嗜纖維桿菌厭氧發(fā)酵正丁醇葡萄糖和木糖的配比優(yōu)化

郭文瑤,龔國(guó)利,劉榮杰,吳 咪,薛志飛,田 露

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

生物丁醇具有燃燒值高、疏水性強(qiáng)、揮發(fā)性低以及可與汽油以任意比例混合等優(yōu)點(diǎn)，成為僅次于燃料乙醇的新一代可再生生物燃料.它的能量密度、汽化熱、空氣燃料比和辛烷值與汽油相似[1,2]，且丁醇比乙醇有更高的能量密度、更低的揮發(fā)性、水的混溶性、可燃性和腐蝕性，可與現(xiàn)有的燃料基礎(chǔ)設(shè)施配套使用，直接替代汽車發(fā)動(dòng)機(jī)中的汽油，無(wú)需對(duì)汽車進(jìn)行任何改造[3].此外，丁醇還可應(yīng)用在生活中的大部分塑料制品及染料產(chǎn)品，如安全玻璃、涂料、洗滌劑等.因此，利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇具有很高的研究?jī)r(jià)值[4].但是可用于生物丁醇生產(chǎn)的發(fā)酵底物成本相對(duì)較高[5,6]，且常見的丙酮丁醇發(fā)酵，原料通常占總生產(chǎn)成本的50%以上[7]，所以在難以找到可廣泛利用的原料的情況下降低成本，探索原料的配比尤為重要.

能進(jìn)行丁醇生產(chǎn)的微生物主要是一些產(chǎn)溶劑梭菌，如丙酮丁醇梭菌、拜式梭菌、糖丁酸梭菌等[8]，其中丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵過程分為兩個(gè)階段：產(chǎn)酸階段(細(xì)胞生長(zhǎng)期)和產(chǎn)溶劑階段.在產(chǎn)酸階段，菌株迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)生大量的H2和CO2，乙酸和丁酸逐漸積累，pH下降.當(dāng)pH下降到一定值時(shí)，代謝轉(zhuǎn)向產(chǎn)溶劑階段，乙酸和丁酸被消耗，pH回升.在溶劑產(chǎn)生后期，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏及代謝產(chǎn)物的毒性作用，菌體逐漸衰亡，產(chǎn)生芽孢(如圖1所示).目前丙酮丁醇梭菌產(chǎn)生丁醇的最高產(chǎn)量?jī)H為30 g/L.此外，還會(huì)產(chǎn)生乳酸和乙酸等有機(jī)酸的副產(chǎn)物，造成能量消耗，增加了下游工藝產(chǎn)品純化的難度.同時(shí)，其他丙酮丁醇梭菌無(wú)法同時(shí)利用葡萄糖和木糖，有嚴(yán)重的CCR(碳代謝物阻遏效應(yīng))現(xiàn)象，且不能直接利用纖維素做底物.

圖1 丁醇發(fā)酵途徑[9-12]

微生物作為生物燃料生產(chǎn)中的重要參與者，其性能好壞直接影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[13].嗜纖維桿菌具有很高的產(chǎn)纖維素和乙酸/丁酸能力，是生產(chǎn)正丁醇的理想原料.但是目前自然界存在的天然微生物菌株不能滿足丁醇商業(yè)化生產(chǎn)的需求，需要采用代謝工程和基因工程手段構(gòu)建能夠高效利用木糖的菌株[14].Teng Bao等[15]從丙酮丁醇梭菌中引入三種不同的由bdhB、adhE1和adhE2基因編碼的醛/醇脫氫酶到嗜纖維桿菌中，其中過表達(dá)adhE2菌株的正丁醇產(chǎn)量最高，達(dá)4.0 g/L，產(chǎn)率為0.22±0.01 g/g.在木質(zhì)纖維素的水解產(chǎn)物中，產(chǎn)乙醇微生物對(duì)木糖等五碳糖的利用率非常低，有些微生物雖然能利用這些五碳糖，但不能將它們轉(zhuǎn)變成乙醇.

因此，本文擬通過實(shí)驗(yàn)室改造的嗜纖維桿菌(C.cellulovorans)adhE2菌株進(jìn)行厭氧發(fā)酵，探究葡萄糖和木糖同時(shí)使用的抑制情況.利用不同比例的葡萄糖和木糖檢測(cè)該發(fā)酵方法是否有碳代謝物阻遏效應(yīng)(CCR)反應(yīng).該結(jié)果對(duì)實(shí)現(xiàn)重復(fù)分批發(fā)酵的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行及將來對(duì)菌株的進(jìn)一步代謝改造有一定意義.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

1.1.1 菌株

本文以嗜纖維桿菌adhE2為實(shí)驗(yàn)菌株，該菌株是以嗜纖維桿菌為底盤細(xì)胞通過基因改造加入編碼醛/醇脫氫酶adhE2(aldehyde-alcohol dehydrogenase)的基因，可直接利用纖維素，且經(jīng)過代謝改造已實(shí)現(xiàn)CBP生產(chǎn)丁醇.CBP將酶生產(chǎn)、纖維素水解、發(fā)酵三步合成為一個(gè)工藝步驟，大大減少了資金投入，是工業(yè)應(yīng)用中最經(jīng)濟(jì)、最理想的方法[16].改造后的嗜纖維桿菌adhE2能將丁基輔酶a轉(zhuǎn)化為正丁醇，將乙酰輔酶a轉(zhuǎn)化為乙醇[17].且該菌株可以利用多種底物，包括纖維素、木糖、果膠、纖維二糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖和甘露糖.使用經(jīng)改造的嗜纖維桿菌adhE2一定程度緩解了ABE生產(chǎn)正丁醇成本高的限制.總的來說，該菌株能夠提高丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度和對(duì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的利用能力.

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：TGY(Tryptone Glucose Yeast)培養(yǎng)基：胰蛋白胨30.0 g，葡萄糖20.0 g，酵母粉1.0 g，L-半胱氨酸1.0 g，水1 000 mL，pH 6.5，121 ℃濕熱滅菌20 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 2.9 g/L，KH2PO41.5 g/L，(NH4)2SO41.3 g/L，酵母膏2.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，MgCl2·6H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.075 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 25 g/L，微量元素溶液(FeCl2·4H2O 1.5 mg/L，ZnCl20.07 mg/L，MnCl2·4H2O 0.1 mg/L，CoCl2·6H2O 0.19 mg/L，CuCl2·2H2O 0.002 mg/L，NiCl2·6H2O 0.024 mg/L，H3BO30.006 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.036 mg/L，HCl(25%，7.7M)0.0.1 mg/L)，刃天青染色劑0.001 g/L.將該溶液置于沸水煮30 min至粉色，加入0.5 g/L半胱氨酸，再煮15 min至溶液變?yōu)辄S色.抽取50 mL至血清瓶，充入氮?dú)?5 min，用丁基橡膠塞和鋁蓋封口后121 ℃高壓濕滅35 min.高壓滅菌后加入Na2CO31.5 g/L(150 g/L預(yù)配原液)和甲砜霉素25 mg/L，使用HCl調(diào)節(jié)pH至6，約1.5 mL/L HCl.

在上述培養(yǎng)條件下，按照試驗(yàn)需求加入不同比例的五碳糖和六碳糖的代表作為碳源模擬利用粗底物，即葡萄糖/木糖溶液，或加入可生成還原反應(yīng)的水溶性物質(zhì)甲基紫精(Methyl Viologen，MV)，考察其對(duì)嗜纖維桿菌產(chǎn)正丁醇的影響.

1.1.3 儀器

氣相色譜(中國(guó)，Jie Dao GC1600)，高效液相色譜(Agilent Technology,USA)，HWS型恒溫恒濕培養(yǎng)基箱(上海比朗儀器有限公司)，TGL-16M型高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，TX B622L型電子天平(捷久計(jì)量衡器上海有限公司)，PHS-25型pH計(jì)(上?？茖W(xué)精密儀器有限公司)，YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，HY-5回旋多用振蕩器(金壇市華峰儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將甘油保存菌種從-80℃低溫冰箱取出后，室溫緩慢融化，使用一次性無(wú)菌注射器將種子菌以5%(v/v)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，均勻混合后pH為6.04，OD值為2.06，活化條件根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)選擇37 ℃恒溫下活化16.5小時(shí).無(wú)特別說明時(shí)裝液量均為100 mL厭氧瓶中裝50 mL.

1.2.2 發(fā)酵過程及檢測(cè)

厭氧瓶發(fā)酵：選用100 mL規(guī)格厭氧瓶，加入50 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)活化好的菌株，接種量為2.5 mL，發(fā)酵10 d.使用0.5 mol/mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值到6.5左右.在發(fā)酵過程中，每天同一時(shí)間取三組平行樣測(cè)OD600值，并使用氣相及液相對(duì)發(fā)酵液丁醇和乙酸等副產(chǎn)物的含量進(jìn)行檢測(cè).

發(fā)酵罐發(fā)酵：選用1 000 mL小型發(fā)酵罐，發(fā)酵10 d，通過自動(dòng)pH調(diào)節(jié)器加0.5 mol/mL NaOH溶液控制pH在6.5左右.每天取5 mL發(fā)酵液監(jiān)測(cè)其pH和OD600值，并通過氣相和液相對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物成分進(jìn)行檢測(cè).

光密度檢測(cè)：紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處以蒸餾水為空白對(duì)照用分光光度法測(cè)定生物量.

氣相檢測(cè)：采用FID檢測(cè)器，N2流速為50 mL/min，檢測(cè)器溫度為250 ℃，柱溫為160 ℃.以實(shí)驗(yàn)室自配混合GC標(biāo)準(zhǔn)液(丙酮、乙醇、丁醇、乙酸和丁酸)作內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量檢測(cè).

液相檢測(cè)：采用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器法進(jìn)行測(cè)定.色譜柱為Nucleosil-120 C18柱(250 nm×4 nm,5μm)或效能相當(dāng)?shù)纳V柱，以濃硫酸-雙蒸水(0.026∶1，v/v)為流動(dòng)相，流速0.6 mL·min-1，柱溫和檢測(cè)器溫度均為65 ℃，進(jìn)樣量為10μL.采用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以便定量檢測(cè).

所有檢測(cè)均為一式三份，平行實(shí)驗(yàn)三次，重復(fù)試驗(yàn)兩次.

1.2.3 配比優(yōu)化

采用葡萄糖和木糖的混合糖作為碳源進(jìn)行丁醇發(fā)酵試驗(yàn)，嘗試以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1:3五種配比進(jìn)行發(fā)酵，尋找對(duì)葡萄糖和木糖利用率相對(duì)較高且丁醇產(chǎn)率最高的比例.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

葡萄糖及木糖轉(zhuǎn)化率是指底物經(jīng)酶水解后得到的葡萄糖(或木糖)的質(zhì)量與原料葡萄糖(木糖)含量的百分比.菌體的比生長(zhǎng)速率指單位時(shí)間內(nèi)，單位菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物或形成菌體的量.丁醇產(chǎn)率即丁醇濃度與消耗的糖濃度之比.葡萄糖比生長(zhǎng)速率可用公式(1)表示：

(1)

式(1)中：χ為菌體(g/L)，t為時(shí)間(h).

本實(shí)驗(yàn)使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行作圖和分析，主要通過SPSS(Statistical Product and Service Solutions)對(duì)數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與討論

為了更好地研究六碳糖和五碳糖的比例調(diào)控丁醇的產(chǎn)量，從而對(duì)今后的分子實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)和參考.本文嘗試不同的底物配比進(jìn)行發(fā)酵，尋找對(duì)葡萄糖和木糖利用率相對(duì)較高且丁醇產(chǎn)率最高的配比.

2.1 單一底物

首先利用氣相色譜和高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，觀察以不同配比的葡萄糖或木糖為底物時(shí)對(duì)嗜纖維桿菌adhE2發(fā)酵的影響，對(duì)該菌株進(jìn)行初次發(fā)酵性能評(píng)價(jià).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木糖消耗的速率緩慢降低，與葡萄糖發(fā)酵相比，木糖發(fā)酵顯著提高了丁醇/乙醇的比例，如圖2和表1所示.

圖2 以木糖為底物發(fā)酵

表1 以葡萄糖或木糖(+MV)為底物發(fā)酵

為了提高丁醇產(chǎn)量，本文在原有的木糖底物基礎(chǔ)上添加MV進(jìn)行試驗(yàn).其中MV是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化逆境的促進(jìn)劑.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道微量的MV可以提高丁醇的產(chǎn)率[18].結(jié)果顯示，添加MV后(如圖3所示)，丁醇含量進(jìn)一步增加到2.4 g/L，除乙醇產(chǎn)量略有增加，從0.65 g/L增加到0.97 g/L，其他副產(chǎn)物均沒有增加趨勢(shì)，如圖3和表1所示.這可能是因?yàn)槟咎墙到馔緩讲粌H依賴于輔酶Ⅰ(NADH)，還依賴于還原型輔酶Ⅱ(NADPH).因此，NADH的冗余促進(jìn)了碳通量從乙酰輔酶a向丁基輔酶a的方向發(fā)展，導(dǎo)致丁醇的積累.

圖3 以木糖(添加MV)為底物發(fā)酵

2.2 葡萄糖與木糖協(xié)同利用

為了尋找對(duì)葡萄糖和木糖利用率相對(duì)較高且丁醇產(chǎn)率最高的比例.本文采用葡萄糖/木糖配比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3等不同配比底物在50 mL血清瓶發(fā)酵，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡萄糖和木糖配比為3∶1和2∶1的時(shí)候，嗜纖維桿菌在發(fā)酵初期大量消耗葡萄糖，一段時(shí)間之后木糖和葡萄糖消耗的速率開始接近，如圖4和圖5所示.

圖4 葡萄糖與木糖為3∶1作底物發(fā)酵

將葡萄糖和木糖比例為1∶1作為界限，如圖6所示，隨后增加木糖在發(fā)酵底物中的占比，可以明顯觀察到該菌株消耗木糖的時(shí)間開始提前，如圖7和8所示.當(dāng)葡糖糖和木糖比例為1∶3時(shí)，細(xì)菌僅代謝葡萄糖24小時(shí)后即會(huì)開始主要消耗木糖，如圖8所示.當(dāng)葡萄糖和木糖比例為3:1時(shí)，細(xì)菌代謝葡萄糖96小時(shí)后才會(huì)主要消耗木糖，如圖4所示.另外葡萄糖濃度在碳源中占比高時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生較多的乙酸和丁酸等，如圖4～8所示.相比于其他菌株，本次實(shí)驗(yàn)所用的嗜纖維桿菌同時(shí)使用葡萄糖和木糖，可以提高對(duì)水解酶抑制劑的耐受性，有利于從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中生產(chǎn)正丁醇.

圖6 葡萄糖與木糖為1∶1作底物發(fā)酵

圖7 葡萄糖與木糖為1∶2作底物發(fā)酵

圖8 葡萄糖與木糖為1∶3作底物發(fā)酵

有研究表明，纖維素在葡萄糖存在下消耗的木糖量可以忽略不計(jì)或有限，因?yàn)樘即x物阻遏效應(yīng)(CCR)常發(fā)生在大多數(shù)菌株中.從表2中可以看出，葡萄糖和木糖同時(shí)被嗜纖維桿菌消耗.在不同的葡萄糖和木糖比下，菌株表現(xiàn)出不同的比生長(zhǎng)率、葡萄糖和木糖攝取率.當(dāng)葡萄糖和木糖比例為3∶1時(shí)，即使葡萄糖消耗殆盡，細(xì)菌也能以較高的速率攝取葡萄糖，但木糖消耗可忽略不計(jì).可見，在高糖濃度下，CC在木糖代謝中仍受CCR的影響.隨著木糖濃度的增加，CCR瓶頸得到緩解，木糖吸收速率由0.007提高到0.046.當(dāng)葡萄糖與木糖比達(dá)到1∶1時(shí)，丁醇的效價(jià)最高.

表2 不同比例葡萄糖與木糖為底物發(fā)酵

2.3 發(fā)酵罐發(fā)酵

在之前的實(shí)驗(yàn)中，本課題組發(fā)現(xiàn)在葡萄糖和木糖比例為1∶1時(shí)，丁醇產(chǎn)率最高，所以本文優(yōu)化了葡萄糖與木糖的比例，將發(fā)酵規(guī)模由50 mL血清瓶擴(kuò)大到250 mL生物反應(yīng)器.與血清瓶厭氧發(fā)酵相比，生物反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)生大量乙醇.使用1 mL MV作為誘導(dǎo)劑處理后，發(fā)現(xiàn)MV對(duì)丁醇發(fā)酵產(chǎn)生了較強(qiáng)的促進(jìn)作用，乙醇和丁醇的產(chǎn)量均提高到了3.5 g/L左右，且副產(chǎn)物乙酸明顯下降，如表3、圖9和圖10所示.推測(cè)是該菌受到MV誘導(dǎo)，抗氧化酶系統(tǒng)被激活，反應(yīng)生成了一些抗氧化分子，即MV激活了該菌的抗氧化防護(hù)系統(tǒng)[19,20].

表3 擴(kuò)大規(guī)模后木糖與葡萄糖(+MV)為底物發(fā)酵

圖9 葡萄糖與木糖為1∶1作底物發(fā)酵罐中發(fā)酵

圖10 葡萄糖與木糖為1∶1(添加MV)作底物發(fā)酵罐中發(fā)酵

3 結(jié)論

本文使用前期實(shí)驗(yàn)室通過基因工程手段改造的嗜纖維桿菌adhE2菌株，以葡萄糖和木糖作為碳源進(jìn)行丁醇發(fā)酵研究.通過探索不同比例的葡萄糖與木糖，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖和木糖比例為1∶1時(shí)，該菌株對(duì)葡萄糖和木糖的利用率相對(duì)較高且丁醇產(chǎn)率(0.097 g/g)最高.同時(shí)，利用發(fā)酵罐擴(kuò)大規(guī)?；蚴羌尤隡V，丁醇產(chǎn)率均會(huì)增加，最高達(dá)到3.6 g/L左右，幾乎實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖和木糖為原料的正丁醇穩(wěn)定生產(chǎn).表明了葡萄糖和木糖比例為1∶1可以作為一種丁醇的生產(chǎn)工藝，提高了該菌株對(duì)底物的利用效率，探究了葡萄糖和木糖同時(shí)使用的抑制情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CCR反應(yīng)不是很大，進(jìn)一步證明嗜纖維桿菌可以很好地利用粗底物，后續(xù)希望利用不同的粗底物進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)實(shí)現(xiàn)重復(fù)分批發(fā)酵的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行有一定及將來對(duì)菌株的進(jìn)一步代謝改造有一定意義.