云南春燥環(huán)境對小鼠氣道黏蛋白MUC5ac、纖毛蛋白DPCD及相關(guān)指標(biāo)影響的研究

宋志敏 林銀驥 魏寧頤 柏靜萍 楊梅

摘要：目的?通過觀察春燥環(huán)境中小鼠黏蛋白MUC5ac、纖毛動力蛋白DPCD等指標(biāo)的變化，探討該環(huán)境對小鼠氣道“纖毛-黏液毯”的影響，并闡述 “燥傷肺津”“肺衛(wèi)失宣”的原理。方法?復(fù)制云南春燥環(huán)境要素施予實驗鼠，并以桑杏湯進行藥物反證。結(jié)果?模型組MUC5ac較正常組顯著減少（P<0.01），桑杏湯組MUC5ac較模型組顯著增加（P<0.05）;各組實驗鼠DPCD的含量由多至少依次：正常組>桑杏湯組>模型組。結(jié)論?云南春燥環(huán)境使小鼠MUC5ac、DPCD含量減少，治燥方藥干預(yù)下有緩解，初步認為氣道MUC5ac、DPCD作為春燥證模型的客觀檢測指標(biāo)有待進一步研究。

關(guān)鍵詞：春燥;以方測證;桑杏湯;黏蛋白MUC5ac;纖毛蛋白DPCP;臟器指數(shù)

中圖分類號：R28?文獻標(biāo)志碼：A?文章編號：1007-2349（2020）08-0063-04

【Abstract】Objective： To observe the changes of mucin MUC5ac and ciliary dynein DPCD in the spring dry environment to explore the effect of the environment on the “ciliary-mucus blanket” of mouse airway and to explain the principle of “dry lung injury” and “l(fā)ung sluggishness”.?Methods： The spring dry environmental elements in Yunnan were copied to apply to experimental mice， and Sangxing Decoction was used to disprove the drug.?Results： MUC5ac in the model group was significantly reduced when compared with that in the normal group （P<0.01）， and MUC5ac in the Sangxing decoction group was significantly increased when compared with that in the model group （P<0.05）.?The DPCD content of the experimental mice in each group was in the order of more to less： normal group>Sangxing decoction group>model group.?Conclusion： The spring dry environment in Yunnan reduces the contents of MUC5ac and DPCD in mice， which can be relieved by the intervention of anti-dryness prescriptions.?The MUC5ac and DPCD of the mouse airway is preliminarily believed as the objective detection indicators of the spring dryness syndrome model and need to be further studied.

【Key words】spring dryness， prescription to test the syndrome， Sangxing Decoction， mucin MUC5ac， fibrillin DPCP， organ index

燥淫證指外感燥邪，耗傷津液，以口鼻、咽喉、皮膚干燥為主要表現(xiàn)的證。多因氣候干燥，或居處干旱少雨之地，感受外界燥邪所致。燥淫證的發(fā)生有明顯的季節(jié)性和地域性。

《素問·五運行大論》認為“西方生燥”、“南方生火”，云南地處西南邊陲，本應(yīng)見溫燥。但是，由于云南大部分地區(qū)具有四季溫差小、晝夜溫差大、春季干旱多風(fēng)之氣候特征。春季之風(fēng)氣與燥氣相兼?zhèn)藙t多發(fā)為風(fēng)燥證。鄭進教授將此燥證稱為“云南春燥[1]”

目前“云南春燥”的實驗研究已有一定前期基礎(chǔ)，本實驗研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，以病因?qū)W為指導(dǎo)，運用氣候箱模擬云南春季“干燥多風(fēng)”的氣候特征，參考本地居民喜食辛辣香燥的飲食特點，將小鼠置于春燥環(huán)境中，通過觀察小鼠各方面變化，分析云南春燥環(huán)境對小鼠模型的影響。以期闡釋“燥勝則干”“燥傷肺津”、“肺衛(wèi)失宣”等中醫(yī)理論，為探索科學(xué)的、合理的、可重復(fù)的云南春燥證動物模型提供依據(jù)。具體研究如下：

1?實驗材料

1.1?實驗動物?30只SPF級KM小鼠，雄性（♂），重量：（20±2）g，供給方為昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗研究中心，生產(chǎn)許可號為SCXK（滇）K2015-0002。實驗場所為云南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心二樓。

1.2?實驗藥劑?桑杏湯：桑葉15 g，南沙參15 g，苦杏仁15 g，浙貝母15 g，梔子皮10 g，雪梨皮20 g，香豆豉10 g;此方源于《溫病條辨》，藥物劑量參考導(dǎo)師楊梅教授治療春燥證的臨床常用量。所用中藥均由正規(guī)渠道購買。

中藥湯劑制備，將藥材用6倍水浸泡15 min，一煎先用武火煎沸，換文火繼續(xù)煎15分鐘，篩出藥汁保存;二煎繼以原藥渣添4倍水，照前法煎10 min，濾渣取汁。將兩煎藥汁混勻加熱，濃縮至所需濃度，置密封容器中放入4℃冰箱內(nèi)保存。根據(jù)人體與小鼠體表面積換算法折算，灌胃小鼠所需要的給藥體積為15 mL/kg。

1.3?實驗儀器與試劑?DPCD多克隆抗體（美國Proteintech公司20936-I-AP）;MUC5ac ELISA試劑盒（美國R&D公司）;抗小鼠GAPDH抗體（美國CST公司 #5174）;PVDF膜（美國Millipore公司R6KA6693A）;BCA Protein Assay Kit、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（江蘇碧云天公司P0010、P0015L）;SpectraMax i3X酶標(biāo)儀（美國MD公司）;電泳儀、Trans-blot轉(zhuǎn)達印槽組件、水平電泳槽（美國Bio-rad公司）;株磨式研磨器（美國Cole-parmer）;紅外雙色激光成像系統(tǒng)（美國LICOR公司）;人工動物培養(yǎng)箱RGX-250（上海印溪儀表儀器有限公司）;超聲波加濕器（中山市哥爾電器有限公司）;離心機（國產(chǎn)湘儀CTK150R）;恒溫水浴鍋（江蘇海門）。

2?實驗方法

2.1?分組?將購入之昆明種雄性小鼠適應(yīng)性觀察培養(yǎng)3 d，隨機將30只小鼠分為3組，每組10只。分別標(biāo)記為正常組、模型組、桑杏湯組。

2.2?干預(yù)條件?3組小鼠分別置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)。正常組全天段設(shè)置溫度為（20±2）℃、濕度為（60±2）%，常規(guī)食料足量飼養(yǎng)，飲水不設(shè)上限，未施予干預(yù)因素。模型組、桑杏湯組2組根據(jù)云南當(dāng)?shù)亟?0年的氣候記錄（由氣象局提供）及晝夜溫差較大的特點，設(shè)置為：每天8∶00～20∶00溫度（23±2）℃、20∶00～次日8點溫度（13±3）℃，相對濕度（30±2）%，風(fēng)速（3±0.5）m/s。飼喂訂制辛燥食料，辛燥食料配比：98%正常食料+1.5%五香粉+0.5%辣椒粉，常規(guī)飲水。3組均每日8∶00～20∶00給予正常光照，墊料用玉米芯，1日1換。自實驗第1 d開始，每日早上9 h，桑杏湯組小鼠予以藥汁灌胃，其余2組不灌胃。各組小鼠飼養(yǎng)至第15 d取材，取材前8～12 h停止食、水供應(yīng)。

2.3?生物表征?自實驗開始，每日觀察記錄各組小鼠活動、情緒、被毛及飲食、飲水等情況。飲食、飲水量計算方法，將每組初始食量均設(shè)置為100 g/d，初始飲水設(shè)為200mL/d，具體如下：

10 g小鼠日食量=〔（100-次日剩存量）/小鼠總質(zhì)量〕×10;

10 g小鼠日水量=〔（200-次日剩存量）/小鼠總質(zhì)量〕×10，每天記錄后，再將食料補充至100 g，用水補充至200mL。

2.4?取材

2.4.1?稱取每只小鼠重量并備錄標(biāo)記，采用頸椎脫臼猝死小鼠，剝離多余組織暴露頸部氣管，選取喉頭向下距離0.5 cm處剪小口，氣管插管，將37℃生理鹽水徐徐注入肺組織1mL，再慢慢回吸，重復(fù)2次，集取肺泡灌洗液，采用離心（離心機設(shè)置為4℃，20 min，2500 r/min）處理，取上清液，獲得樣品標(biāo)本，選擇ELISA法檢測黏蛋白MUC5ac。

2.4.2?剝離組織暴露頸部氣管，裁取1.5cm氣管凍存，采用免疫印跡法（WB）檢測纖毛蛋白DPCD;完全裁開胸腔，暴露并剝?nèi)⊥暾谓M織，用濾紙吸取多余液體，稱肺重并記錄。臟器指數(shù)（肺）=（肺重/體重）×1000 mg/g。

2.5?統(tǒng)計分析?選擇SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)處理，計算結(jié)果選用均數(shù)（x±s）來表達。各組間對比選取單因素方差分析法（One-Way ANOVA）計算數(shù)據(jù)結(jié)果。P<0.05體現(xiàn)為差別具備統(tǒng)計學(xué)意義。

3?結(jié)果

與正常組對比，模型組出現(xiàn)爪甲干枯、皮毛枯槁、尿少色黃、煩躁打斗等情況，且食量顯著降低（P<0.05），飲水顯著增加（P<0.01），肺臟器指數(shù)及MUC5ac含量均明顯降低（P<0.01），差異具統(tǒng)計學(xué)意義;桑杏湯組皮毛爪甲無差別，初期有打斗后期趨于平和，食量、飲水量、肺臟器指數(shù)及MUC5ac含量有改變，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

與模型組對比，桑杏湯組皮毛爪甲光澤，食量增加（P<0.05），飲水量減少（P<0.05），肺臟器指數(shù)及MUC5ac含量均有明顯提高（P<0.05），且具有統(tǒng)計學(xué)意義。詳情見表1。DPCD含量檢測由高至低遞減為：正常組>桑杏湯組>模型組。見圖1。

4?討論

本實驗通過觀察云南春燥環(huán)境下，小鼠模型的生物表征、肺臟器指數(shù)、氣道MUC5ac、DPCD指標(biāo)、以及桑杏湯干預(yù)后的變化等情況，探討云南春燥環(huán)境對小鼠模型的影響。

4.1?春燥環(huán)境對小鼠表征及臟器指數(shù)之影響?實驗結(jié)果顯示，模型組飲食量明顯降低，飲水量顯著增加，小便量少而黃，爪甲干枯，肺臟器指數(shù)降低，并見暴躁不安、焦慮打斗等現(xiàn)象。《素問玄機原病式》曰：“諸澀枯涸，干勁揭皴，皆屬于燥?！闭f明燥傷津液，燥勝則干，小鼠津液損傷，故飲水自救則見飲水增加，尿源虧乏則見尿少;肺燥津傷，無以宣發(fā)津液于皮毛，皮毛失卻潤養(yǎng)，則見皮毛四末干枯無光澤;燥傷胃津，胃腑失潤，受納失司，則見食量減少。如張子和所云：“燥于外則皮膚皺揭，燥于中則精血枯涸，燥于上則咽鼻焦干[2]”。臟器指數(shù)能夠反應(yīng)機體某一內(nèi)臟的損害水平[3-4]，肺喜潤惡燥，燥邪侵入，首先犯肺，肺津枯槁，故肺臟器指數(shù)下降;春季木升肝旺，風(fēng)、燥之邪兼夾而入，風(fēng)勝則動，故小鼠在干燥表征的基礎(chǔ)上又見暴躁不安、焦慮打斗等肝陽亢盛之行為?？傊?，上述現(xiàn)象，皆因風(fēng)燥入侵，逢喜食辛燥之體，致使機體津傷液耗，肺絡(luò)損傷，外傷內(nèi)耗，上輸外布無源所致。提示春燥環(huán)境對小鼠的宏觀體征及部分內(nèi)臟組織存在顯著影響。前期研究中，始終將小鼠生物表征作為小鼠的證候表現(xiàn)來進行觀察，其也是本實驗擬定實驗周期的主要依據(jù)之一。

4.2?春燥環(huán)境對小鼠氣道MUC5ac、DPCD的影響現(xiàn)代研究認為，氣道為氣體交換的介質(zhì)，氣道黏液披覆在氣道表層，纖毛浸潤在其中，兩者相輔構(gòu)成“纖毛-黏液毯”[5]?！袄w毛-黏液毯”具有保護和濡潤上皮、吸附外界有害刺激物、防止病原菌異常繁殖等能力。其中，氣道黏液是由水和細胞中黏蛋白共同組成的一類非均衡濃度的液膠。黏液的黏度和韌性是由黏蛋白的類型和含量決定[6]，黏蛋白MUC5ac是構(gòu)成黏液的關(guān)鍵成分之一。MUC5ac變動提示氣道黏液性狀的改變[7]，能夠反映黏蛋白的分泌程度[8]。纖毛蛋白DPCD是纖毛動力蛋白，在纖毛細胞中高表達。纖毛缺損相關(guān)蛋白會致使纖毛結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，出現(xiàn)氣道黏液清除能力降低[9]。故“纖毛-黏液毯”的免疫功能有賴于黏液性狀和纖毛動力學(xué)，兩者任一改變都會產(chǎn)生明顯影響[10]。本實驗研究選取MUC5ac、DPCD作為判斷“纖毛-黏液毯”功能的指標(biāo)，以期從分子水平探究春燥環(huán)境對小鼠模型的影響。而“纖毛-黏液毯”的免疫功能與中醫(yī)“肺衛(wèi)宣發(fā)”功能有異曲同工之處。

本實驗結(jié)果顯示，模型組MUC5ac、DPCD含量明顯低于正常組，提示黏膜黏液耗傷、纖毛運動受阻，“纖毛-黏液毯”抗邪功能下降。俞嘉言曰：“燥氣先傷上焦華蓋[11]”，即燥邪犯肺，肺燥津傷，衛(wèi)氣失宣，衛(wèi)外功能下降。桑杏湯組MUC5ac、DPCD含量明顯高于模型組，則提示桑杏湯對于防止黏膜黏液耗傷、纖毛運動受阻有促進作用。桑杏湯是治療燥證的經(jīng)典方，具有疏散風(fēng)邪，生津潤燥功能。對于風(fēng)燥證，用之則風(fēng)邪得疏，燥邪得散，津液得生，干燥得潤，肺能宣發(fā)，衛(wèi)表得固，機體防御能力得以提升，故療效明顯。本實驗運用桑杏湯旨在反證本實驗之小鼠模型是否符合春燥證。

綜上所述，本實驗從宏觀體征（生物表征）、組織結(jié)構(gòu)（肺臟器指數(shù)）、分子水平（氣道MUC5ac、DPCD）三個層面對春燥環(huán)境下的小鼠模型進行了初步探究。結(jié)果顯示，小鼠出現(xiàn)明顯干燥少津的表征，肺臟器指數(shù)下降，氣道黏蛋白MUC5ac、纖毛蛋白DPCP顯著變化，初步提示春燥環(huán)境對小鼠存在不同層面的損傷。同時闡釋了中醫(yī)“燥勝則干”、“肺燥津傷”、“肺衛(wèi)失宣”之燥證機理。有鑒于此，筆者認為，本實驗小鼠模型與云南春燥證契合度較大，氣道MUC5ac、DPCD可作為春燥證模型的客觀檢測指標(biāo)，有待進行全面、深入的探究。

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（收稿日期：2020-04-01）