產(chǎn)黃腐酸菌株的分離鑒定及培養(yǎng)基優(yōu)化

賀小賢，宋海濤，雷化雨，史懿樂，楊 婷，夏 飛，劉 歡

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021)

0 引言

腐殖質(zhì)是動植物殘體(主要是植物殘體)經(jīng)過微生物的分解和轉(zhuǎn)化，以及一系列地球物理和化學作用后積累起來的一種天然有機高分子聚合物，主要成分為腐植酸和不溶物胡敏素.腐植酸主要由黑腐酸、棕腐酸和黃腐酸組成.腐殖質(zhì)廣泛存在于自然界的土壤和水中，但低階煤(泥炭、褐煤和風化煤)是腐植酸主要工業(yè)來源[1,2].黃腐酸(Fulvic acid，F(xiàn)A)是腐植酸中分子量最小(500～2 000 Da)，既能溶于稀堿溶液，又能溶于酸和水的無定形混合物[3,4].黃腐酸分子中含有苯環(huán)、稠苯環(huán)及多類雜環(huán)，在環(huán)及支鏈中包含有酚羥基、羧基、甲氧基、酮基、磺酸基等官能團，具有較強的生理活性(陽離子交換能力、pH緩沖能力)和生物活性[5]，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥均有廣泛的應(yīng)用[6-11].

現(xiàn)階段，黃腐酸的制備主要通過傳統(tǒng)的提取法(如堿溶酸沉法、硫酸丙酮法、有機溶劑提取、強酸抽提等)和電滲析法，但大多數(shù)煤中的黃腐酸含量較低，這些方法存在黃腐酸提取效率低、反應(yīng)時間長、環(huán)境污染等問題[12].腐殖酸雖然廣泛存在于自然界中，但是目前我國95%以上的腐植酸資源屬于黑腐酸，而棕腐酸和黃腐酸所占比例極少[13].目前，對于以黑腐酸為底物進行生物轉(zhuǎn)化合成黃腐酸的研究甚少.

本文以黑腐酸為底物，黃腐酸含量為指標，篩選可利用黑腐酸生物合成黃腐酸的菌株，對黃腐酸含量最高的菌株綜合采用生理生化和分子生物學手段進行鑒定，并通過單因素實驗對底物濃度、培養(yǎng)基碳源和氮源種類及添加量進行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基組成，為微生物轉(zhuǎn)化黑腐酸制備黃腐酸提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品與培養(yǎng)基

1.1.1 樣品

土壤樣品采集地點為甘肅某腐殖酸生產(chǎn)企業(yè)褐煤堆積處(A)、陜西科技大學校園內(nèi)枯葉堆積處(B)、浐灞生態(tài)濕地公園枯葉堆積處(C)，采集土壤深度為3～15 cm共計9份(每處土壤取樣3份)土壤樣品.

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)細菌分離培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，氯化鈉5 g，無菌水1 000 mL，121 ℃下，滅菌20分鐘.

(2)霉菌分離培養(yǎng)基：硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，無菌水1 000 mL，121 ℃下，滅菌20分鐘.

(3)篩選培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，黑腐酸10 g，氯化鈉5 g，無菌水1 000 mL，121 ℃下，滅菌20分鐘(細菌)；硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，黑腐酸10 g，無菌水1 000 mL，121 ℃下，滅菌20分鐘(霉菌).

(4)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，無菌水1 000 mL，121 ℃下，滅菌20分鐘.添加15 g瓊脂制成固體平板.

1.2 主要試劑與設(shè)備

1.2.1 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、甘露醇、酵母粉、蛋白胨、玉米粉、硝酸銨、硝酸鉀、牛肉膏、尿素、氯化鈉、黑腐酸、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵銨(均購自天津市天力化學試劑有限公司),濃硫酸、重鉻酸鉀、鄰菲羅啉(購自天津市科密歐化學試劑有限公司),革蘭氏染色液(購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司),膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶預(yù)混液、DNA標準分子量Marker III(購自北京天根生化科技有限公司).

1.2.2 主要設(shè)備

YXQ-SG46-28A 電熱壓力蒸汽滅菌器(上海醫(yī)療器械公司)、LED-3 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、SPX-150-Z 立式振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)、HW-200 電子顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)、Pico-17 高速離心機(時代生物科技有限公司)、ZW3417032209 紫外可見光光度計(上海光譜儀器有限公司)、DK-98 數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(上海精密儀器有限公司)、MJ-250 生化培養(yǎng)箱(金壇市吉特實驗儀器廠)、Phenom Pro臺式掃描電鏡(復(fù)納科學(上海)儀器有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株分離與篩選

(1)平板分離：在超凈工作臺內(nèi)，稱取20 g土壤樣品加入到180 g無菌水中制備菌懸液，之后進行10倍梯度稀釋，分別吸取200μL稀釋至10-4、10-5和10-6的菌懸液，分別涂布于細菌固體培養(yǎng)基和霉菌固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48 h后，觀察菌落生長情況.

(2)搖瓶篩選：將平板分離獲得的菌株接種于100 mL篩選培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm培養(yǎng)48 h后，以黃腐酸含量為指標，篩選出高產(chǎn)黃腐酸的菌種.

1.3.2 菌株的鑒定

(1)菌落形態(tài)觀察

將單菌落用LB培養(yǎng)基制成菌懸液后，用接種環(huán)蘸取菌懸液于LB培養(yǎng)基固體平板上進行劃線后于37 ℃生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，取出觀察菌落形態(tài).并挑取少量菌落進行革蘭氏染色，于油鏡下觀察.

(2)菌株生理生化試驗

根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》進行菌株生理生化鑒定[14].

(3)分子生物學鑒定

將分離純化的單菌落接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取100μL菌液離心后收集菌體并用無菌水進行重懸，沸水浴中煮5 min，離心取上清作為模板，利用細菌16S rDNA引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增，反應(yīng)體系總體積50μL：模板3μL、引物各3μL、2×Taq PCR Master Mix 25μL、ddH2O 16μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min、94 ℃變性30 s、54 ℃退火45 s、72 ℃延伸 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃ 保存.對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，并對目的條帶進行膠回收純化，由北京擎科生物科技有限公司進行測序.利用MEGA7對測序后的16S rDNA序列進行比對分析，采用Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行Bootstrap分析[15].

1.3.3 掃描電鏡觀察

取1.5 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液8 000 rpm 離心3 min，棄掉上清加1 mL 戊二醛，置于4 ℃冰箱固定2～4 h.離心去上清，加磷酸緩沖液清洗，振蕩10 min.離心去上清，分別用50%、70%、90%和100%(v/v)的乙醇脫水10 min，接著用乙酸異戊酯浸泡30 min或者過夜，離心去上清.使用烘箱烘干，噴金后進行掃描電鏡觀察.

1.3.4 生長曲線測定

將凍存于-80℃的菌株接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)(37 ℃，200 rpm)，培養(yǎng)12 h，用新鮮的LB液體培養(yǎng)基將菌懸液的濃度調(diào)整至OD600 nm=1.0.向三角瓶中加入LB培養(yǎng)基，接種1%(v/v)的菌懸液.將三角瓶置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200 rpm，使用酶標儀每隔1 h 檢測培養(yǎng)液在波長600 nm 處的吸光值.以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標，菌懸液在600 nm 處的吸光值為縱坐標，繪制生長曲線.

1.3.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

(1)黑腐酸添加量的優(yōu)化

通過單次單因素實驗，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L黑腐酸，將凍存于-80℃的菌株接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)(37 ℃，200 rpm)，培養(yǎng)12 h，用新鮮的LB液體培養(yǎng)基將菌懸液的濃度調(diào)整至OD600 nm=1.0.1%(v/v)接種量，37 ℃、轉(zhuǎn)速200 rpm培養(yǎng)24 h，檢測黃腐酸含量，確定底物最適添加量.

(2)培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

通過單次單因素實驗，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加5 g/L淀粉、酵母粉、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、麥芽糖等不同碳源取代培養(yǎng)基中的酵母粉，1%(v/v)接種量，37 ℃、轉(zhuǎn)速200 rpm培養(yǎng)24 h，檢測黃腐酸含量，確定最佳碳源.

(3)培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

在確定最佳碳源后，分別添加10 g/L牛肉膏、玉米粉、尿素、蛋白胨、NH4NO3、KNO3等6種不同類型的氮源，1%(v/v)接種量，37 ℃、轉(zhuǎn)速200 rpm培養(yǎng)24 h，檢測黃腐酸含量，確定最佳氮源.

(4)培養(yǎng)基碳源和氮源最佳添加量的確定

在確定最佳碳源和氮源后，對其添加量進行優(yōu)化.首先固定培養(yǎng)基中氮源添加量為10 g/L，碳源添加量分別設(shè)置為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L，1%(v/v)接種量，37 ℃、轉(zhuǎn)速200 rpm培養(yǎng)24 h，檢測黃腐酸含量，確定碳源的最優(yōu)添加量.之后在碳源最優(yōu)添加量的基礎(chǔ)上，分別添加不同濃度(1 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L)氮源，1%(v/v)接種量，37℃、轉(zhuǎn)速200 rpm培養(yǎng)24 h，檢測黃腐酸含量，確定氮源的最優(yōu)添加量.

1.3.6 黃腐酸測定方法

黃腐酸測定用重鉻酸鉀容量法[16].

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)至少3次，每次實驗設(shè)置3個平行；采用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)與鄧肯法(Duncan′s)差異分析，顯著性水平為5%；使用GraphPad Prism 7.00軟件作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)黃腐酸菌株的分離與篩選

本研究通過平板分離和搖瓶篩選從三處土壤樣本中分離篩選出了18株可利用黑腐酸生產(chǎn)黃腐酸的單一菌株，其中黃腐酸含量達到5%以上的菌株共10株，其中土壤樣品A中分篩了4個菌株，土壤樣品B和土壤樣品C分別篩到3個菌株.最終選取黃腐酸含量最高的菌株A1進行后續(xù)鑒定，其黃腐酸含量達到了15.88%(如圖1所示).

圖1 不同菌株黃腐酸的產(chǎn)量(不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),相同小寫字母表示差異不顯著(p>0.05))

2.2 產(chǎn)黃腐酸菌株的鑒定

2.2.1 菌種A1的形態(tài)學分析

對A1菌株在LB固體平板上進行劃線，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.A1菌株在LB固體培養(yǎng)基上形成圓形、乳白色菌落，表面凸起、較濕潤黏稠、易挑起，如圖2(a)所示.A1菌株經(jīng)革蘭氏染色后呈藍紫色，即為革蘭陽性細菌，如圖2(b)所示(放大100倍).通過掃描電鏡進行菌體形態(tài)觀察，放大5 900倍時可看到菌體呈短桿狀、兩端鈍圓，如圖2(c)所示.

(a)菌落形態(tài) (b)革蘭氏染色

2.2.2 菌種A1的生理生化特征

進一步地，對菌株A1的生理生化特性進行分析，結(jié)果如表1所示.A1菌株可利用D-葡萄糖、甘露醇和蔗糖，不能利用乳糖和果糖；對淀粉、明膠和酪素均具有水解活性；生理生化檢測結(jié)果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)中的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的菌落形態(tài)和生理生化特性比較接近，初步確定菌株A1為地衣芽孢桿菌.

表1 菌株A1生理生化特性分析

2.2.3 菌種A1的16S rDNA克隆及序列比對分析

以A1菌株基因組為模板，利用16S rRNA引物27F和1 492R進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化得到大小為1 400 bp左右的DNA片段，隨后進行TA克隆并對其進行測序.經(jīng)測序，菌株A1的16S rDNA核苷酸序列大小為1 466 bp，結(jié)果如圖3(a)所示.系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示菌株A1與Bacillus屬中的地衣芽孢桿菌聚于一簇(如圖3(b)所示)，其16S rDNA核苷酸序列與BacilluslicheniformisDSM13(序列號為NR118996.1)、B.licheniformisBCRC11702 (序列號為NR 116023.1)菌株的16S rDNA序列最大相似度為99.93%、與B.subtilisDSM10(序列號為NR 027552.1)、B.nakamuraiNRRLB-41091(序列號為NR 151897.1)、B.amyloliquefaciensBCRC11601(序列號為NR 116022.1)的16S rDNA核苷酸序列相似性較高(98.10%)(如表2所示).

表2 菌株A1 16S rDNA序列比對分析

(a)菌株A1的16S rDNA片段擴增

綜合A1菌株的生理生化特征、形態(tài)學特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析結(jié)果，將菌株A1鑒定為地衣芽孢桿菌(B.licheniformis).微生物對腐殖質(zhì)的降解主要是通過酶作用來實現(xiàn)，研究表明木質(zhì)素酶、漆酶、水解酶、纖維素酶等都具有降解腐殖質(zhì)的能力[17].而地衣芽孢桿菌可合成纖維素酶、漆酶、葡聚糖酶以及多種水解酶，后續(xù)研究可進一步對分離到的A1菌株的產(chǎn)酶特性和腐殖酸降解機制進行深入研究[18,19].目前，文獻報道的可生物轉(zhuǎn)化腐殖酸制備黃腐酸的菌株還有白腐真菌、黃綠青霉和黃桿菌等[17,20,21].

2.3 地衣芽孢桿菌A1生長特性

由圖4可知，菌株A1在LB培養(yǎng)基中的延滯期較短，培養(yǎng)2 h后即開始進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)7 h后進入穩(wěn)定期，最大菌體濃度OD600 nm值達到0.623.

圖4 菌株A1生長曲線

2.4 黑腐酸添加量對黃腐酸含量的影響

首先檢測了底物添加量對菌株A1黃腐酸含量的影響，結(jié)果如圖5所示.可見，隨著黑腐酸濃度的增加，黃腐酸含量逐漸提高；黑腐酸添加量為20 g/L時所得黃腐酸含量最高，達到16.02%.當黑腐酸添加量繼續(xù)提高時，黃腐酸的含量則逐漸降低.可能因為在黑腐酸濃度較低時，底物供應(yīng)量不足，導致黑腐酸的轉(zhuǎn)化率較低，黃腐酸含量低下；當?shù)孜餄舛冗^高時，一方面細菌與黑腐酸作用的有效面積減少，使降解反應(yīng)受到抑制，另一方面培養(yǎng)基的酸度降低，抑制細菌的生長[22,23].因此選取20 g/L黑腐酸添加量進行后續(xù)的發(fā)酵條件優(yōu)化.

圖5 不同黑腐酸添加量對黃腐酸含量的影響(不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05))

2.5 不同碳源對黃腐酸含量的影響

選取淀粉、酵母粉、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖等6種不同類型的碳源等量替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母粉，檢測不同碳源對地衣芽孢桿菌A1轉(zhuǎn)化黑腐酸生產(chǎn)黃腐酸的影響，結(jié)果如圖6所示.

圖6 不同碳源對黃腐酸含量的影響(不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05))

由圖6可知，地衣芽孢桿菌在以蔗糖和甘露醇為碳源時，黃腐酸含量較低，以葡萄糖為碳源時，黃腐酸含量最高，達到19.41%，其次為酵母粉、淀粉、麥芽糖.因此，選取葡萄糖糖為碳源進行后續(xù)的條件優(yōu)化.葡萄糖作為一種可快速利用的單糖，相比其他碳源更易被細菌代謝利用，促進菌體的快速增殖[24,25].但是，對于不同地衣芽孢桿菌菌株或同一菌株進行不同產(chǎn)物合成時，碳源的種類對其產(chǎn)物合成的影響也是不盡相同的[26].

2.6 不同氮源對黃腐酸含量的影響

在最佳碳源的基礎(chǔ)上，選取牛肉膏、玉米粉、尿素、蛋白胨、NH4NO3、KNO3等6種不同類型的氮源等量替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，檢測不同氮源對地衣芽孢桿菌A1轉(zhuǎn)化黑腐酸生產(chǎn)黃腐酸的影響，結(jié)果如圖7所示.由圖7可知，地衣芽孢桿菌在以蛋白胨為氮源時，黃腐酸含量最高，達到19.51%，其次為玉米粉、牛肉膏、尿素.在以硝酸銨和硝酸鉀為氮源時其黃腐酸含量很低.可見，有機氮源比無機氮源更有利于地衣芽孢桿菌利用黑腐酸，可能是由于有機氮源含有豐富的氨基酸和多肽等物質(zhì)，能更好的促進細菌的生長[27].因此，選取蛋白胨為最佳氮源進行后續(xù)的條件優(yōu)化.

圖7 不同氮源對黃腐酸含量的影響(不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05))

2.7 葡萄糖和蛋白胨添加量對黃腐酸生成的影響

在確定最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上，選取不同濃度的葡萄糖和蛋白胨添加至培養(yǎng)基中，檢測葡萄糖和蛋白胨濃度對地衣芽孢桿菌A1轉(zhuǎn)化黑腐酸生產(chǎn)黃腐酸的影響，結(jié)果如圖8所示.由圖8可知，在固定蛋白胨添加量時，黃腐酸含量隨著葡萄糖添加量增高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，添加量為15 g/L時黃腐酸含量為21.41%，如圖8(a)所示.可見，葡萄糖濃度在較低或較高時，黃腐酸含量都有所降低，可能因為在較低濃度時，葡萄糖供應(yīng)不足以保障微生物的碳源和能量的需求；而在葡萄糖含量較高時，會引起培養(yǎng)液滲透壓的增加而影響細胞的正常生長和代謝.因此，選取15 g/L作為葡萄糖的最佳添加量.

進一步地，對蛋白胨的添加量進行優(yōu)化，結(jié)果如圖8(b)所示.黃腐酸含量隨著蛋白胨添加量增高亦呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在添加量為10 g/L時達到最大值23.02%.較低的氮源不能滿足菌體生長和代謝的需求，影響產(chǎn)物的合成量；而較高的氮源供應(yīng)則會導致碳氮比的降低，不利于產(chǎn)物的積累.因此，選擇10 g/L作為蛋白胨的最佳添加量.

(a)葡萄糖添加量對黃腐酸含量的影響

(b)蛋白胨添加量對黃腐酸含量的影響圖8 不同濃度葡萄糖和蛋白胨對黃腐酸含量的影響(不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05))

3 結(jié)論

(1)從土壤中分離篩選出了18株可生物轉(zhuǎn)化黑腐酸產(chǎn)黃腐酸的菌株，并對其中黃腐酸含量最高的菌株A1進行生理生化和分子生物學分析，確定A1菌株為地衣芽孢桿菌.

(2)通過單因素實驗確定了黑腐酸最佳添加濃度為20 g/L.

(3)通過不同碳源和氮源對黃腐酸含量的影響，確定了地衣芽孢桿菌A1利用黑腐酸合成黃腐酸的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為蛋白胨；葡萄糖和蛋白胨的添加量分別為15 g/L和10 g/L時，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速200 rpm，接種量1%時黃腐酸含量從優(yōu)化前的15.88%提高到23.02%.