廣東和廣西地區(qū)柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及多樣性分析

宋曉兵， 彭埃天， 凌金鋒， 崔一平， 程保平， 陳 霞

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640

柑橘黃龍病Citrus Huanglongbing是一種毀滅性病害，能侵染各種柑橘類植物，對我國柑橘產(chǎn)業(yè)造成極大的威脅。柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama不僅是柑橘上的一種重要害蟲，也是柑橘黃龍病的重要傳播蟲媒(杜丹超等，2011； Cenetal.,2012)。目前對柑橘黃龍病尚缺乏有效的防治藥劑和抗病品種(宋曉兵等，2016)。加強(qiáng)對柑橘木虱的防治，對控制柑橘黃龍病的流行，降低害蟲本身對柑橘的危害都具有重要意義(宋曉兵等，2018)。

細(xì)菌和昆蟲之間除了少數(shù)屬于病原菌與寄主的關(guān)系外，存在著廣泛的非致病性關(guān)系，某些細(xì)菌則是寄主生長繁殖所必需的(Brummeletal.,2004; Dillon & Charnley,2002)。如昆蟲腸道內(nèi)生細(xì)菌在食物消化、營養(yǎng)吸收、繁殖及信息素的合成中發(fā)揮重要作用(Campbell,1990； Dillon & Charnley,2002； Tokudaetal.,2009)。內(nèi)生細(xì)菌不僅能夠?yàn)榧闹鞯纳L發(fā)育提供營養(yǎng)，還能合成多種生物活性物質(zhì)、調(diào)節(jié)寄主的免疫、抵御病原生物的入侵和定殖等(魏舸等，2018)。柑橘木虱主要以吸食植物韌皮部汁液為主，其本身沒有合成膽固醇、必需氨基酸和維生素的能力，而柑橘木虱體內(nèi)普遍存在著內(nèi)生細(xì)菌，為其提供生長發(fā)育所需的脂類化合物、維生素和必需氨基酸，內(nèi)生細(xì)菌與木虱長期共存、互惠互利、協(xié)同進(jìn)化(徐紅星等，2009)。目前，國外已提出一種創(chuàng)新性的病蟲害管理策略——共生控制(paratransgenic control)，即利用寄主的共生細(xì)菌控制昆蟲媒介或病原體(Bextineetal.,2004； Koloraetal.,2015)。如基于胞質(zhì)不相容性(cytoplasmic incompatibility，CI)的原理，將攜帶Wolbachia的雄蚊與不攜帶或者攜帶不同Wolbachia體型的雌蚊交配，雌蚊產(chǎn)的卵將不會(huì)孵化(潘曉玲等，2014； 周麗麗等，2010； Dutraetal.,2016)。

本研究通過分離培養(yǎng)及鑒定不同地區(qū)柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌，一方面明確柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生菌的區(qū)域多樣性，為研究內(nèi)生細(xì)菌與柑橘木虱之間的互作提供基礎(chǔ)；另一方面探討內(nèi)生細(xì)菌在柑橘木虱生命活動(dòng)中所起的作用，對利用潛在的候選細(xì)菌通過共生控制防治柑橘木虱或黃龍病具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試柑橘木虱

柑橘木虱成蟲分別采集自廣東省廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)(默科特)、廣州市天河區(qū)五山大豐街(九里香)、惠州市龍門縣永漢鎮(zhèn)(沙糖橘)、肇慶市德慶縣九市鎮(zhèn)(貢柑)、肇慶市高要區(qū)新橋鎮(zhèn)(貢柑)、陽江市陽西縣儒洞鎮(zhèn)(馬水橘)、河源市紫金縣藍(lán)塘鎮(zhèn)(春甜橘)和廣西桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)(蜜橘)共8個(gè)地區(qū)，每個(gè)地區(qū)采集成蟲20頭，重復(fù)采集2次。采集的柑橘木虱成蟲(雌雄隨機(jī))連同其寄主嫩梢枝葉置于塑料瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，室溫保存1～2 d內(nèi)進(jìn)行分離。

1.2 試劑和引物

2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans2K DNA Marker購自全式金生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。PCR引物對27F/1492R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 培養(yǎng)基

YEB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸出粉5 g、蔗糖5 g、氯化鈉5 g、七水硫酸鎂1 mmol·L-1、蒸餾水定容至1000 mL、pH為7.0。

YEB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸出粉5 g、蔗糖5 g、氯化鈉5 g、七水硫酸鎂1 mmol·L-1、瓊脂粉15 g、蒸餾水定容至1000 mL、pH為7.0。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌的分離

田間采集的柑橘木虱成蟲置于無菌離心管中帶回實(shí)驗(yàn)室，將木虱置于-20℃冰箱中冷凍3～5 min，降低木虱的活動(dòng)能力，然后分裝于1.5 mL離心管內(nèi)，每管5頭，重復(fù)4次。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行分離操作，將木虱置于70%乙醇中浸泡30 s，隨后用無菌水漂洗3～4次，最后一次漂洗液涂平板驗(yàn)證滅菌效果。將柑橘木虱于無菌濾紙上晾干后置于滅菌離心管中，加入500 μL YEB液體培養(yǎng)基，然后用一次性組織研磨杵將蟲體完全搗碎，分別吸取100 μL混合液涂布到Y(jié)EB平板培養(yǎng)基上，每管涂布5個(gè)平板，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落形態(tài)。根據(jù)菌落形態(tài)(大小、形狀、顏色、表面光澤、透明度和質(zhì)地等)分別挑取培養(yǎng)基表面不同種類的細(xì)菌菌落，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板上純化，純化內(nèi)生細(xì)菌接種于YEB培養(yǎng)基斜面上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 內(nèi)生細(xì)菌分子鑒定

1.5.1 DNA提取 將平板上長出的所有不同形態(tài)細(xì)菌挑出，并將其進(jìn)一步純化，得到單菌落。然后將接種單菌落至YEB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)24 h，28 ℃，120 r·min-1。取適量菌液于1.5 mL離心管中，10000 r·min-1離心30 s，棄去上清液，采用DNA提取試劑盒提取菌株的總DNA。

1.5.2 16S rDNA基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)Lane (1991)的方法，采用引物對27F/1492R (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA基因V1～V9區(qū)。PCR反應(yīng)體系：模板1.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測后剩余的PCR產(chǎn)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 16S rDNA基因測序及比對 于瓊脂糖凝膠上割取PCR產(chǎn)物的目的條帶，利用Axygen膠回收試劑盒回收純化，然后送至Invitrogen公司利用引物27F/1492R進(jìn)行兩端測序。利用DNAStar軟件(DNASTAR Inc， Madison，USA)對所獲得的目的基因序列進(jìn)行拼接，然后利用BLAST程序進(jìn)行序列相似性比對，從而鑒定所分離的柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的種屬。

1.5.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 選取所有地區(qū)的優(yōu)勢菌株序列，利用軟件MEGA 6.0進(jìn)行聚類分析，采用鄰近相接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。對分離優(yōu)勢菌株數(shù)量居多的幾個(gè)地區(qū)采用Venny 2.1在線軟件(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)制作韋恩圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的分離

對采集自廣東、廣西8個(gè)地區(qū)的柑橘木虱進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng)，共分離保存形態(tài)特征各異的柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌114株，其中,廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)(BY)17株，廣州市天河區(qū)五山大豐街(TH)12株，廣東省德慶縣九市鎮(zhèn)(DQ)11株，廣東省高要市新橋鎮(zhèn)(GY)20株，廣西省桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)(GX)10株，廣東省龍門縣永漢鎮(zhèn)(LM)17株，廣東省陽西縣儒洞鎮(zhèn)(YX)12株，廣東省紫金縣藍(lán)塘鎮(zhèn)(ZJ)15株。部分內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)如圖1。根據(jù)菌落形態(tài)(大小、形狀、顏色、表面光澤、透明度和質(zhì)地等)分別挑取培養(yǎng)基表面不同種類的細(xì)菌菌落，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板上劃線純化，接種于YEB培養(yǎng)基斜面上，4 ℃保存。

圖1 柑橘木虱部分內(nèi)生細(xì)菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphologies of several endophytic bacterial isolates from D. citri

2.2 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增

分別提取柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的總DNA，采用引物對27F/1492R擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA基因V1-V9區(qū)，產(chǎn)物長度1500 bp左右。電泳結(jié)果顯示，分離獲得的柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌均擴(kuò)增到明亮條帶，與預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度相同(圖2、圖3)。

圖2 柑橘木虱(白云)內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增分析Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA genes of endophytic bacteria in D. citri from BaiyunM:Trans2K DNA Marker；1～17:模板為17個(gè)內(nèi)生細(xì)菌的基因組DNA。M: Trans2K DNA Marker; 1-17: The templates were genomic DNA samples of 17 endophytic bacterial isolates.

圖3 柑橘木虱(天河)內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增分析Fig.3 PCR amplification of 16S rDNA genes of endophytic bacteria in D. citri from TianheM:Trans2K DNA Marker；1～12:模板為12個(gè)內(nèi)生細(xì)菌的基因組DNA。M: Trans2K DNA Marker; 1-12: The templates were genomic DNA samples of 12 endophytic bacterial isolates.

2.3 柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

對獲得的目的基因序列進(jìn)行拼接，獲得114個(gè)細(xì)菌16S rDNA序列，利用BLAST程序進(jìn)行序列相似性比對，將所分離的內(nèi)生細(xì)菌歸為細(xì)菌界的3個(gè)門的15個(gè)屬，分別為厚壁菌門Firmicutes桿菌綱Bacilli芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄球菌屬Staphylococcus、乳球菌屬Lactococcus、芽孢八疊球菌屬Sporosarcina和喜氨菌屬Ammoniphilus；變形菌門Proteobacteria γ-變形菌綱Gammaproteobacteria的假單胞菌屬Pseudomonas、泛菌屬Pantoea、腸桿菌屬Enterobacter，α-變形菌綱Alphaproteobacteria的副球菌屬Paracoccus、短波單胞菌屬Brevundimonas和赤桿菌屬Erythrobacter，β-變形菌綱Betaproteobacteria的代爾夫特菌屬Delftia；放線菌門Actinobacteria微球菌綱Micrococcales的微球菌屬M(fèi)icrococcus、考克氏菌屬Kocuria和短小桿菌屬Curtobacterium。選取有代表性的特異性菌株序列15個(gè)上傳到GenBank中(表1)。

在114個(gè)柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌中，芽孢桿菌屬59株為優(yōu)勢菌群，占分離細(xì)菌總數(shù)的51.75%；假單胞菌屬14株，占12.28%；泛菌屬10株，占8.77%；其他細(xì)菌占27.19%，在各個(gè)地區(qū)的柑橘木虱中不穩(wěn)定存在、僅在某些地區(qū)存在的細(xì)菌可能來源于自然環(huán)境或植物寄主，并未與柑橘木虱之間形成真正的共生關(guān)系，屬于過路菌群。不同地區(qū)柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量存在明顯差異，其中白云采集的木虱獲得的細(xì)菌種類最多，歸為8個(gè)屬17株；陽西采集的木虱獲得的細(xì)菌種類最少，歸為2個(gè)屬12株(表2)。

表1 15株代表性柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的鑒定情況Table 1 Identification of 15 representative endophytic bacteria of D. citri

表2 柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的鑒定分類Table 2 Identification of endophytic bacterial isolates from D. citri

2.4 優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌聚類分析

選取所有地區(qū)的芽孢桿菌屬菌株序列，采用軟件MEGA 6.0進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。聚類結(jié)果表明，柑橘木虱芽孢桿菌屬59個(gè)菌株,主要為巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium21株、短小芽孢桿菌B.pumilus19株、蠟狀芽孢桿菌B.cereus14株和吉氏芽孢桿菌B.gibsonii5株(圖4)。7個(gè)地區(qū)芽孢桿菌的聚類結(jié)果顯示，4個(gè)種類的芽孢桿菌在7個(gè)地區(qū)的分布存在差異，巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌在多數(shù)地區(qū)(均為6個(gè))均有分布，吉氏芽孢桿菌僅在廣西、德慶、白云3個(gè)地區(qū)分布(圖4)。對芽孢桿菌屬細(xì)菌分離數(shù)量居多的高要、龍門、陽西和廣西4個(gè)地區(qū)，利用Venny 2.1在線軟件制作韋恩圖。結(jié)果顯示，巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌是4個(gè)地區(qū)共有的芽孢桿菌屬細(xì)菌(圖5)，說明這2種細(xì)菌在柑橘木虱體內(nèi)有更廣泛的適用性。

3 討論與結(jié)論

柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌菌群是一個(gè)復(fù)雜敏感的生物系統(tǒng)，不同的地理區(qū)域條件下的內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)不盡相同。本研究中源自8個(gè)地區(qū)的柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌114株。以柑橘為寄主的7個(gè)地區(qū)采集的木虱上均分離到芽孢桿菌，而天河九里香上采集的柑橘木虱未分離到芽孢桿菌，這可能與寄主差異有關(guān)，推測柑橘木虱的內(nèi)生細(xì)菌有一部分來源于寄主植物，可能是柑橘木虱取食寄主汁液，將細(xì)菌從寄主植物轉(zhuǎn)移到體內(nèi)，其種群結(jié)構(gòu)會(huì)隨著寄主植物的改變而變化。聚類進(jìn)化分析表明，優(yōu)勢菌群芽孢桿菌屬主要?dú)w為4個(gè)種類,本研究未分離到對昆蟲具有致死效果的蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis。巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌均能產(chǎn)生細(xì)菌素(王偉等，2019)，芽孢桿菌細(xì)菌素具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可用于多種作物病蟲害的生物防治(李依韋等，2019； 楊得強(qiáng)等，2020; 張玉棟，2016)。本研究篩選到的芽孢桿菌是否對植物病原菌有抑制效果有待下一步研究。

楊金霞(2013)利用TSB培養(yǎng)基添加柞蠶蛹血淋巴分離柑橘木虱培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，獲得8種內(nèi)生細(xì)菌：木糖葡萄球菌Staphylococcusxylosus、葡萄球菌屬Staphylococcussp.、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、腸桿菌屬Enterobactersp.、短小桿菌屬的Curtobacteriumoceanosedimentum、磚紅色微桿菌Microbacteriumtestacyeum、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia、檸檬色短小桿菌Curtobacteriumcifreum，與本研究結(jié)果較一致，除嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌外的7種內(nèi)生細(xì)菌都能歸到本研究所分離的15個(gè)細(xì)菌屬中。孫麗琴(2014)對不攜帶黃龍病菌的柑橘木虱進(jìn)行分離鑒定，共獲得14株菌株，分屬于芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬Erwinia、克雷伯氏桿菌屬Klebsiella、葡萄球菌屬、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、泛菌屬、果膠桿菌屬Pectobacterium、沙門氏菌屬Salmonella、鏈霉菌屬Streptomyces、Massiliabrevitalea等10個(gè)細(xì)菌屬，與本研究所分離的15個(gè)屬存在較大差異，可能是由于地域、寄主差異及分離培養(yǎng)條件不同所致。

圖4 柑橘木虱優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌多樣性聚類Fig.4 Cluster analysis of dominant endophytic bacterial species of D. citri

圖5 基于4個(gè)地區(qū)芽孢桿菌屬細(xì)菌的韋恩圖Fig.5 Venn diagram of Bacillus bacteria in 4 regions

王愛華等(2010)采用常規(guī)方法分離培養(yǎng)柑橘內(nèi)生細(xì)菌，共獲得21株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，分別歸為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬Pseudomonas和葡萄球菌屬等，其中芽孢桿菌屬細(xì)菌為優(yōu)勢菌屬，共有11株，與本研究分離到的優(yōu)勢菌屬相一致。殷幼平等(2011)從柑橘木虱中發(fā)現(xiàn)了大量的條件致病菌成團(tuán)泛菌Pantoeaagglomerans，已有研究報(bào)道成團(tuán)泛生菌屬和木糖氧化產(chǎn)堿菌屬Alcaligenesxylosoxidans細(xì)菌被認(rèn)為是共生控制的候選細(xì)菌(Blakeetal.,2004； Riehleetal.,2007)，成團(tuán)泛菌與柑橘木虱的相互作用值得深入研究。Koloraetal. (2015)采用標(biāo)準(zhǔn)分離方法培養(yǎng)柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌，分離出短小芽孢桿菌屬Lysinibacillus、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、蠟狀芽孢桿菌屬Bacilluscereus、腐生葡萄球菌屬Staphylococcussaprophyticus、鏈霉菌屬、腸桿菌屬、成團(tuán)泛生菌屬、惡臭假單胞菌屬Pseudomonasputida、木糖氧化產(chǎn)堿菌屬和無色桿菌屬Chryseomonasluteola，與本研究所分離的內(nèi)生細(xì)菌的種類大致相同。綜上，芽孢桿菌目的細(xì)菌廣泛分布在各地柑橘木虱體內(nèi)，值得作為潛在的候選細(xì)菌進(jìn)行共生控制柑橘木虱的研究。

內(nèi)生細(xì)菌與宿主的免疫系統(tǒng)、外來病原、環(huán)境變化、營養(yǎng)攝入，甚至內(nèi)生細(xì)菌種群之間都相互影響與相互適應(yīng)，形成復(fù)雜的互作關(guān)系(魏舸等，2018)。在昆蟲內(nèi)生細(xì)菌的功能研究中，分析微生物的生物群落及多樣性必不可少，分離、培養(yǎng)、鑒定是研究昆蟲內(nèi)生細(xì)菌的經(jīng)典方法。然而，昆蟲體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境難以在體外模擬，多數(shù)昆蟲共生細(xì)菌都無法在體外進(jìn)行培養(yǎng)。因此，長期以來有關(guān)昆蟲共生細(xì)菌的多樣性及互作研究進(jìn)展緩慢。本研究僅采用了YEB培養(yǎng)基進(jìn)行柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng)，對于一些難培養(yǎng)細(xì)菌可能存在沒有分離出來的情況，如柑橘木虱內(nèi)共生菌Wolbachia、Carsonella、Oscillospira、Arsenophonus、Profftella等(李翌菡，2016； 殷幼平等，2011； Blakeetal.,2004; Songetal.,2019； Subandiyahetal.,2000)，下一步需要通過高通量測序技術(shù)對柑橘木虱體內(nèi)細(xì)菌組成及菌群多樣性進(jìn)行分析，以進(jìn)行柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的多樣性以及功能研究。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造昆蟲內(nèi)生細(xì)菌，用于共生控制人類病害、害蟲及植物病害蟲媒等具有廣闊的應(yīng)用前景。如：通過改造獵蝽共生菌Rhodococcusrhodnii表達(dá)cecropin A，對引起美洲錐蟲病的克氏錐蟲TrypanosomacruziChagas有良好的抑制效果(Beardetal.,1992)；通過改造按蚊共生細(xì)菌Serratia AS1分泌表達(dá)多種抗瘧活性蛋白，從而在按蚊體內(nèi)能高效特異殺滅惡性瘧原蟲(Wangetal.,2017)；通過改造葉蟬共生菌Alcaligenessp.有效控制葡萄皮爾斯病的傳播(Bextineetal.,2004)。本研究對于今后利用柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌自身的特性，抑或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造內(nèi)生細(xì)菌，在控制柑橘黃龍病和阻斷蟲媒的傳播上具有重要借鑒意義。