維生素D受體基因多態(tài)性與青少年結(jié)核易感性的研究

沙玉霞，張 雪，周浩泉，王 華，何金根，周 玲，張慧芳，李 丹，張亞芥，母東勤，潘家華，肖 紅

由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis, PTB)仍然是最緊迫的健康問題之一。先天性免疫在PTB的病理生理中起著重要作用，其中維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)基因多態(tài)性可通過降低免疫細(xì)胞抗菌肽的表達(dá)水平及其自噬能力影響宿主對Mtb的防御，進(jìn)而影響PTB進(jìn)程[1-2]?；?環(huán)境間的相互作用影響VDR基因多態(tài)性與PTB關(guān)聯(lián)結(jié)果的一致性[1,3]。相較于成人所處社會環(huán)境的復(fù)雜及基因突變的累積，青少年所處環(huán)境較為單一，生活習(xí)性相近，研究該群體利于分析VDR基因多態(tài)性對PTB易感的影響。且近年來青少年P(guān)TB起病隱匿，痰涂片陽性率低，治療依從性差，耐藥率高。故該研究通過對VDR基因多態(tài)性與青少年P(guān)TB易感進(jìn)行相關(guān)性分析，為青少年P(guān)TB診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2018年2月～2019年10月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院及西藏自治區(qū)山南市人民醫(yī)院感染科并確診為活動性肺結(jié)核病青少年96例為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 所有肺結(jié)核病例的診斷在流行病學(xué)、臨床癥狀、體征、胸部影像學(xué)表現(xiàn)、實驗室檢查等方面均嚴(yán)格遵守《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017)》[4]確診原則；② 獲取患兒或其監(jiān)護(hù)人書面知情；③ 入組對象依從性良好。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并有其他部位結(jié)核灶、乙型肝炎、艾滋病、免疫缺陷病或需激素治療的患者。選取同期在山南市及合肥市進(jìn)行健康體檢的青少年123例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 結(jié)核病癥狀篩查陰性，PPD試驗及胸片拍攝均陰性，并結(jié)合其他輔助檢測方法隨訪跟蹤1年后均未提示結(jié)核感染；② 獲取患兒或其監(jiān)護(hù)人書面知情；③ 入組對象依從性良好。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除患有乙型肝炎、艾滋病、免疫缺陷病或需激素治療的患者。本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院、山南市人民醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 血標(biāo)本的采集采集所有研究對象外周靜脈血2 ml,3 000 r/min離心10 min，將血清及血塊分開，并置于EP管中，在-20 ℃條件下存放，集齊后進(jìn)行檢測。

1.3 VDR基因多態(tài)性檢測

1.3.1血液DNA的提取 使用血凝塊基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood Clot DNA Kit, DP335)提取基因組DNA，并通過核酸凝膠電泳檢測DNA濃度，保證濃度約100 ng/μl，將DNA提取物置于-20 ℃環(huán)境下保存。

1.3.2PCR擴(kuò)增目的基因 PCR擴(kuò)增目的基因步驟概述如下。① 設(shè)計引物：由通用生物系統(tǒng)有限公司合成引物，引物序列：ApaI上游5′-GGACAGGGAG CAAGGCCAGG-3′，下游3′-GGCTGGAAGGAGAGGC AGCG-5′；BsmI上游5′-GGCCAGCTGGGCAACCTGA A-3′，下游3′-CCAGCGGAAGAGGTC-AAGGGT-5′；FokI上游5′-TGAGGGCTCCGAAGGCACTG-3′，下游3′-GAGAGCCTGGGAGGAGGG-CT-5′；TaqI上游5′-CTGGAGGGCTTTGGGGCC-AG-3′，下游3′-GGCTGGAAGGAGAGGCAGCG-5′。② 建立PCR體系：基因組DNA(約100 ng/μl)2 μl、ApaI/BsmI/FokI/TaqI正向引物1 μl、ApaI/BsmI/FokI/TaqI反向引物1 μl、2×Taq Plus PCR Master Mix 25 μl、ddH2O 21 μl，合計50 μl。③ 將配制好的PCR反應(yīng)體系放入PCR儀進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，循環(huán)條件及過程：在94 ℃環(huán)境下預(yù)變性5 min；30個PCR循環(huán)(94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)；最后在72 ℃條件下延伸10 min；將擴(kuò)增產(chǎn)物置于4 ℃環(huán)境中保存。

1.3.3VDR基因多態(tài)性檢測 目的序列擴(kuò)增成功后，以對應(yīng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切體系：酶切片段(約500 ng)10 μl、ApaI/BsmI/FokI/TaqI限制性內(nèi)切酶(NEB北京)1 μl、10×Cutsmart 2 μl、ddH2O 7 μl，合計20 μl。配制好的酶切體系放入PCR儀進(jìn)行酶切，在37 ℃環(huán)境下酶切8 h。 酶切結(jié)束后，取酶切產(chǎn)物20 μl進(jìn)行檢測，以100 bp DNA Marker作為參照，2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像儀下觀察酶切結(jié)果，拍照并記錄。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。病例組與對照組間的定量資料、非正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料(性別、基因型分布頻率)采用χ2檢驗；通過計算比值比(Odds Ratio,OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)分析青少年P(guān)TB易感基因型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料合肥市病例組納入40例，男性22例(55.0%)，女性18例(45.0%)；對照組納入40例，男性21例(52.5%)，女性19例(47.5%)。山南市病例組納入56例，男性30例(53.6%)，女性26例(46.4%)；對照組納入83例，男性43例(51.8%)，女性40例(48.2%)。各組青少年年齡范圍均為13～19歲，中位年齡均為17歲。經(jīng)檢驗，病例組與對照組間一般人口學(xué)資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 各位點PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物四個多態(tài)性位點顯性等位基因A/B/F/T分別無ApaI/BsmI/FokI/TaqI限制性內(nèi)切酶切割位點，而隱性等位基因a/b/f/t分別具有ApaI/BsmI/FokI/TaqI限制性內(nèi)切酶切割位點。VDR基因四個位點的PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物的凝膠電泳后紫外下成像，分別對應(yīng)：① ApaI位點，PCR產(chǎn)物為453 bp，ApaI限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生AA(顯示1條453 bp的片段)、Aa(顯示453/204/249 bp的3個片段)、aa(顯示204/249 bp的2個片段)3種基因型；② BsmI位點，PCR產(chǎn)物為386 bp，BsmI限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生BB(顯示1條386 bp的片段)、Bb(顯示386/211/175 bp的3個片段)、bb(顯示211/175 bp的2個片段)3種基因型；③ FokI位點，PCR產(chǎn)物為353 bp，F(xiàn)okI限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生FF(顯示1條353 bp的片段)、Ff(顯示353/262/91 bp的3個片段)、ff(顯示262/91 bp的2個片段)3種基因型;④ TaqI位點：PCR產(chǎn)物為367 bp，TaqI限制性內(nèi)切酶酶切后分TT(顯示1條367 bp的片段)、Tt(顯示367/243/124 bp的3個片段)、tt(顯示243/124bp的2個片段)3種基因型。見圖1。

2.3 合肥市青少年基因型分布頻率分析病例組VDR-BsmI位點BB、Bb、bb基因型與對照組相應(yīng)基因型比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.948,P<0.001)；病例組FokI位點FF、Ff、ff基因型與對照組相應(yīng)基因型比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.231,P=0.027)。病例組TaqI、ApaI位點基因型與對照組相應(yīng)基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.503,P=0.778；χ2=0.978,P=0.613)，見表1。

2.4 山南市青少年基因型分布頻率分析病例組VDR-BsmI位點3種基因型BB、Bb、bb與對照組相應(yīng)基因型比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=38.485,P<0.001)；病例組FokI位點FF、Ff、ff基因型與對照組相應(yīng)基因型比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.781,P<0.001)。病例組TaqI、ApaI位點基因型與對照組相應(yīng)基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.020,P=0.221；χ2=0.166,P=0.920)，見表2。

3 討論

Mtb感染時，單核細(xì)胞Toll樣受體被激活，上調(diào)VDR和1α-羥化酶，擴(kuò)大維生素D與VDR結(jié)合后先天免疫效應(yīng)，限制胞內(nèi)Mtb的生長。PTB是由Mtb引起的一種受基因調(diào)控的傳染病，人類遺傳變異是Mtb感染結(jié)果的重要決定因素之一[5]，然而關(guān)于VDR基因變異對PTB患者的臨床影響尚未完全闡明。相較于青少年，小年齡兒童散居、營養(yǎng)好、壓力小、受卡介苗保護(hù)、PTB自愈率高；且青少年相對簡單的生活環(huán)境不易混淆VDR基因變異與PTB的關(guān)聯(lián)。故探討VDR基因多態(tài)性與青少年P(guān)TB易感性間的關(guān)聯(lián)，研究結(jié)果具有一定的普遍性。

圖1 ApaI、BsmI、FokI、TaqI位點PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

本研究采用同一技術(shù)同時對兩地區(qū)青少年進(jìn)行基因型分析，結(jié)果顯示BsmI位點Bb、bb基因型同時為兩地區(qū)青少年肺結(jié)核病易感基因型(P<0.05)。可見雖然位于VDR基因3′端第Ⅷ內(nèi)含子中的BsmI位點多態(tài)性對VDR的氨基酸結(jié)構(gòu)沒有影響，但其可能參與調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性[6]或與其他功能基因位點存在連鎖不平衡調(diào)控VDR基因表達(dá)[7]，從而影響PTB進(jìn)程。而在臺灣地區(qū)[7]的研究僅表明Bb基因型增加結(jié)核易感性，可能由于研究對象年齡范圍有別于本研究，故需更多青少年的相關(guān)研究來證實本研究結(jié)論。

表1 合肥市青少年基因型分布頻率及結(jié)核易感基因型[n(%)]

表2 山南市青少年基因型分布頻率及結(jié)核易感基因型[n(%)]

該研究表明兩地區(qū)攜帶Ff、ff突變基因型青少年患PTB風(fēng)險均顯著增加(P<0.05)。由于位于第Ⅱ外顯子上的FokI變異體可改變氨基酸序列長度，影響mRNA的表達(dá)水平[8]，f突變基因降低VDR基因轉(zhuǎn)錄速率，減少VDR蛋白含量[9]，減弱殺菌效能。然而在上海的研究僅顯示Ff增加PTB患病風(fēng)險[10]，更有在四川[11]及臺灣地區(qū)[7]的相關(guān)成人研究中并未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)聯(lián)，較本研究，在四川的成人研究納入重癥病例比例較高；在臺灣地區(qū)的成人研究納入男女比例相對失衡。

綜上，該位點多樣性可能為功能位點，受環(huán)境、年齡組別、病情嚴(yán)重程度、性別等影響；也可能與其他基因位點存在連鎖不平衡，故研究者將著眼于環(huán)境與基因間交互作用，完善研究設(shè)計，更好地闡明該位點多態(tài)性影響PTB易感性的機(jī)制。此外，北京胸科醫(yī)院得出ff基因型及低下的維生素D水平增加PTB發(fā)病風(fēng)險[3]，而北京兒童醫(yī)院卻未得出任何關(guān)聯(lián)，可見同一地區(qū)不同年齡組別下隱含的差異較大。該研究對象是合肥市及山南市青少年，故尚需證明VDR基因多態(tài)性與其他地區(qū)青少年P(guān)TB易感間的關(guān)聯(lián)是否與本研究一致。

本研究顯示VDR基因ApaI位點多態(tài)性與青少年P(guān)TB易感無關(guān)，與國內(nèi)外相關(guān)研究[7,9]結(jié)論一致。由于位于第Ⅷ內(nèi)含子上的ApaI位點多態(tài)性不影響VDR的氨基酸序列[10]，可能與TB易感無關(guān)。該研究表明TaqI變異體與青少年P(guān)TB易感亦無關(guān)，與在墨西哥的研究[9]結(jié)論一致，但與印度不同地區(qū)的研究[12-13]結(jié)論卻不一致。可見雖然TaqI多態(tài)性是由同義突變造成，不會改變氨基酸序列，但可能影響mRNA穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)翻譯效率[7]；也可能存在基因-環(huán)境交互作用混淆了TaqI多態(tài)性與PTB易感的關(guān)系。

通過對VDR基因多態(tài)性與青少年P(guān)TB易感性分析表明BsmI及FokI位點多態(tài)性與青少年P(guān)TB易感有關(guān)；為更好地了解調(diào)節(jié)VDR的3個主要因素——環(huán)境、基因和表觀遺傳學(xué)，有必要進(jìn)行重復(fù)性、多中心、大樣本研究，以得出更科學(xué)的結(jié)論，為結(jié)核病防治提供理論依據(jù)。