莽草酸衍生物的合成及糖苷酶抑制活性研究

張 璐，任 樂，田會萍，董亞琳

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，陜西 西安 710061)

0 引言

糖尿病(90%以上為2型糖尿病)的主要危害是高血糖導(dǎo)致多系統(tǒng)、多臟器并發(fā)癥的發(fā)生.多臟器并發(fā)癥是糖尿病引起死亡及殘疾的主要原因[1].波動性高血糖比持續(xù)性高血糖更能促進(jìn)糖尿病慢性血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展[2].餐后血糖波動和日內(nèi)最大血糖波動是造成2型糖尿病患者血管內(nèi)皮損傷的重要因素，其作用獨(dú)立于持續(xù)血糖水平[3].α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitors，AGIs)是控制餐后血糖的對癥治療藥物，由于目前臨床上應(yīng)用的AGIs藥物種類少，化學(xué)合成難度大，制備困難，成本較高，而且使用過程中有腹脹、腹痛等副作用[4].因此，研究開發(fā)新型的AGIs藥物已成為抗糖尿病藥物研究的熱點(diǎn)之一.

莽草酸(Shikimic acid，SA，結(jié)構(gòu)見圖1所示)是從木蘭科植物八角茴香(Illicium verum Hook.f.)中提取的多羥基環(huán)己烯甲酸化合物.通過大量文獻(xiàn)研究，本文發(fā)現(xiàn)天然化合物SA與DNJ、伏格列波糖等α-糖苷酶抑制劑具有相似的鄰三醇結(jié)構(gòu).本研究將以SA為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，重點(diǎn)對其1-位羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成莽草酸1-位衍生物并對其糖苷酶抑制作用進(jìn)行研究，以期得到結(jié)構(gòu)新穎的糖苷酶抑制，尤其是α-糖苷酶抑制劑，為新型抗糖尿病藥物研究奠定基礎(chǔ).

圖1 SA的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 主要試劑

SA對照品(上海寶曼生物科技有限公司，批號：SH201707331，純度：99.99%)；合成用試劑O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、氫化鋁鋰(LiAlH4)、對甲苯胺、對三氟甲基苯胺、對氟苯胺、2-氨基噻唑、2-氨基吡啶、對甲苯磺酸、芐氯、正丙胺、正丁胺、苯胺、芐胺、正丁醇等均為市售分析純或化學(xué)純，水為蒸餾水.α-葡萄糖苷酶(來源于酵母，Sigma公司)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(α-PNPG)( Sigma公司)；阿卡波糖(德國拜耳公司，批號：116082)；磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2～7.6)(西安第四軍醫(yī)大學(xué)).

1.1.2 主要儀器

X-5型顯微熔點(diǎn)測定儀(北京泰克儀器有限公司)；AVANCE II 300型核磁共振(NMR)儀(德國Bruker公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(陜西太康生物科技有限公司)；X-5顯微mp測定儀(北京泰克儀器有限公司)；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵(陜西太康生物科技有限公司)；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司，型號：752).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目標(biāo)化合物的合成及其結(jié)構(gòu)鑒定

以SA為原料，分別采用酯化、酰胺化和氫化還原等方法合成SA衍生物，并根據(jù)其理化性質(zhì)和波譜(質(zhì)譜、氫譜、碳譜等)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定.

(1)目標(biāo)化合物T1～T3

合成方法參考已有文獻(xiàn)[5,6]：以SA為起始原料，在對甲苯磺酸催化和加熱回流條件下分別與甲醇、正丁醇進(jìn)行酯化反應(yīng)得目標(biāo)化合物T1和T2(圖2(a))；以SA為起始原料，以濃硫酸為脫水劑，與過量丙酮室溫下攪拌制得(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基莽草酸(中間體b)；以乙腈為溶劑，在三乙胺催化下，中間體b與芐氯80 ℃下回流反應(yīng)得到(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酸芐酯(中間體p)；將中間體p溶于甲醇，加入10%鹽酸，室溫下攪拌，停止反應(yīng)后用碳酸氫鈉溶液將pH調(diào)至7，50 ℃下蒸干溶液得到目標(biāo)化合物T3(圖2(b)).

(a)目標(biāo)化合物T1～T2

(2)目標(biāo)化合物T4～T12

以SA為原料，與丙酮反應(yīng)制得中間體b，然后以TBTU為縮合劑、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺為溶劑，分別與正丙胺、正丁胺、苯胺、芐胺、對甲苯胺、對氟苯胺、對三氟甲基苯胺及2-氨基噻唑反應(yīng)后得到(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-N-正丙基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺(中間體c4)、(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-N-正丁基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺(中間體c5)、(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-N-苯基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺(中間體c6)、(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-N-芐基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺(中間體c7)、(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-N-對甲苯基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺(中間體c8)、(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-N-對氟苯基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺(中間體c9)、(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-N-對三氟甲基苯基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺(中間體c10)和(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-N-(2′-噻唑基)-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺(中間體c11).

上述中間體與冰醋酸、水在90 ℃下加熱回流反應(yīng)，分別得到目標(biāo)化合物化合物T4～T11(圖3(a)).以SA為起始原料，與吡啶、醋酐在室溫下攪拌反應(yīng)得到三乙?；Р菟?中間體h)，中間體h在冰浴冷卻下滴加氯化亞砜，滴加完畢后加熱回流，抽濾得到酰氯粗品；將粗品用二氯甲烷溶解，在冰浴下逐滴加入2-氨基吡啶、二氯甲烷、吡啶的混合溶液，攪拌反應(yīng)，得到(3R,4S,5R)-N-(2′-吡啶基)-3,4,5-O-三乙?；?1-環(huán)己烯-1-甲酰胺(中間體i)；將中間體i溶于甲醇后，加入甲醇鈉，室溫下攪拌反應(yīng)得到目標(biāo)化合物T12(圖3(b)).

(a)目標(biāo)化合物T4～T11

(3)目標(biāo)化合物T13

將目標(biāo)化合物T1溶于THF，冰浴冷卻下緩慢加入LiAlH4，加完后緩慢升至室溫，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流，冷卻至室溫后得到目標(biāo)化合物T13，見圖4所示.

圖4 目標(biāo)化合物T13的合成路線

(4)目標(biāo)化合物T14

將中間體b與適量二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺混合后，在冰浴中慢慢加入TBTU、DIPEA，攪拌反應(yīng)后加入芐胺，室溫攪拌反應(yīng)過夜，得到中間體c7；將中間體c7溶于THF，并且慢慢滴入到LiAlH4中，冰浴攪拌后升溫至回流，反應(yīng)過夜得到(3R,4S,5R)-N-(3,4-O-異亞丙基-5-羥基-1-環(huán)己烯甲基)芐胺(中間體e)；將中間體e溶于醋酸溶液，加熱回流降至室溫，得到目標(biāo)化合物T14，見圖5所示.

圖5 目標(biāo)化合物T14的合成路線

(5)目標(biāo)化合物T15

將目標(biāo)化合物T1分散于丙酮后，逐滴加入濃硫酸反應(yīng)過夜后，用碳酸氫鈉溶液將pH調(diào)至7，得到(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯(中間體j)；將中間體j將化合物與適量吡啶、醋酐混合，于室溫下攪拌，用乙酸乙酯稀釋，取有機(jī)層依次用10% HCl洗、水洗、無水硫酸鈉干燥、得到目標(biāo)化合物T15，見圖6所示.

圖6 目標(biāo)化合物T15的合成路線

1.2.2 目標(biāo)化合物對a-糖苷酶抑制活性的測定

4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(α-PNPG)在α-葡萄糖苷酶作用下，α-糖苷鍵發(fā)生水解產(chǎn)生對硝基苯酚，它在405 nm處吸光度最大，α-糖苷酶抑制劑通過對酶活性的抑制而對此水解反應(yīng)產(chǎn)生影響，具體見圖7所示.

圖7 α-糖苷酶抑制的水解反應(yīng)

反應(yīng)體系為:PNPG溶液5.3 mmol/mL(20×10-3mL)，α-葡萄糖苷酶溶液10 U/mL(10×10-3mL)，加入不同劑量待測樣品溶液(10 mg/mL)和磷酸鹽緩沖液溶液，反應(yīng)體系總體積為130×10-3mL.空白對照為磷酸鹽緩沖液、PNPG溶液以及α-葡萄糖苷酶溶液的混合液，陽性對照為阿卡波糖.取酶液10×10-3mL加入緩沖液和不同體積待測樣品溶液，混勻，37 ℃下孵化10 min，再加入α-PNPG 20×10-3mL，37 ℃保溫10 min，加入終止劑Na2CO3(1 mol/L)50×10-3mL，混勻.取混合液110×10-3mL，溶于2 mL緩沖溶液，在405 nm處測定溶液吸光度，按式(1)計算百分抑制率(In%)，并通過SPSS計算百分之五十抑制濃度IC50值[4,5].

百分抑制率(In%)=(A0-A1/A0)×100%

(1)

式(1)中：A0為未加酶抑制劑的吸光度；A1為加入酶抑制劑后的吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的合成

目標(biāo)化合物T1：白色固體，熔點(diǎn)(mp):110 ℃～111 ℃,MS (ESI)m/z189.06 [M+H]+.1H-NMR(300 MHz,D2O)δ:2.19 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6ax),2.67 (dd,1H,J=18.0,6.9 Hz,H-6eq),3.68 (m,1H,H-5),3.73 (s,3H,CO2CH3),3.97 (m,1H,H-4),4.36 (m,1H,H-3),6.77 (d,1H,J=6.0 Hz,H-2)；13C-NMR(100 MHz,D2O)δ:31.2 (C-6),52.0 (C-2′),68.3 (C-4),68.5 (C-5),69.8 (C-3),130.1 (C-1),136.2 (C-2),167.2 (C-1′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T1為(3R,4S,5R)-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯.

目標(biāo)化合物T2:白色固體,mp:64 ℃～65 ℃,ESI-MS:m/z231.11[M+H]+.1H-NMR(300 Hz,DMSO-d6)δ:0.87～0.93 (t,3H,J=9.0 Hz,H-5′),1.31～1.40 (m,2H,H-4′),1.54～1.61 (m,2H,H-3′),2.03～2.09 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6ax),2.40～2.46 (dd,1H,J=18.0,7.1 Hz,H-6eq),3.56～3.58 (m,1H,H-5),3.84～3.86 (m,1H,H-4),4.06～4.10 (t,2H,J=6.4 Hz,H-2′),4.23 (m,1H,H-3),4.60～4.62(d,1H,J=7.2 Hz,5-OH),4.80～4.83 (m,2H,3-OH,4-OH),6.61(d,1H,J=6.0 Hz,H-2)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:128.3 (C-1),137.7 (C-2),69.8 (C-3),68.3 (C-4),68.5 (C-5),31.2 (C-6),167.2 (C-1′),65.3 (C-2′),31.2 (C-3′),18.9 (C-4′),13.8 (C-5′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T2為(3R,4S,5R)-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酸正丁酯.

目標(biāo)化合物T3:白色固體,mp:98 ℃～100 ℃,ESI-MS:m/z265.09[M+H]+.1H-NMR(300 Hz,DMSO-d6)δ:2.01～2.07 (dd,1H,J=18.0,7.1 Hz,H-6eq),2.50～2.56 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6eq),3.52 (m,1H,H-5),3.85 (m,1H,H-4),4.21(m,1H,H-3),4.32 (s,2H,-O-CH2-),4.52 (d,1H,J=7.3 Hz,5-OH),4.67～4.70 (d,1H,J=7.2 Hz,4-OH),4.78 (d,1H,J=7.2 Hz,3-OH),6.36 (d,1H,J=6.0 Hz,H-2),7.23～7.30 (m,5H,Ar-H)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:130.1 (C-1),136.2 (C-2),69.8 (C-3),68.3 (C-4),68.5 (C-5),31.2 (C-6),167.2 (C-1′),66.2 (C-2′),136.1 (C-3′),127.1 (C-4′,8′),128.9 (C-5′,7′),127.6 (C-6′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T3為(3R,4S,5R)-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酸芐酯.

目標(biāo)化合物T4:白色固體,mp:90 ℃～92 ℃,ESI-MS:m/z216.11[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:0.80～0.84(3H,t,J=8.0 Hz,H-4′),1.39～1.45(2H,m,H-3′),1.95～2.00(1H,dd,J=16.0,7.0 Hz,H-6ax),2.46～2.50(1H,dd,J=16.0,7.0 Hz,H-6eq),3.01～3.07(2H,m,H-2′),3.48～3.50(1H,m,H-5),3.80(1H,m,H-4),4.17(1H,m,H-3),4.54～4.56(1H,d,J=7.0 Hz,5-OH),4.68～4.70(1H,d,J=7.3 Hz,4-OH),4.77～4.78(1H,d,J=7.2 Hz,3-OH),6.27(1H,d,J=6.3 Hz,H-2),7.81～7.84(1H,t,J=6.0 Hz,1′-NH)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.9(C-1),136.5(C-2),69.4(C-3),67.9(C-4),68.1(C-5),30.0(C-6),168.2(C-1′),40.9(C-2′),23.1(C-3′),11.2(C-4′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T4為(3R,4S,5R)-N-正丙基-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺.

目標(biāo)化合物T5:白色固體,mp:103 ℃～104 ℃,ESI-MS:m/z230.13[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:0.84～0.89 (t,3H,J=7.5 Hz,H-5′),1.24～1.32 (m,2H,H-4′),1.35～1.43 (m,2H,H-3′),1.93～2.00 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6ax),2.46～2.48 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6eq),3.05～3.10 (t,2H,J=7.5 Hz,H-2′),3.46～3.50 (m,1H,H-5),3.79～3.82 (m,1H,H-4),4.16 (m,1H,H-3),4.64～4.69 (m,2H,4-OH,5-OH),6.26 (d,1H,J=6.0 Hz,H-2),7.76 (s,1H,1′-NH)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.9 (C-1),136.5 (C-2),69.4 (C-3),67.9 (C-4),68.1 (C-5),30.0 (C-6),168.2 (C-1′),40.3 (C-2′),32.2 (C-3′),19.8 (C-4′),13.8 (C-5′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T5為(3R,4S,5R)-N-正丁基-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺.

目標(biāo)化合物T6:白色固體,mp:136 ℃～138 ℃,ESI-MS:m/z250.10[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:2.06～2.13 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6ax),2.58～2.64 (dd,1H,J=18.0,7.2 Hz,H-6eq),3.56～3.58 (m,1H,H-5),3.87～3.80 (m,1H,H-4 ),4.27 (m,1H,H-3),4.59～4.60 (d,1H,J=7.0 Hz,5-OH),4.74～4.76 (d,1H,J=7.0 Hz,4-OH),4.81～4.83 (d,1H,J=7.0 Hz,3-OH),6.45 (d,1H,J=6.0 Hz,H-2),7.01～7.07 (d,1H,J=8.0 Hz,H-5′),7.26～7.32 (t,2H,J=8.1 Hz,H-4′,6′),7.65～7.69 (d,2H,J=8.0 Hz,H-3′,7′),9.67 (s,1H,1′-NH)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.9 (C-1),136.5 (C-2),69.4 (C-3),67.9 (C-4),68.1 (C-5),30.0 (C-6),163.1 (C-1′),137.6 (C-2′),121.6 (C-3′,7′),128.9 (C-4′,6′),128.0 (C-5′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T6為(3R,4S,5R)-N-苯基-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺.

目標(biāo)化合物T7:白色固體,mp:86 ℃～88 ℃,ESI-MS:m/z264.11[M+H]+.1H-NMR(300 Hz,DMSO-d6)δ:2.01～2.07 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6ax),2.50～2.56(dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6eq),3.53 (m,1H,H-5),3.84 (m,1H,H-4),4.20 (m,1H,H-3),4.31 (s,2H,2′-CH2),4.53 (d,1H,J=7.0 Hz,5-OH),4.68～4.70 (d,1H,J=7.0 Hz,4-OH),4.77 (s,1H,J=7.0 Hz,3-OH),6.37 (d,1H,J=6.0 Hz,H-2),7.23～7.30 (m,5H,Ar),8.40(s,1H,1′-NH)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.9 (C-1),136.5 (C-2),69.4 (C-3),67.9 (C-4),68.1 (C-5),30.0 (C-6),168.5 (C-1′),43.9 (C-2′),137.9 (C-3′),126.9 (C-4′,8′),128.5 (C-5′,7′),126.7(C-6′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T7為(3R,4S,5R)-N-芐基-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺.

目標(biāo)化合物T8:白色晶體,mp:179 ℃～180 ℃,ESI-MS:m/z264.11[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:2.05～2.10 (dd,1H,J=16.0,7.0 Hz,H-6ax),2.25 (s,3H,-CH3),2.58～2.62 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6eq),3.53～3.57 (m,1H,H-5),3.86～.88 (m,1H,H-4),4.26 (m,1H,H-3),4.65～4.66 (d,1H,J=7.0 Hz,5-OH),4.78～4.80 (d,1H,J=7.0 Hz,4-OH),4.85～4.86 (d,1H,J=7.0 Hz,3-OH),6.43 (d,1H,J=6.0Hz,H-2),7.08～7.10 (d,2H,J=8.0 Hz,H-3′,7′),7.54～7.56 (d,2H,J=8.0 Hz,H-4′,6′),9.63 (s,1H,1′-NH)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:39.9 (C-1),136.5 (C-2),69.4 (C-3),67.9 (C-4),68.1 (C-5),30.0 (C-6),163.1 (C-1′),134.6 (C-2′),121.5 (C-3′,7′),129.2 (C-4′,6′),136.8 (C-5′),21.3 (C-8′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T8為(3R,4S,5R)-N-對甲苯基-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺.

目標(biāo)化合物T9:白色固體,mp:132 ℃～133 ℃.ESI-MS:m/z268.09[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:2.06～2.11 (dd,1H,J=16.0,6.0 Hz,H-6ax),2.58～2.62 (dd,1H,J=16.0,6.0 Hz,H-6eq),3.56～3.59 (m,1H,H-5),3.88～3.90 (m,1H,H-4),4.27 (m,1H,H-3),4.67～4.68 (d,1H,J=7.0 Hz,5-OH),4.81～4.83 (d,1H,J=7.0 Hz,4-OH),4.87～4.88 (d,1H,J=7.0Hz,3-OH),6.45(d,1H,J=6.0 Hz,H-2),7.12～7.16 (d,2H,J=8.0 Hz,H-4′,6′),7.67～7.71 (d,2H,J=8.0 Hz,H-3′,7′),9.78 (s,1H,1′-NH)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.9 (C-1),136.5 (C-2),69.4 (C-3),67.9 (C-4),68.1 (C-5),30.0 (C-6),163.1 (C-1′),133.2 (C-2′),126.1 (C-3′,7′),115.7 (C-4′,6′),162.9 (C-5′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T9為(3R,4S,5R)-N-對氟苯基-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺.

目標(biāo)化合物T10:黃色固體,mp:68 ℃～70 ℃,ESI-MS:m/z318.09[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:2.09～2.13 (dd,1H,J=16.0,7.0 Hz,H-6ax),2.58～2.62 (dd,1H,J=16.0,7.0 Hz,H-6eq),3.59 (m,1H,H-5),3.89 (m,1H,H-4),4.29 (m,1H,H-3),4.70～4.72 (d,1H,J=7.0 Hz,5-OH),4.85～4.87 (d,1H,J=7.0 Hz,4-OH),4.90～4.91 (d,1H,J=7.0 Hz,3-OH),6.51(d,1H,J=6.0 Hz,H-2),7.56～7.58 (d,2H,J=8.0 Hz,H-4′,6′ ),7.91～7.93 (d,2H,J=8.0 Hz,H-3′,7′),10.1 (s,1H,1′-NH)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.9 (C-1),136.5 (C-2),69.4 (C-3),67.9 (C-4),68.1 (C-5),30.0 (C-6),163.1 (C-1′),140.9 (C-2′),121.9 (C-3′,7′),125.3 (C-4′,6′),132.1 (C-5′),124.1 (C-8′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T10為(3R,4S,5R)-N-對三氟甲基苯基-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺.

目標(biāo)化合物T11:白色固體,mp:218 ℃～220 ℃,ESI-MS:m/z257.05[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:2.09～2.14 (dd,1H,J=16.0,7.0Hz,H-6ax),2.60～2.64 (dd,1H,J=16.0,7.0 Hz,H-6eq),3.58～3.59 (m,1H,H-5),3.88～3.90 (m,1H,H-4),4.26 (m,1H,H-3),4.71～4.72 (d,1H,J=7.0 Hz,5-OH),4.84～4.86 (d,1H,J=7.0 Hz,4-OH),4.90～4.91 (d,1H,J=7.0 Hz,3-OH),6.70 (d,1H,J=6.0 Hz,H-2),7.21～7.22 (d,1H,J=7.5 Hz,H-4′),7.50～7.51 (d,1H,J=7.5 Hz,H-3′),12.1(s,1H,1′-NH)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.9 (C-1),136.5 (C-2),69.4 (C-3),67.9 (C-4),68.1 (C-5),30.0 (C-6),163.1 (C-1′),165.0 (C-2′),132.6 (C-3′),112.1 (C-4′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T11為(3R,4S,5R)-N-(2′-噻唑基)-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺.

目標(biāo)化合物T12:白色固體,mp:231 ℃～232 ℃,ESI-MS:m/z251.09[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:2.06～2.11 (dd,1H,J=16.0,7.0Hz,H-6ax),2.61～2.65(dd,1H,J=16.0,7.0 Hz,H-6eq),3.55～3.57 (m,1H,H-5),3.87～3.88 (m,1H,H-4),4.24 (m,1H,H-3),4.67(d,1H,J=7.0 Hz,5-OH),4.78(d,1H,J=7.0 Hz,4-OH),4.86 (d,1H,J=7.0 Hz,3-OH),6.56 (d,1H,J=6.0 Hz,H-2),7.10～7.13 (t,1H,J=6.0 Hz,H-6′),7.76～7.80 (dd,1H,J=8.0,5.0 Hz,H-4′),8.02～8.04 (dd,1H,J=8.0,6.0 Hz,H-5′),8.33～8.34 (d,1H,J=5.0Hz,H-3′),10.1(s,1H,1′-NH)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.9 (C-1),136.5 (C-2),69.4 (C-3),67.9 (C-4),68.1 (C-5),30.0 (C-6),163.1 (C-1′),149.9 (C-2′),148.1 (C-3′),117.9 (C-4′),138.3 (C-5′),114.2 (C-6′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T12為(3R,4S,5R)-N-(2′-吡啶基)-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酰胺.

目標(biāo)化合物T13:白色固體,mp:32 ℃～33 ℃,ESI-MS:m/z161.07[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:2.04～2.08 (dd,1H,J=16.0,7.0 Hz,H-6ax),2.40～2.44(dd,1H,J=16.0,7.0 Hz,H-6eq),3.57～3.59(m,1H,H-5),3.67(s,2H,1′-CH2),3.85～3.87(m,1H,H-4),4.22(m,1H,H-3),4.67～4.69 (d,1H,J=7.0 Hz,5-OH),4.86～4.87 (d,1H,J=7.0 Hz,4-OH),4.88(d,1H,J=7.0 Hz,3-OH),6.62(d,1H,J=6.0 Hz,H-2)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:137.1 (C-1),122.1 (C-2),68.0 (C-3),68.6 (C-4),67.6 (C-5),30.8 (C-6),67.3 (C-1′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T13為(3R,4S,5R)-1-羥甲基-1-環(huán)己烯-3,4,5-三醇.

目標(biāo)化合物T14:白色固體,mp:72 ℃～73 ℃,ESI-MS:m/z250.13[M+H]+.1H-NMR(400 Hz,DMSO-d6)δ:2.01～2.07 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6ax),2.35～2.37 (s,2H,1′-CH2),2.60～2.66 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6eq),3.67～3.69 (m,2H,H-5,4),3.74～3.76 (m,1H,H-3),4.20～4.32 (s,2H,2′-CH2),4.64～4.65 (d,1H,J=7.0 Hz,5-OH),5.42～5.46 (d,1H,J=7.0 Hz,4-OH),5.56～5.59 (d,1H,J=7.0 Hz,3-OH),6.61 (d,1H,J=6.0 Hz,H-2),7.21 (d,1H,J=7.8 Hz,H-6′),7.21～7.32 (m,4H,H-4′,5′,7′,8′)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.0 (C-1),121.9 (C-2),67.7 (C-3),68.6 (C-4),67.3 (C-5),32.2 (C-6),53.1 (C-1′),54.8 (C-2′),140.2 (C-3′),127.9 (C-4′,8′),128.5 (C-5′,7′),127.0 (C-6′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T14為(3R,4S,5R)-N-(3,4 ,5-三羥基-1-環(huán)己烯甲基)芐胺.

目標(biāo)化合物T15:白色晶體,mp:59 ℃～60 ℃,ESI-MS:m/z229.09[M+H]+.1H-NMR(300 Hz,DMSO-d6)δ:1.28～1.32 (s,6H,8-CH3,9-CH3),1.98 (s,3H,11-CH3),2.24～2.32 (dd,1H,J=18.0,7.0 Hz,H-6ax),2.59～2.66 (dd,1H,J=18.0,7.8 Hz,H-6eq),3.71 (s,3H,2-CH3),4.23～4.27 (m,1H,H-5),4.80 (m,1H,H-4),4.87～4.91 (m,1H,H-3),6.80 (d,1H,J=6.0 Hz,H-2)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:130.1 (C-1),133.8 (C-2),73.9 (C-3),76.0 (C-4),69.9 (C-5),28.3 (C-6),121.1 (C-7),26.6 (C-8,9),170.2 (C-10),21.0 (C-21),167.2 (C-1′),52.3 (C-2′).根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)確定T15為(3R,4S,5R)-3,4-O-異亞丙基-5-O-乙?；?1-環(huán)己烯-1-甲酸甲酯.所得的目標(biāo)化合物中,T4～T15未見文獻(xiàn)報道,為首次通過上述合成方法獲得的化合物[7].

2.2 目標(biāo)化合物對α-糖苷酶抑制活性的結(jié)果分析

SA經(jīng)1-位衍化后其α-糖苷酶抑制活性均較SA有所提高，所合成的莽草酸1-位衍生物對α-糖苷酶均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，但除了側(cè)鏈為氨基結(jié)構(gòu)的化合物T14外，其它化合物的IC50均大于阿卡波糖，化合物T14的IC50遠(yuǎn)小于阿卡波糖，具體見表1所示.

表1 莽草酸衍生物對α-糖苷酶的抑制活性

續(xù)表1

2.3 構(gòu)效關(guān)系分析

2.3.1 1-位側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)類型對其抑酶活性有明顯影響

莽草酸1-位經(jīng)不同結(jié)構(gòu)修飾后，其α-糖苷酶抑制活性均有提高.如圖8所示，經(jīng)分析不同類型衍生物的酶抑制活性可知，具有相似取代結(jié)構(gòu)的酯、酰胺以及胺(如化合物T3、T7及T14)，酯和酰胺具有相近的酶抑制活性，但胺的活性則明顯提高，而1-位羧基還原為醇(如化合物T13),活性略有提高，說明側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)類型對其酶抑制活性有明顯影響.

圖8 代表化合物的結(jié)構(gòu)及活性比較分析

2.3.2 1-位側(cè)鏈引入酰胺結(jié)構(gòu)有利于α-糖苷酶抑制活性

Docking分析顯示，母核3位、4位上的羥基通過提供HBA和HBD與酶催化區(qū)域的Arg625和Asp627形成氫鍵，其結(jié)果如圖9所示.當(dāng)側(cè)鏈為二級胺時，除了母核上多個羥基能形成多個氫鍵，側(cè)鏈氨基提供HBD可以與Glu657(酸性氨基酸)形成氫鍵，而酰胺鏈并不能形成氫鍵，對抑酶活性較為利.比較化合物T13，T3，T7和T14可見，盡管酰胺鏈無氫鍵形成，但是連有取代結(jié)構(gòu)時，活性較無取代的羥甲基要強(qiáng)，說明此區(qū)域取代結(jié)構(gòu)的疏水等分子間作用對活性也有影響，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)變化對活性有影響但并不明顯.

圖9 T7與α-糖苷酶蛋白的分子對接圖

2.3.3 1-位側(cè)鏈引入二級胺結(jié)構(gòu)有利于α-糖苷酶抑制活性

1-位側(cè)鏈為二級胺結(jié)構(gòu)時，除了有利于氫鍵的形成，同時堿性結(jié)構(gòu)還可能通過增強(qiáng)分子與酶催化區(qū)域的親和性，即分子更容易進(jìn)入到酶分子的空腔中，這將有利于與酶分子間的相互作用，從而使酶抑制活性明顯增強(qiáng).由此可見，堿性側(cè)鏈利于與酸性氨基酸殘基形成氫鍵并提高其與酶的親和作用，從而有利于α-糖苷酶抑制活性的產(chǎn)生.將SA的羧基還原成醇后(化合物T13)，其結(jié)構(gòu)與DNJ的結(jié)構(gòu)十分相似，其α-糖苷酶抑制活性較SA略有提高，但比阿卡波糖弱，這也可能與DNJ分子中存在有利于與酶親和作用的氨基結(jié)構(gòu)有關(guān).

3 結(jié)論

根據(jù)以上分析可見，SA及其衍生物母核上的多羥基結(jié)構(gòu)是其與酶分子間形成氫鍵的主要結(jié)構(gòu)區(qū)域.將SA母核上的羥基衍化后，如化合物T15，其α-糖苷酶抑制活性明顯降低.Docking結(jié)果也顯示，通過提供HBD及HBA與酶催化區(qū)域氨基酸殘基形成氫鍵的羥基經(jīng)衍化后，盡管醚鍵-O-只能提供HBA，與酶分子間的氫鍵作用明顯降低，說明母核上的多羥基結(jié)垢對其α-糖苷酶抑制活性至關(guān)重要.

目前，對SA的研究只有抗炎、抗凝血作用的少量研究報道，以及作為抗流感藥達(dá)菲的合成原料，未見在糖尿病方面的研究報道[8-13].本研究通過對莽草酸1-位衍生物的合成及其及α-糖苷酶抑酶活性研究，表明SA經(jīng)過羧基衍化，尤其是1-位引入二級胺結(jié)構(gòu)后，對α-糖苷酶具有明顯的抑制作用，故通1-位引入更多的不同結(jié)構(gòu)的二級胺，有可能篩選出活性更強(qiáng)的α-糖苷酶抑制劑，為抗糖尿病新藥研究提供新型結(jié)構(gòu)的候選化合物.因此，SA作為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，在抗糖尿病藥物及其它藥物研究領(lǐng)域具有廣闊的研究空間，值得進(jìn)一步研究開發(fā).