胃泰膠囊質(zhì)量標準提升及指紋圖譜研究

王 珺,梁承遠

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.青海省藥品檢驗檢測院 青海省中藏藥現(xiàn)代化重點實驗室，青海 西寧 810000)

0 引言

中藥是在中醫(yī)理論指導下使用的藥品制劑，中藥質(zhì)量標準的制定應該全面考慮藥品的有效性、安全性、制備工藝、制劑要求等因素，以提取完整的能表征藥品性質(zhì)的質(zhì)量控制指標，成為藥品質(zhì)量標準依據(jù)[1-4].同時，應當快速促進中藥質(zhì)量標準現(xiàn)代化研究，通過更加全面、科學的標準，讓中藥制劑質(zhì)量標準趨于優(yōu)質(zhì)化、標準化、現(xiàn)代化，全面提高中藥制劑質(zhì)量標準化的水平[5]，從而更好的保證中藥質(zhì)量，促進中藥優(yōu)良發(fā)展.

胃泰膠囊由南寒水石、訶子、砂仁、丹參、高良姜、醋香附、檀香、五靈脂八味藥組成，制劑工藝如圖1所示.功能主治為溫中和胃、行氣止痛，常用于脾胃虛弱、凝氣滯所致的胃脘冷痛、痞痛不舒，以及胃十二指腸潰腸見上述證候者.胃泰膠囊為獨家品種，由青海晶珠藏藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準文號為：國藥準字Z20025087，現(xiàn)行質(zhì)量標準為《國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準》WS-10081(ZD-0081)-2002-2012Z.

圖1 胃泰膠囊工藝制法

胃泰膠囊為常用胃病藥，暢銷全國，但是原質(zhì)量標準存在以下問題：丹參中丹參酮IIA薄層色譜鑒別中樣品對應斑點不顯示；五靈脂薄層色譜鑒別中樣品與對照藥材斑點不一致；高效液相色譜法對丹參酮IIA含量測定時樣品中丹參酮IIA的色譜峰極小且不穩(wěn)定.原有質(zhì)量標準無法控制藥品質(zhì)量，且制劑在流通過程中也因為原質(zhì)量標準問題被判抽驗不合格，給企業(yè)造成嚴重損失，基于此迫切需要開展相應研究工作.本實驗修訂了五靈脂、丹參的薄層色譜鑒別，同時增加了南寒水石的顯微鑒別和檀香的薄層色譜鑒別，重新選擇控制丹參質(zhì)量的特征成分并優(yōu)化了HPLC方法，并且采用UPLC制定了胃泰膠囊的指紋圖譜，從而全方位的掌握制劑質(zhì)量，保證藥品質(zhì)量標準更加科學合理，促進藥品流通更加通暢可靠[6,7].

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 試藥與試劑

沒食子酸對照品、丹酚酸B對照品、丹參酮IIA對照品、丹參對照藥材、五靈脂對照藥材、檀香對照藥材均來源于中國食品藥品檢定研究院.試劑均為分析純，水為超純水，10批胃泰膠囊.

1.1.2 主要儀器

Agilent1260高效液相色譜儀、Waters Acquity超高效液相色譜儀、XS105DU電子天平(上海梅特勒有限公司)、BSA224S-CW電子天平(賽多利斯有限公司)、KQ5200V超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)、101A-1E電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司)、ATS4薄層色譜點樣儀(瑞士卡瑪)、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇國華電器有限公司)、Olympus BX53顯微鏡(奧林巴斯公司).

1.2 顯微鑒別

中藥制劑顯微鑒別研究一般常用于生粉投料的藥材的質(zhì)量控制，具有簡便、快速的特征，是中藥傳統(tǒng)鑒別的重要手段[8].南寒水石為生粉投料，顯微觀察特征明顯，可具體描述為：晶體呈長方形或不規(guī)則塊狀，部分可見的晶體薄片結(jié)構(gòu)層層疊加在一起，偏光下有白色或彩色的光澤(南寒水石)[9,10].若制劑中含有此特征可判定為含有南寒水石.

1.3 薄層鑒別[11]

1.3.1 沒食子酸的薄層色譜

取本品內(nèi)容物5 g，加三氯甲烷30 mL，加熱回流30分鐘，放冷，濾過，藥渣揮盡三氯甲烷后，加乙酸乙酯30 mL，加熱回流30分鐘，放冷，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液.另取訶子對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液.再取沒食子酸對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液.吸取對照品溶液4μL，其余溶液5～10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，在日光下檢視.

1.3.2 丹參的鑒別研究

取本品內(nèi)容物3 g，加乙醇25 mL，超聲1小時，濾過，濾液蒸干，加2 mL乙醇使溶解，作為供試品溶液.另取丹參對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液.吸取上述兩種溶液2～5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視.

1.3.3 五靈脂的鑒別研究[12]

取本品內(nèi)容物5 g，加三氯甲烷20 mL，超聲處理15分鐘，濾過，藥渣揮盡三氯甲烷后，加70%乙醇30 mL，加熱回流30分鐘，放冷濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL，攪拌使溶解，加稀鹽酸調(diào)pH值至2，用乙酸乙酯提取2次(30 mL、20 mL)，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液.另取五靈脂對照藥材1 g，加乙酸乙酯10 mL，加熱回流10分鐘，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為對照藥材溶液，吸取供試品溶液10～15μL、對照藥材溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(8∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視.

1.3.4 檀香的鑒別研究

取本品內(nèi)容物10 g，加水200 mL和正己烷2 mL，用揮發(fā)油提取器加熱回流2小時，放冷，移取正己烷層，作為供試品溶液.另取檀香對照藥材1 g，加水100 mL和正己烷1 mL，同法制成對照藥材溶液.吸取上述兩種溶液5～10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60 ℃～90 ℃)-乙酸乙酯(17∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視.

1.4 含量測定

查閱文獻可知，丹參有兩大類主要成分，一類是水溶性成分，如丹酚酸B、原兒茶醛、迷迭香酸等，具有較強的抗脂質(zhì)過氧化和清楚自由基作用，其中丹酚酸B是含量最高的成分[13].一類是脂溶性丹參酮類成分如：丹參酮Ⅰ、丹參酮IIA、隱丹參酮類等，其在高溫極易分解[14,15].

胃泰膠囊處方工藝中丹參為70%乙醇加熱回流三次，提取液經(jīng)過濾、濃縮、烘干、粉碎制成顆粒備用，整個工藝過程中丹參被極性較大的溶劑反復高溫加熱提取，造成在制劑中難以檢測出脂溶性的、穩(wěn)定性較差的丹參酮IIA，經(jīng)過實驗，發(fā)現(xiàn)水溶性成分丹酚酸B可以檢出，經(jīng)一系列方法學考察，最終確立檢測丹酚酸B(結(jié)構(gòu)如圖2所示)的高效液相色譜方法考察制劑中的丹參含量.

圖2 丹酚酸B結(jié)構(gòu)圖

1.4.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(本次實驗用Agilent EcLipse XDB-C18(5μm，4.6×250 mm)；以乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78)為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為286 nm；進樣量為10μL.

1.4.2 溶液的配制

供試品溶液的制備：取本品10粒，粉末混勻，精密稱取2 g，置棕色錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理1小時，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失重量，充分振搖，過濾，取續(xù)濾液(棄去初濾液)，即得.

陰性樣品溶液的制備：按處方比例及制備工藝，制備丹參的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成不含丹參的陰性樣品溶液.

丹酚酸B對照品，供含量測定用，冷凍保存，含量以94.1%計，使用前無需處理)21.42 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻即得濃度為0.403 1 mg/mL的丹酚酸B對照品溶液.

1.5 指紋圖譜

中藥指紋圖譜是表征樣品整體狀況的一種手段，相似度可以量化指紋圖譜的相似性，中藥制劑的指紋圖譜研究對于考察藥品的穩(wěn)定性、同一性具有良好意義[16,17].故本實驗建立了胃泰膠囊的指紋圖譜研究方法，如下：取胃泰膠囊粉末2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50 mL乙酸乙酯，稱定重量，超聲處理30分鐘，再次稱定重量，用乙酸乙酯補足減失的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液.10批胃泰膠囊溶液分別注入超高效液相色譜儀測定分析，流動相A為0.1%磷酸溶液，B為甲醇，梯度洗脫(0～9 min，95%～70% A；9～12 min，70%～54% A；12～34 min，54%～5% A)；流速0.3 mL/min，進樣量10μL，檢測波長270 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 顯微鑒別結(jié)果

在圖3中，可見南寒水石顯微特征明顯；在圖4中，可見胃泰膠囊中南寒水石顯微特征明顯.因此，可判斷制劑中含有南寒水石.

(a)日光 (b)偏光圖3 南寒水石生粉顯微特征，標尺20 μm

(a)日光 (b)偏光圖4 制劑中南寒水石顯微特征，標尺20 μm

2.2 薄層色譜鑒別結(jié)果

10批胃泰膠囊的顯微鑒別方法和沒食子酸、丹參、五靈脂、檀香的薄層色譜鑒別方法均可行，都可檢出.砂仁、高良姜、香附的薄層鑒別方法因存在陰性干擾，定性研究方法未成功，達到了對所有藥味的探索研究.圖5為訶子的薄層色譜圖，供試品在與訶子對照藥材色譜和沒食子酸對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點；圖6為丹參的薄層色譜圖，供試品在與丹參對照藥材色譜相應位置上顯相同的藍色的熒光斑點；圖7為五靈脂的薄層色譜圖，供試品在與五靈脂對照藥材色譜相應位置上顯一個紅色的熒光斑點；圖8為檀香的薄層色譜圖，供試品在與檀香對照藥材相應位置上顯一個亮藍色的熒光斑點.

(a) 薄層色譜圖

(a) 薄層色譜圖

(a) 薄層色譜圖

(a) 薄層色譜圖

2.3 含量測定結(jié)果

2.3.1 方法學考察結(jié)果

(1)專屬性實驗

取丹酚酸B對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，以上述色譜條件進樣，其結(jié)果如圖9所示.由圖可知，丹酚酸B對照品和樣品中丹酚酸B保留時間一致，且峰型對稱，理論塔板數(shù)大于5 000，且陰性樣品色譜在與對照品出峰位置相應保留時間附近無干擾峰出現(xiàn)，表明陰性無干擾，方法專屬性良好.

a:樣品；b:丹酚酸對照品；c:胃泰膠囊樣品圖9 專屬性HPLC圖

(2)線性范圍考察

精密量取丹酚酸B對照品溶液(濃度為0.403 1 mg/mL)2 mL，分別置5 mL、10 mL、25 mL、50 mL、100 mL的棕色容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別精密吸取10μL注入液相色譜儀，記錄峰面積.以對照品進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積A為縱坐標(Y)，進行線性回歸分析，得回歸方程Y=1 280.2X-108.04，R2=0.999 8.由此可知,10批樣品峰面積均在線性范圍內(nèi)，表明樣品中丹酚酸B在0.080 6～4.031 0μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系.

(3)精密度試驗

精密吸取丹酚酸B對照品溶液(濃度為0.403 1 mg/mL)連續(xù)進樣6次，每次10μL，記錄色譜峰峰面積，連續(xù)進樣6次，丹酚酸B的RSD為0.72%，精密度良好.

(4)重復性試驗

取同一批號胃泰膠囊6批，分別制備6份供試品溶液，進樣量均為10μL，測定.同一批次的6批樣品中丹酚酸B的RSD為0.34%.

(5)穩(wěn)定性試驗

取同一批胃泰膠囊溶液，每間隔4小時進樣1次，重復進樣6次，進樣量為10μL，記錄色譜峰面積，計算樣品中丹酚酸B的色譜峰峰面積在20小時內(nèi)進樣的RSD為0.25%，表明樣品溶液的穩(wěn)定性在20小時內(nèi)良好.

(6)準確性試驗

取同一批胃泰膠囊粉末適量，精密稱定6份，置棕色錐形瓶中，分別精密加入4 mL丹酚酸B對照品溶液(0.403 1 mg/mL)，按上述供試品溶液制備方法制備加樣回收樣品溶液.分別精密進樣10μL，計算加樣回收樣品的含量，從而得到丹酚酸B平均回收率為95.741 4%，回收率在95.179 5%～96.195 8%之間，RSD值為0.43%，數(shù)據(jù)如表1所示.結(jié)果表明本方法回收率良好.

表1 準確性實驗結(jié)果

(7)耐用性考察

實驗分別考察了該方法在不同色譜柱在安捷倫1260高效液相色譜儀上的耐用性，選取同一批樣品溶液，采用Phenomenex Luna C18色譜柱、Hypersil BDS C18色譜柱、Agilent Zorbax SB-C18色譜柱分離分析和檢測，柱子規(guī)格均為(250 mm×4.6 mm，填料內(nèi)徑5μm)，其結(jié)果如圖10所示.由圖可知，三種色譜柱分離樣品中的丹酚酸B，分離度良好，表明該方法在不同C18色譜柱耐用性良好.

a:Phenomenex Luna C18；b:Hypersil BDS C18；c:Agilent Zorbax SB C18圖10 不同色譜柱考察

(8)流動相選擇及檢測波長選擇結(jié)果

盧召戰(zhàn)等[18]在《pH及添加劑對丹酚酸B水溶液穩(wěn)定性的影響》一文中提出：弱酸環(huán)境有利于丹酚酸B的穩(wěn)定，強酸及堿性環(huán)境中，丹酚酸B均發(fā)生分解，故流動相采用0.1%磷酸溶液.為確定其最大吸收波長，進行紫外全波長掃描，結(jié)果如圖11所示.最終選擇286 nm為其檢測波長.

圖11 丹酚酸B紫外掃描圖

2.3.2 樣品測定結(jié)果

對10批胃泰膠囊樣品進行含量測定，結(jié)果如表2所示.丹酚酸B含量在3.482 9～4.338 1 mg/粒之間，平均值為4.023 6 mg/粒，10批樣品含量范圍符合規(guī)定，同一生產(chǎn)企業(yè)批間穩(wěn)定性良好.

表2 10批樣品中丹酚酸B樣品測定結(jié)果

但是在胃泰膠囊質(zhì)量標準改進工作中發(fā)現(xiàn)，在含量測定時按實驗室常規(guī)操作，樣品溶液和對照品溶液進樣前需要用0.45μm的微孔濾膜濾過，實驗發(fā)現(xiàn)丹酚酸B對照品直接濾過后的續(xù)濾液和棄去初濾液之后的續(xù)濾液兩者差距較大.微孔濾膜對丹酚酸B吸附較強，建議棄去至少2 mL初濾液后，使用之后的續(xù)濾液進樣.

2.4 指紋圖譜結(jié)果

對10批樣品的進行UPLC指紋圖譜測定，其樣品色譜疊加圖如圖12所示.采用chempattern軟件對色譜圖進行數(shù)據(jù)處理和分析，隨機選一個樣品作為代表性樣品，進行相似度計算，結(jié)果如圖13所示.10批樣品的相似度大于0.99，相似度高，符合指紋圖譜的要求.

圖12 UPLC指紋圖譜疊加圖

圖13 樣品相似度圖

3 結(jié)論

藥品質(zhì)量標準是藥品檢驗的法律準繩，科學合理的質(zhì)量標準必須緊密圍繞處方功效和制備工藝，在制定藥品質(zhì)量標準時應綜合考量影響因素.本研究通過對10批中成藥胃泰膠囊進行質(zhì)量標準改進研究，修正并完善了原有質(zhì)量標準，建立了定性鑒別南寒水石(顯微鑒別)，訶子、丹參、五靈脂、檀香(四味藥材的薄層色譜鑒別)的方法和定量控制丹參中的丹酚酸B的方法，并增加了UPLC法測定胃泰膠囊指紋圖譜的方法，且實驗結(jié)果顯示：按著改進后的藥品標準檢驗，10批胃泰膠囊均符合規(guī)定，且質(zhì)量較穩(wěn)定.

此外檢驗不是目的，保障藥品安全有效，穩(wěn)定可控才是關(guān)鍵.為促進中藥現(xiàn)代化發(fā)展，源頭把控才是重中之重，藥材好，藥才好，中藥的可持續(xù)發(fā)展需要大家的共同努力.