲癇發(fā)作[3-4]。癲癇(epilepsy，EP)是以腦部神經(jīng)元異常放電而引起反復(fù)癇性發(fā)作的慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征。癲癇的長(zhǎng)期發(fā)作可導(dǎo)致腦部物質(zhì)發(fā)生改變，易引起腦水腫及腦部神經(jīng)細(xì)胞的損害，甚至是神經(jīng)細(xì)胞的死亡[5]。本研究旨在探討天麻素注射液對(duì)大鼠缺血性腦卒中后癲癇發(fā)作及神經(jīng)保護(hù)作用的影響，為臨床提供參考。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

60只健康成年雄性SD大鼠[合格證號(hào)：SCXK(滬)20130016]：南京君科生物工程有限公司，SPF級(jí)，貨號(hào)J001，體重(320.43±21.36) g，自由飲食、飲水和活動(dòng)。

1.2 試劑

氯化鋰(美國(guó)Amresco公司，貨號(hào)0416，規(guī)格：5 g)；匹羅卡品(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)P650，規(guī)格：1G)；地西泮注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020957，規(guī)格：2 ml*10 mg)；天麻素注射液(昆藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20013046，規(guī)格：2 ml*6支)；0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20056626，規(guī)格：100 ml)；水合氯醛溶液(青島宇龍海藻有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673，規(guī)格：500 g)；4%多聚甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)P1110，規(guī)格：100 ml)；磷酸緩沖鹽溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)PB180327，規(guī)格：500 ml)；OCT包埋劑(美國(guó)Lycra公司，貨號(hào)4853，規(guī)格：118 ml)；牛血清白蛋白(BSA，北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)A8010，規(guī)格：5 g)；2×蛋白上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)P1018，規(guī)格：10 ml)；1×TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)T1085，規(guī)格：500 ml)；1×PBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)P1031，規(guī)格：500 ml)；過(guò)氧化氫溶液(廣東恒建制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44023919，規(guī)格：100 ml)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)P0018，規(guī)格：500 ml)；BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)P0012S，規(guī)格：200次)；兔抗半胱氨酸蛋白酶-3 (cysteine proteinase-3，Caspase-3)多克隆抗體(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)YT691-QRP)；小鼠抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)單克隆抗體(LSBio公司，貨號(hào)LS-C204627)；兔抗p38多克隆抗體(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)C1811)；小超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)PV-9002，規(guī)格：3 ml)；辣根過(guò)氧化酶(horseradish，HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(美國(guó)Abbkine公司，貨號(hào)A21020)；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(美國(guó)Abbkine公司，貨號(hào)A21010)；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)PA110)；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)A0516)；Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)A0521)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)A0562)；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)A0568)；兔抗神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron specific nucleoprotein，NeuN)IgG(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab177487)；小鼠抗NeuN IgG(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab104224)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)染色液(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)D9542，規(guī)格：5 mg)。

1.3 儀器

96孔板(美國(guó)Corning公司，貨號(hào)2499)；垂直電泳系統(tǒng)(英國(guó)Cleaver公司，型號(hào)OmniPAGE Maxi)；冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司，型號(hào)CM3050S)；勻漿機(jī)(瑞士Kinematica公司，型號(hào)PT2500E)；酶標(biāo)儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司，型號(hào)PT-3502G)。

1.4 分組及處理

按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、缺血性腦卒中后癲癇發(fā)作組(模型組)、低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組大鼠均為12只，分別編號(hào)1～12號(hào)。低劑量組給予60 mg/kg天麻素注射液預(yù)處理、中劑量組給予90 mg/kg天麻素注射液預(yù)處理、高劑量組給予120 mg/kg天麻素注射液預(yù)處理，對(duì)照組與模型組給予相同劑量的0.9%氯化鈉注射液。除對(duì)照組外，其余4組給予127 mg/kg氯化鋰腹腔注射，18 h后給予30 mg/kg匹羅卡品腹腔注射，對(duì)照組給予相同劑量的0.9%氯化鈉注射液，此期間嚴(yán)密觀察小鼠癲癇發(fā)作情況，正常飲食，常規(guī)護(hù)理，于癲癇發(fā)作后2 h給予地西泮注射液終止發(fā)作，于癲癇發(fā)作3 h后取材。

1.5 大鼠行為學(xué)觀測(cè)

大鼠癲癇發(fā)作評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(Racine分級(jí))[6]：① 0級(jí)：無(wú)任何反應(yīng)。② Ⅰ級(jí)：面部陣攣，出現(xiàn)眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼、濕狗樣抖動(dòng)等表現(xiàn)。③ Ⅱ級(jí)：Ⅰ級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律性點(diǎn)頭和(或)甩頭。④ Ⅲ級(jí)：Ⅱ級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢陣攣。⑤ Ⅳ級(jí)：Ⅲ級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)后肢站立。⑥ Ⅴ級(jí)：Ⅳ級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)雙側(cè)前后肢強(qiáng)直、身體背屈強(qiáng)直、跌倒、持續(xù)站立和傾倒、失去平衡、四肢抽動(dòng)。

1.6 取材

癲癇發(fā)作后3 h，10%水合氯醛0.3 g/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，每組1～6號(hào)大鼠給予0.9%氯化鈉注射液心臟灌注，直至流出液為澄清液體，快速將大鼠頭部切斷，取出腦組織，分離大鼠的大腦皮質(zhì)，勻漿后放置于80 ℃的超低溫冰箱中備用，進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)。每組7～12號(hào)大鼠給予0.9%氯化鈉注射液心臟灌注，直至流出液為澄清液體；再用4%多聚甲醛200 ml灌注固定，快速將大鼠頭部切斷；取出腦組織，將腦組織置于含4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中保存24 h，然后分別在30%、20%、10%蔗糖脫水；腦組織下沉后，置于OCT包埋劑固定，取 15 μm 厚的大腦皮質(zhì)部位冠狀冰凍切片，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理后的載玻片上，置于20 ℃的冰箱中備用，進(jìn)行免疫組化染色及免疫熒光染色。

1.7 BCA蛋白濃度測(cè)定

將BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒中的試劑A與試劑B按50∶1的比例混合均勻，至液體顏色變?yōu)槟劬G色。用BSA分別配制0、62.5、125、250、500、1000、2000 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。96孔板中每孔均加入200 μl工作液，待測(cè)樣品20 μl，每孔液體振蕩并混合均勻，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。利用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度(A562nm)，根據(jù)軟件計(jì)算樣品的濃度值及上樣量。

1.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

將2×蛋白上樣緩沖液加入樣品中，煮沸 5 min，然后按照每孔100 μg的蛋白量上樣。將標(biāo)本置于12%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓為74 V，分離膠電壓為100 V，當(dāng)標(biāo)記物接近膠底板時(shí)停止電泳。轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，恒流轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，室溫下置于搖床上搖晃2 h后，按照 1∶1000 的比例加入小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗Caspase-3多克隆抗體和兔抗p38多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜；次日用1×TBST緩沖液漂洗3次，每次 10 min，按照1∶2000的比例加入相應(yīng)HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，室溫下置于搖床中輕搖孵育1 h；用1×TBST緩沖液漂洗4次，每次15 min，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，室溫下反應(yīng)3 min，進(jìn)行暗室曝光、顯影和定影，并掃描條帶，運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行分析。

將2×蛋白上樣緩沖液加入樣品中，煮沸 5 min，然后按照每孔100 μg的蛋白量上樣。將標(biāo)本置于12%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓為74 V，分離膠電壓為100 V，當(dāng)標(biāo)記物接近膠底板時(shí)停止電泳。轉(zhuǎn)印至PVDF膜，恒流轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，室溫下置于搖床上搖晃2 h后，按照1∶1000的比例加入兔抗p38多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜；次日用1×TBST緩沖液漂洗3次，每次 10 min，按照1∶2000的比例加入相應(yīng)HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，室溫下置于搖床中輕搖孵育1 h；用1×TBST緩沖液漂洗4次，每次15 min，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，室溫下反應(yīng)3 min，進(jìn)行暗室曝光、顯影和定影，并掃描條帶，運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.9 免疫組化染色

每組隨機(jī)抽取一張切片，在PBS溶液中漂洗3次，每次10 min，然后加入0.3%過(guò)氧化氫溶液反應(yīng)10 min，以殺滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；用1×PBST緩沖液漂洗3次，每次5 min，用10%山羊血清室溫下封閉2 h；甩去多余液體，按照1∶1000加入小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體和兔抗Caspase-3多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜；次日復(fù)溫30 min后，用1×PBST緩沖液漂洗3次，每次10 min，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，并用小鼠超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，陰性對(duì)照用PBS溶液代替一抗；顯微鏡下控制DAB顯色，放入蒸餾水中終止反應(yīng)，分別用85%、95%、100%的酒精梯度脫水，以二甲苯脫脂和透明，中性樹(shù)膠封片；在同一條件，利用顯微鏡觀察并拍片，結(jié)果運(yùn)用Image prupro 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)取3個(gè)值的平均值。

1.10 免疫熒光染色

每組隨機(jī)抽取一張切片，在PBS溶液中漂洗4次，每次10 min，然后用10%山羊血清室溫下封閉 2 h；按照1∶1000的比例加入小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體與兔抗NeuN IgG、兔抗Caspase-3多克隆抗體與小鼠抗NeuN IgG孵育2 h；用1×PBST緩沖液漂洗4次，每次10 min，按照1∶2000的比例加入相應(yīng)的Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)與FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)與FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)孵育2 h；用 1×PBST緩沖液漂洗4次，每次10 min，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，室溫下反應(yīng)5 min，再用1×PBST緩沖液漂洗3次，每次5 min；在同一條件，利用顯微鏡觀察并拍片，結(jié)果運(yùn)用Image prupro 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)取3個(gè)值的平均值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；有序分類變量資料采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀測(cè)

對(duì)照組無(wú)癲癇發(fā)作；腹腔注射匹羅卡品后，模型組大鼠5 min后出現(xiàn)淚腺分泌增加、骨骼肌收縮等膽堿能興奮反應(yīng)，且低劑量組發(fā)作潛伏期[(28.64±4.75) min]、中劑量組發(fā)作潛伏期[(32.25±5.21) min]及高劑量組發(fā)作潛伏期[(29.36±4.52) min]具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2 大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2與Caspase-3含量

癲癇發(fā)作72 h后，模型組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2含量高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2含量高于模型組，Caspase-3含量低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組圖1 大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2與Caspase-3含量

2.3 大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2與Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量

低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量高于模型組，且中劑量組高于低劑量組、高劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量低于模型組，且中劑量組低于低劑量組、高劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠大腦皮層中Bcl-2與Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量 個(gè)/mm2

2.4 大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2與Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2表達(dá)高于模型組，且中劑量組高于低劑量組、高劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Caspase-3表達(dá)低于模型組，且中劑量組低于低劑量組、高劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2與Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 個(gè)/mm2

2.5 天麻素注射液對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)中p38的影響

模型組大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組圖2 大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性變化

3 討論

缺血性腦卒中是臨床上常見(jiàn)的腦外科疾病，隨著人口老齡化的進(jìn)展，缺血性腦卒中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[7]。癲癇病因較為復(fù)雜，主要分為三類，包括特發(fā)性癲癇、癥狀性癲癇和隱源性癲癇[8-9]。有研究表明[10]，缺血性腦卒中后癲癇發(fā)作存在兩個(gè)高峰期，即缺血性腦卒中后24 h和梗死后6個(gè)月～1年內(nèi)。目前，癲癇主要以藥物治療為主。有研究表明[11]，仍有10%～15%的患者對(duì)藥物治療不敏感，需要進(jìn)行外科治療。

天麻屬多年生草本植物，根莖入藥可治療頭暈、肢體麻木及小兒驚厥等，與靈芝合用可治療頭痛、失眠。天麻素為天麻的有效成分，具有較高的藥用價(jià)值[12-13]。p38蛋白激酶屬應(yīng)激激活的蛋白激酶，主要存在于腺體組織。與體內(nèi)凋亡啟動(dòng)、細(xì)胞周期靜止有密切關(guān)系，p38蛋白激酶對(duì)于不同腫瘤細(xì)胞作用不同[14]。有研究表明[15]，天麻素通過(guò)下調(diào)大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性，減輕由興奮性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)引起的興奮性毒性作用。本研究表明，模型組大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性高于對(duì)照組；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性低于模型組，說(shuō)明天麻素對(duì)p38蛋白激酶具有調(diào)控作用，使大鼠體內(nèi)p38水平下調(diào)。

Bcl-2是一種原癌基因，可抑制由多種細(xì)胞毒因素引起的細(xì)胞死亡。體內(nèi)Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒素的抵抗力。Caspase-3是一種蛋白酶，為細(xì)胞凋亡中主要的終末剪切酶，并且為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)殺傷機(jī)制的重要組成部分[16]。Caspase-3底物中最重要的底物為多聚ADP-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose Polymerase，PARP)。PARP與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger)與羧基端的催化區(qū)域分離，使體內(nèi)鈣/鎂依賴性核酸內(nèi)切酶(endonuclease)活性增高，裂解核小體(nucleosome)間的DNA，引起細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示，低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量高于模型組，且中劑量組高于低劑量組、高劑量組；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量低于模型組，且中劑量組低于低劑量組、高劑量組；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2表達(dá)高于模型組，且中劑量組高于低劑量組、高劑量組；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Caspase-3表達(dá)低于模型組，且中劑量組低于低劑量組、高劑量組，說(shuō)明天麻素可增加癲癇發(fā)作大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2蛋白表達(dá)，并降低Caspase-3蛋白表達(dá)，抑制體內(nèi)癲癇凋亡的發(fā)生，具有保護(hù)大腦的作用。

綜上，天麻素注射液可抑制缺血性腦卒中癲癇發(fā)作大鼠大腦皮質(zhì)中促凋亡因子水平，增加抗凋亡因子水平，且可降低體內(nèi)p38蛋白激酶水平，具有保護(hù)腦部神經(jīng)作用，安全性較好，具有臨床參考價(jià)值。