HPLC-MS/MS法對(duì)琯溪蜜柚中吡唑醚菌酯殘留的測(cè)定及套袋對(duì)殘留量的影響

蔡恩興

漳州市農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心，福建 漳州 363000

吡唑醚菌酯是一種新型甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(由曉和井樂(lè)剛，2015)，因其殺菌譜廣、殺菌活性高、內(nèi)吸性強(qiáng)(張梅鳳和呂秀亭，2012)，對(duì)植物病害有較好的防治效果(楊麗娟和柏亞羅，2012)?，g溪蜜柚Citrusmaxima(Burm.) Merr. cv. Guanxiyou是福建平和的主要經(jīng)濟(jì)作物，經(jīng)濟(jì)效益較高。近年來(lái)，隨著蜜柚種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大及單一化種植，蜜柚上的病害發(fā)生也日益突出，影響到蜜柚的品質(zhì)和產(chǎn)量。吡唑醚菌酯作為蜜柚病害防治的主要農(nóng)藥品種之一，被當(dāng)?shù)毓r(nóng)廣泛使用。

目前對(duì)吡唑醚菌酯的檢測(cè)方法和殘留代謝的研究主要集中在葡萄(李瑞娟等，2010)、杧果(劉艷萍等，2016)、蘋果(蘭豐等，2018)、辣椒(高志文等，2011)、鐵皮石斛(許振嵐等，2018)、花生(Zhangetal.，2012)、草莓(楊霄鴻等，2018)、香蕉(趙方方等，2015)等作物上，對(duì)蜜柚等柑橘類水果的研究報(bào)道較少。劉軍等(2014)、李福琴等(2017)分別建立了檢測(cè)柑橘中吡唑醚菌酯殘留量的方法，Lesueuretal.(2008)采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)方法測(cè)定檸檬中吡唑醚菌酯等多種農(nóng)藥殘留，但是當(dāng)前尚沒(méi)有吡唑醚菌酯在蜜柚上的殘留檢測(cè)方法及殘留動(dòng)態(tài)相關(guān)研究的報(bào)道。

水果套袋因具有減少病蟲(chóng)害(王建武等，2003)、提高果實(shí)品質(zhì)(劉建海等，2003；藺經(jīng)等，2009)、降低農(nóng)藥殘留(陳合等，2006；劉蕾慶等，2011)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛推行。然而套袋對(duì)吡唑醚菌酯在蜜柚中的殘留影響并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)試驗(yàn)，確立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)快速檢測(cè)方法，對(duì)吡唑醚菌酯在蜜柚上的殘留動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析，同時(shí)研究套袋和無(wú)套袋2種處理對(duì)蜜柚中吡唑醚菌酯殘留量的影響，旨在明晰吡唑醚菌酯使用的安全性及套袋對(duì)農(nóng)藥殘留及其消解規(guī)律的影響，為果農(nóng)合理使用農(nóng)藥及蜜柚產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

供試作物：琯溪蜜柚。

試驗(yàn)材料：250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油；吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度 99.4%，沈陽(yáng)化工研究院)；乙腈、甲醇、甲酸(均為色譜純)；無(wú)水MgSO4、NaCl(均為分析純)；N-丙基乙二胺(PSA，德國(guó)CNW)。

儀器設(shè)備：T-18 basic ULTRA TURRAX 高速勻漿機(jī)(IKA，德國(guó))；3-18K高速離心機(jī)(Sigma，德國(guó))；DIONEX Ultimate 3000-Thermo TSQ Quantum Ultra EMR高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(ThermoFisher，美國(guó))。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)于漳州市平和縣小溪鎮(zhèn)厝丘村蜜柚園中進(jìn)行。參照NY/T 788—2004(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2004)設(shè)計(jì)田間試驗(yàn)，試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：2種施藥劑量(表1)，施藥后設(shè)套袋和無(wú)套袋2種處理。每處理重復(fù)3次，每個(gè)處理選取6株蜜柚；設(shè)清水噴霧的無(wú)套袋處理為空白對(duì)照(CK)。

表1 吡唑醚菌酯在蜜柚上的施藥及套袋處理Table 1 Spraying and bagging treatments of pyraclostrobin in C. maxima 'Guanxi miyou'

2018年7月8日，按常規(guī)方法對(duì)蜜柚整株進(jìn)行均勻噴施農(nóng)藥(此時(shí)蜜柚已謝花約90 d)，采用1次施藥多次采樣的方法，施藥后2 d內(nèi)無(wú)降雨過(guò)程。施藥后待蜜柚果實(shí)表面的藥液完全干燥才進(jìn)行套袋處理。采樣時(shí)間分別為施藥后約2 h(0 d，此時(shí)果實(shí)表面藥液已干)，1、3、7、15和30 d；取距地面約1.4 m處樹(shù)體中部位置，隨機(jī)對(duì)稱各采摘一個(gè)果實(shí)。采摘的蜜柚封裝于塑料袋中，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室用勻漿機(jī)勻漿后分裝入潔凈容器中冷凍保存，并進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 分析方法

1.3.1 提取與凈化 參考蔡恩興(2017)建立的QuEChERS方法：稱取攪碎均勻的蜜柚全果樣品10 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈、4.0 g無(wú)水MgSO4和1.0 g NaCl，用高速勻漿機(jī)勻漿2 min，4500 r·min-1離心5 min，取上清液2.0 mL轉(zhuǎn)移至裝有0.10 g PSA和0.30 g無(wú)水MgSO4離心管中，渦旋1 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜供HPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.3.2 檢測(cè)條件 色譜柱：Atlantis T3 Column(100 mm×2.1 mm×3 μm)；流動(dòng)相A為0.1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇；流速0.25 mL·min-1；進(jìn)樣量為2 μL；保留時(shí)間為6.55 min；流動(dòng)相采用梯度洗脫，具體見(jiàn)表2。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子源(ESI+)；離子噴霧電壓4000 V；霧化溫度270 ℃；鞘氣(N2)流速為3.62 L·min-1，輔助氣(N2)流速為5.38 L·min-1，碰撞氣(Ar)0.2 Pa。

表2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇電離(ESI+)模式，通過(guò)定量環(huán)進(jìn)樣對(duì)吡唑醚菌酯質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)全掃描確定388 m·z-1為其母離子，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM模式)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜自動(dòng)優(yōu)化，分析其質(zhì)譜圖及碰撞能量，最終確定吡唑醚菌酯的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)(表3)。

表3 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 3 Parameters of mass spectrometry

2.2 線性關(guān)系和檢出限

前處理采用QuEChERS方法，用提取凈化得到的空白蜜柚基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液并進(jìn)樣分析，以吡唑醚菌酯色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吡唑醚菌酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=60533x+148670，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9993，表明在1～500 μg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，以3和10倍信噪比計(jì)算檢出限和定量限，吡唑醚菌酯的檢出限和定量限分別為0.7和2 μg·kg-1。圖1為蜜柚中吡唑醚菌酯的SRM色譜圖。

圖1 蜜柚中吡唑醚菌酯的SRM色譜圖Fig.1 SRM chromatogram of pyraclostrobin in C. maxima 'Guanxi miyou'

2.3 添加回收試驗(yàn)

稱取蜜柚空白樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，分別加入3個(gè)水平(2、50和1000 μg·kg-1)的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)水平重復(fù)5次。按上述方法進(jìn)行前處理和上機(jī)測(cè)定，試驗(yàn)平均回收率為83.8%～105.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～9.1%，由此表明，該方法測(cè)定吡唑醚菌酯殘留準(zhǔn)確度和精密度均較好，符合農(nóng)藥殘留分析的要求(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2004)。

2.4 殘留動(dòng)態(tài)及消解規(guī)律

2.4.1 殘留動(dòng)態(tài) 對(duì)吡唑醚菌酯在蜜柚中的殘留動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析測(cè)定(表4)，2種施藥劑量處理的原始沉積量存在一定差異，推薦劑量(2000倍液)處理在蜜柚上的原始沉積量為0.5619～0.5952 mg·kg-1，而加倍劑量(1000倍液)處理為1.0732～1.1586 mg·kg-1。

在施藥后1、3、7、15和30 d分別進(jìn)行采樣檢測(cè)，套袋處理的消解率分別為27.1%～27.3%、45.3%～50.8%、71.8%、90.1%～91.9%和98.3%～98.4%，而無(wú)套袋處理的消解率分別為14.4%～16.9%、47.0%～54.1%、73.5%～80.0%、91.2%～93.6%和98.8%～99.0%。在同樣的施藥劑量和采摘時(shí)間下，套袋處理的消解率略低于無(wú)套袋處理(1 d的結(jié)果反過(guò)來(lái))，但在施藥后30 d，4種處理的消解率均大于98%，最終趨于一致。

表4 吡唑醚菌酯在蜜柚中的殘留消解動(dòng)態(tài)Table 4 Residual degradation dynamics of pyraclostrobin in C. maxima 'Guanxi miyou'

2.4.2 消解動(dòng)態(tài)及最終殘留 經(jīng)過(guò)回歸分析，吡唑醚菌酯的殘留消解動(dòng)態(tài)(表5)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。套袋處理的半衰期(T1/2)為5.10～5.26 d，消解99%所需要的時(shí)間(T0.99)為33.8～34.9 d；無(wú)套袋處理的T1/2為4.48～4.79 d，T0.99為29.7～31.8 d。相同施藥劑量，套袋處理的半衰期略長(zhǎng)于無(wú)套袋的半衰期。吡唑醚菌酯在蜜柚中的4種處理，相關(guān)系數(shù)(r)在0.9918～0.9957之間，消解系數(shù)(k)在0.1317～0.1546之間，說(shuō)明吡唑醚菌酯在蜜柚上半衰期相對(duì)較短。施藥后65 d(此時(shí)蜜柚已成熟)測(cè)定吡唑醚菌酯的最終殘留量，結(jié)果(表5)顯示4種不同處理均未檢出吡唑醚菌酯殘留。

表5 吡唑醚菌酯在蜜柚中的消解動(dòng)態(tài)方程Table 5 Degradation dynamics equation of pyraclostrobin in C. maxima 'Guanxi miyou'

3 討論

本試驗(yàn)建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定蜜柚中吡唑醚菌酯殘留量分析方法，其中樣品前處理采用QuEChERS方法，同時(shí)優(yōu)化了HPLC-MS/MS的相關(guān)參數(shù)。該分析方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度較高，檢出限為0.7 μg·kg-1，定量限為2 μg·kg-1，添加回收率為83.8%～105.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～9.1%，適用于蜜柚中吡唑醚菌酯的殘留測(cè)定。

吡唑醚菌酯在蜜柚中的殘留消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，套袋處理的消解半衰期為5.10～5.26 d，無(wú)套袋處理的消解半衰期為4.48～4.79 d；相同施藥劑量下，套袋處理的半衰期略長(zhǎng)于無(wú)套袋的半衰期，這可能與套袋后可以減少果實(shí)受外界環(huán)境影響有關(guān)，如光照、雨淋等(王建武等，2003)，減緩農(nóng)藥的殘留消解。吡唑醚菌酯在葡萄(李瑞娟等，2010)、辣椒(高志文等，2011)、草莓(楊霄鴻等，2018)和杧果(劉艷萍等，2016)植株中的殘留消解半衰期分別為2.9～4.7、3.7～3.8、5.2～10.8和8.0～11.0 d，而在蘋果(蘭豐等，2018)、香蕉(趙方方等，2015)和鐵皮石斛(許振嵐等，2018)中的消解半衰期則較長(zhǎng)，分別為13.5～23.6、16.7～17.2和38.1 d，這說(shuō)明在不同植株間吡唑醚菌酯殘留消解存在差異，上述植株除鐵皮石斛外，其他消解半衰期均小于30 d。

GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等，2019)規(guī)定吡唑醚菌酯在蜜柚上的最大殘留限量(maximum residue limit, MRL)為2 mg·kg-1，按照這個(gè)MRL計(jì)算，吡唑醚菌酯在蜜柚上的使用無(wú)安全間隔期問(wèn)題。本研究的套袋方式與其他研究有所不同，已有的研究(陳合等，2006； 劉建海等，2003; 劉蕾慶等，2012)采用先套袋再多次施藥，本研究結(jié)合當(dāng)?shù)孛坭植∠x(chóng)害防治方式，采用1次施藥多次采樣檢測(cè)的方法。先充分施藥再進(jìn)行套袋，不僅可以加快蜜柚果實(shí)轉(zhuǎn)色上市，還可以減少農(nóng)藥的使用，確保吡唑醚菌酯在蜜柚上使用具有安全性。