FOSB 與P16 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌各分子亞型中的表達(dá)及相關(guān)性

代新珍，米賢軍，鐘守軍，段立鋒，楊偉洪，劉祥玉，徐秀梅，陳志強(qiáng)

廣東省中山市博愛醫(yī)院病理科，中山 528403

乳腺癌的發(fā)生是一系列基因的漸進(jìn)性累積過程，在分子表型上存在高度異質(zhì)性。2013 年St Gallen 國際乳腺癌會議[1]根據(jù)分子表型將乳腺癌分為Luminal A 型、Luminal B 型[根據(jù)是否表達(dá)人表皮生長因子2（human epidermal receptor 2，HER2）又分為HER2-和HER2+]、HER2 陽性型及三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）。目前國內(nèi)外針對于乳腺癌不同分子亞型的個性化靶向治療尚不完善。內(nèi)分泌治療及曲妥珠單抗等藥物的應(yīng)用雖然明顯改善了部分患者的預(yù)后，但是仍然有部分患者，特別是侵襲性較強(qiáng)的TNBC 患者，除了放射治療和化學(xué)治療外，缺乏特異有效的靶向治療，因此尋找新的治療靶向基因是目前研究的重點。隨著研究[2-5]的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白P16 在乳腺癌中過表達(dá)，其有可能成為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及診斷的標(biāo)志物，并且P16 往往是在侵襲性較強(qiáng)的的乳腺癌中表達(dá)，還可能參與了乳腺癌治療相關(guān)調(diào)節(jié)通路。另有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，原癌基因蛋白FOSB作為AP-1 轉(zhuǎn)錄因子的亞單位，可以促進(jìn)TNBC 腫瘤細(xì)胞的死亡，提示FOSB 可能成為TNBC 治療中的靶點分子。Milde-Langosch 等[8]的研究提示FOSB 在乳腺癌中的表達(dá)與細(xì)胞周期蛋白特別是P16 的表達(dá)存在一定的相關(guān)性，但具體相關(guān)分子機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過免疫組織化學(xué)法（免疫組化）檢測FOSB 與P16 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌各分子亞型中的表達(dá)，分析其表達(dá)情況及相關(guān)性，期望為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌各分子亞型的個性化靶向治療提供新的靶點。

1 對象與方法

1.1 資料

病理組織來源于中山市博愛醫(yī)院病理科。選取2013年 8 月—2019 年3 月經(jīng)手術(shù)切除且經(jīng)3 位病理醫(yī)師確診的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者138 例，以及作為對照的乳腺腺病患者10 例（標(biāo)本為其乳腺腺病切除病灶周邊的正常組織）。所有研究對象的臨床病理資料完整，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織均經(jīng)免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法對雌激素受體［estrogen receptor（ER）］、孕激素受體［progesterone receptor（PR）］、人類表皮生長因子受體2［human epidermal receptor2（HER2）］、核增殖抗原Ki-67 進(jìn)行檢測，再次讀片，重新按照2013 St Gallen 國際乳腺癌會議分子亞型標(biāo)準(zhǔn)[1]核對分型。138 例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中，Luminal A 型11 例、Luminal B（HER2－）型26 例、Luminal B（HER2+）型66 例、HER2 陽性型18例、TNBC 17 例。本研究得到中山市博愛醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 主要試劑

兔抗人FOSB 單克隆抗體購自英國Abcam 公司，鼠抗人P16 多克隆抗體和SP 試劑盒均購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 免疫組化檢測

所有乳腺組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，采用免疫組化SP 法染色對FOSB 和P16 蛋白進(jìn)行檢測，實驗步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。FOSB 抗體工作濃度為1:200，P16抗體為即用型抗體，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。

讀片采用雙盲法。FOSB 和P16 免疫組化染色結(jié)果評分依據(jù)染色陽性的強(qiáng)度及面積，采用二級積分法[9]。染色范圍：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0 分，>5%且≤25%為1 分，>25%且≤50%為2 分，>50%且≤75%為3 分，>75%為4 分。染色強(qiáng)度：淡黃色為1分，黃或棕黃色為2分，棕褐色為3 分。最后計算兩者得分的乘積即為總分。根據(jù)文獻(xiàn)[9]將FOSB 總分分為0 ～1 分、2 ～6 分、7 ～12 分， 將P16 總分分為0 ～1 分、2 ～7 分、8 ～12 分；FOSB總分≥7 分，P16 總分≥8 分判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，定性資料用 n（%）表示，F(xiàn)OSB 與P16 在不同分子亞型乳腺癌中的表達(dá)組間比較采用χ2檢驗或確切概率法，相關(guān)性檢驗采用Spearman 相關(guān)性分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOSB 與P16 在正常乳腺組織及乳腺癌中的表達(dá)

FOSB 在乳腺組織的表達(dá)定位于細(xì)胞核，P16 為細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)。FOSB 和P16 在正常乳腺組織中染色一般為棕褐色或黑色，染色范圍大于50%，乳腺部分間質(zhì)細(xì)胞中也可見少許幾個細(xì)胞染色為棕褐色。FOSB 和P16在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)差異較大。FOSB 和P16 在正常乳腺組織及乳腺癌中不同染色強(qiáng)度及范圍見圖1、圖2。

2.2 FOSB 與P16 在乳腺癌組織中的表達(dá)相關(guān)性

根據(jù)免疫組化染色情況計算總分[10]，138 例乳腺癌標(biāo)本中FOSB 0 ～1 分80 例，2 ～6 分24 例，7 ～12 分34例；P16 0 ～1 分48 例，2 ～7 分41 例，8 ～12 分49 例（表1）。經(jīng)Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OSB 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與P16 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.181，P=0.033）。

圖1 FOSB 在正常乳腺組織及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的免疫組化染色情況（SP，×100）Fig 1 Immunohistochemical staining of FOSB in normal breast tissue and breast invasive ductal carcinomas (SP, ×100)

圖2 P16 在正常乳腺組織及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的免疫組化染色情況（SP，×100）Fig 2 Immunohistochemical staining of P16 in normal breast tissue and breast invasive ductal carcinomas (SP, ×100)

表1 FOSB 與P16 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)關(guān)系（n）Fig 1 Correlation of the expressions between FOSB and P16 in breast invasive ductal carcinomas (n)

2.2 FOSB 在不同分子亞型乳腺癌中的表達(dá)

FOSB 在Luminal A 型、Luminal B（HER2+）型、Luminal B （HER2－）型、HER2 陽性型和TNBC 的陽性表達(dá)率分別為63.6%（7/11）、23.1%（6/26）、26.3%（18/66）、5.6%（1/18）和11.8%（2/17），各分子亞型間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與Luminal A 型相比， Luminal B（HER2+）型（P=0.033）、Luminal B（HER2－）型 （P=0.028）、HER2 陽性型（P=0.001）和TNBC（P=0.010）中FOSB 的陽性表達(dá)率顯著較低，其余各亞型間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。

2.3 P16 在不同分子亞型乳腺癌中的表達(dá)

P16 在Luminal A 型、Luminal B（HER2+）型、Luminal B（HER2-）型、HER2 陽性型和TNBC 的陽性表達(dá)率分 別 為27.3%（3/11）、29.6%（7/26）、34.8%（23/66）、27.8%（5/18）、70.6%（12/17），各分子亞型間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.030）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與TNBC 型相比，Luminal A 型（P=0.025）、Luminal B（HER2-）型（P=0.005）、Luminal B（HER2+）型（P=0.008）、HER2 陽性型（P=0.011）中P16 的陽性表達(dá)率顯著較低，其余各亞型間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。

2.4 P16 與FOSB 在不同分子亞型乳腺癌中的表達(dá)相關(guān)性分析

FOSB 與P16 的表達(dá)水平在不同分子亞型之間相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，僅在TNBC 中FOSB 表達(dá)水平與P16 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.566，P=0.018，表2）；而在其他4 個亞型中兩者的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性（均P>0.05）。

表2 FOSB 與P16 在乳腺癌TNBC 亞型組織中的相關(guān)性（n）Fig 2 Correlation of expressions between FOSB and P16 in TNBC cancer tissues (n)

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是一系列基因分子相互作用的結(jié)果，乳腺癌在分子水平上存在高度異質(zhì)性，相同病理形態(tài)的乳腺癌在治療以及預(yù)后方面存在很大的差異。將乳腺浸潤性導(dǎo)管癌進(jìn)行分子分型為其預(yù)后的判斷和治療方法的選擇上提供了重要依據(jù)。Luminal A 型除了化療外，還可以從內(nèi)分泌治療中獲益，預(yù)后較好；Luminal B 型則內(nèi)分泌治療效果較差；HER2 陽性型與TNBC 型的惡性程度較高，容易復(fù)發(fā)及早期轉(zhuǎn)移，目前曲妥珠單抗靶向治療對HER2 陽性型有一定的效果，但TNBC 仍缺乏行之有效的治療方法[11]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的分子被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，為乳腺癌的分子分型以及治療方案的選擇提供了更多的可能性。

FOSB 作為AP-1 家族成員中重要的一員，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中充當(dāng)重要角色。P16 作為重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究[8,10,12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OSB 和P16在乳腺正常組織中的表達(dá)水平均較高，而在乳腺癌組織中的表達(dá)水平較低，并且在乳腺癌中FOSB 調(diào)控著細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P16 的表達(dá)，F(xiàn)OSB 表達(dá)強(qiáng)陽性的乳腺癌組織P16 表達(dá)無或者弱陽性，而FOSB 無表達(dá)或者弱陽性時，P16 的表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性。本研究通過免疫組化法檢測FOSB 和P16 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FOSB 高表達(dá)的組織P16 往往呈低表達(dá)，兩者表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與上述文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。然而對于FOSB 和P16 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌各分子亞型中的表達(dá)情況及關(guān)系的研究，國內(nèi)外鮮有報道。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OSB 在Luminal A 型組織中的表達(dá)水平顯著高于Luminal B（HER2+）型、Luminal B（HER2-）型、Her2 陽性型和TNBC 組織；這可能是因為FOSB 在乳腺癌中的表達(dá)與ER、PR 的表達(dá)均呈正相關(guān)[13-15]，而Luminal A 型正是ER、PR 同時高表達(dá)的分子亞型。另有研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OSB 在TNBC 中低表達(dá)，但本研究未發(fā)現(xiàn)該蛋白在TNBC 中與在Luminal B（HER2+）型、Luminal B（HER2-）型、HER2 陽性型中表達(dá)的差異。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)P16 在TNBC 組織中的表達(dá)水平顯著高于Luminal A 型、Luminal B（HER2+）型、Luminal B（HER2-）型、HER2 陽性型，也與以往的研究[16-19]結(jié)果一致。通過在乳腺癌不同分子亞型中分析FOSB 與P16 的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，兩者僅在TNBC 中呈負(fù)相關(guān)；因此我們推測這2 種蛋白在TNBC 中可能同時參與了某種基因調(diào)節(jié)途徑，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。深入研究FOSB 與P16 在TNBC 中的相關(guān)作用機(jī)制，有望對該型的個性化分子靶向治療研究提供新的思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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