豚草粗提物對楊樹水泡型潰瘍病的抑菌作用研究

矯麗曼 彭儒勝 馮連榮 李曉宇 趙大根 張妍 紀(jì)純陽

摘 ?要：為解決豚草提取物在林業(yè)病蟲害防治中的推廣與應(yīng)用問題，以豚草葉片為試驗(yàn)材料，采用溫浸-超聲波聯(lián)合提取法提取抑菌活性物質(zhì)，并開展其對楊樹水泡型潰瘍病病原菌的室內(nèi)外抑菌試驗(yàn)。室內(nèi)抑菌試驗(yàn)表明，粗提物濃度為16 mg/mL時，抑菌率達(dá)到73.62%;林間防治試驗(yàn)表明，最小抑菌濃度為 ?40 mg/mL，抑菌率達(dá)到95.14%。通過以上抑菌試驗(yàn)確定豚草粗提物對楊樹水泡型潰瘍病有較好的抑制效果。

關(guān)鍵詞：豚草;楊樹;水泡型潰瘍病;抑菌率;林間防治

中圖分類號：S763.11 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?論文編號：cjas20200300043

Abstract： In order to solve the problem of popularization and application of Ambrosia artemisiifolia extract in the prevention and control of forest diseases and insect pests， A. artemisiifolia leaves were used as the experimental materials， and the antibacterial active substances were extracted by the method of warm soaking and ultrasonic extraction. In addition， the indoor and outdoor bacteriostatic tests of the extracts against the pathogen of poplar Botryosphaeria dothidea were carried out. Indoor bacteriostatic test showed that the bacteriostatic rate reached 73.62% when the concentration of crude extract was 16 mg/mL. Field control test showed that the minimum bacteriostatic concentration was 40 mg/mL， and the bacteriostatic rate reached 95.14%. The above results show that the crude extract of A. artemisiifolia has a good inhibitory effect on poplar B. dothidea.

Keywords： Ambrosia artemisiifolia; Poplar; Botryosphaeria dothidea; Bacteriostatic Rate; Forest Control

0 ?引言

豚草（Ambrosia artemisiifolia）屬菊科（Compositae）豚草屬（Ambrosia），又名艾葉破布草、美洲艾，一年生草本植物，原產(chǎn)于美國，20世紀(jì)30年代初傳入中國東部沿海，現(xiàn)在國內(nèi)廣泛分布[1-2]。豚草是國內(nèi)第一批被列為已形成嚴(yán)重危害的外來入侵物種之一，它侵入農(nóng)田、果園、城鎮(zhèn)、綠化帶和公路沿線，對當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境和人畜健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。同時豚草花粉極易引起過敏反應(yīng)，極低濃度會對敏感者造成鼻炎和少數(shù)皮膚炎及蕁麻疹等過敏反應(yīng)，濃度稍高就會對過敏者產(chǎn)生長期過敏反應(yīng)[3-4]。許多學(xué)者對豚草進(jìn)行了各方面的研究，主要包括分類學(xué)、形態(tài)學(xué)、生理生態(tài)學(xué)、種群生態(tài)學(xué)等，證實(shí)其含有豐富的倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有化感、殺蟲抑菌、滅螺等多種生物活性[5-7]。

楊樹潰瘍病是危害楊樹最嚴(yán)重的病害之一，苗木、幼樹、大樹均可受到該病的侵害，是阻礙楊樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一[8-9]，一般可將楊樹潰瘍病分為水泡型和大斑型2種類型[10-11]。楊樹潰瘍病常采用化學(xué)農(nóng)藥防治，不僅對樹木本身造成傷害，還污染林木周圍的生態(tài)環(huán)境。

豚草作為一種新型植物源農(nóng)藥的植物資源，在楊樹病蟲害方面應(yīng)用較少，尤其在楊樹潰瘍病防治方面還未見報道。筆者開展豚草粗提物對楊樹水泡型潰瘍病的抑制作用研究，以期為新型植物源農(nóng)藥的開發(fā)提供前期的理論基礎(chǔ)，為推進(jìn)植物源農(nóng)藥在林木病蟲害防治中的應(yīng)用與推廣提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?植物材料

豚草采自遼寧省蓋州市高麗城和西海等地區(qū)。新林1號楊植于國有新民機(jī)械化林場林地內(nèi)，5年生，密度4 m×6 m。

1.2 ?試驗(yàn)菌株

楊樹水泡型潰瘍病菌株購自中國林業(yè)科學(xué)院林業(yè)菌種保存中心，編號為8090。

1.3 ?豚草葉片的預(yù)處理

將采集的豚草葉片用清水洗凈，放于通風(fēng)陰涼處陰干，再用50℃烘箱烘干至恒重后，用中藥材粉碎機(jī)粉碎1 min，稱重分裝于棕色試劑瓶中，放于陰涼處保存?zhèn)溆肹12-13]。

1.4 ?室內(nèi)抑菌試驗(yàn)

1.4.1 ?豚草粗提物的提取 ?采用溫浸-超聲波聯(lián)合提取法從豚草葉片中提取活性物質(zhì)。稱取10 g豚草葉片粉末加入到500 mL燒杯中，加入75%的乙醇溶液200 mL，用塑料膜封口，超聲波45 min，40℃水浴24 h。取出樣品，進(jìn)行真空抽濾。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（40℃，80～ ? ? ? ?120 r/min）減壓濃縮，濃縮直至無溶劑滴出，即得膏狀的粗提物，將其轉(zhuǎn)移至小燒杯或平皿中，于40℃烘箱中烘干稱重，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹14-15]。

1.4.2 ?含豚草粗提物培養(yǎng)基的制備 ?楊樹水泡型潰瘍病病原菌的培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，稱取去皮的土豆200 g，加入1000 mL蒸餾水中，水煮30 min，中間用玻璃棒攪拌，用4層紗布過濾，將濾液定容至1000 mL，加入瓊脂和糖各20 g，加熱至完全溶解，分裝于三角瓶中，每瓶裝90 mL，121℃滅菌30 min[16]。

滅好菌的培養(yǎng)基趁熱放于無菌的超凈工作臺中，當(dāng)培養(yǎng)基的溫度降至40℃左右時，將各濃度梯度的豚草粗提物溶液10 mL分別加入培養(yǎng)基中，以加水為空白對照，使其終濃度分別為0、0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0 mg/mL，混合均勻后每瓶倒3個平皿，待培養(yǎng)基冷卻后得到含不同濃度的豚草粗提物PDA培養(yǎng)基[17]。

1.4.3 ?接種 ?在無菌條件下，用直徑6 mm的無菌打孔器在預(yù)先培養(yǎng)好的楊樹潰瘍病病原菌菌株平面上打孔，打成圓形的菌絲片，用無菌鑷子夾取菌絲片放于含豚草粗提物的培養(yǎng)基中，每皿接種1塊，用封口膜封好，放于25℃的生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[18-19]。

1.5 ?林間防治試驗(yàn)

林間防治試驗(yàn)地點(diǎn)位于遼寧省新民市國有機(jī)械化林場，新林1號楊為自然發(fā)病。對樹干下部1.5 m以下水泡型潰瘍病病斑進(jìn)行小范圍的防治試驗(yàn)。將豚草粗提物配制成20、40、80、120 mg/mL濃度的溶液，用鋼絲刷劃破病斑外皮，用刷子涂抹各濃度的粗提物溶液，同時以5%的純堿溶液為對照，選取3個連續(xù)區(qū)域，每個區(qū)域60棵樹，每個處理10棵，每隔2天觀察一次病斑的變化情況，通過統(tǒng)計(jì)分析確定防治效果，得到適宜的抑菌濃度[20-22]。

1.6 ?統(tǒng)計(jì)方法

1.6.1 ?室內(nèi)統(tǒng)計(jì)方法 ?采用生長速率法測定菌絲生長抑菌率。培養(yǎng)的菌絲，每12 h觀察一次菌絲的生長情況，用十字交叉法測量菌落直徑，取2次的平均值，計(jì)算抑菌率[23-24]，如式（1）～（2）。

[抑菌率=對照生長直徑-處理生長直徑對照生長直徑×100%]…（1）

生長直徑=測量直徑的平均值-菌絲片的直徑（6 mm）…（2）

1.6.2 ?林間統(tǒng)計(jì)方法 ?每2天觀察一次病斑的變化，統(tǒng)計(jì)病斑的抑制情況，計(jì)算出平均抑菌率[25-26]，如式（3）。

[抑菌率=抑菌病斑數(shù)處理病斑數(shù)×100%]…（3）

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果

通過試驗(yàn)得到不同濃度的豚草粗提物對楊樹水泡型潰瘍病有較好的抑菌作用，并隨濃度的增加而增大。潰瘍病的病原菌菌絲生長快，不同觀察統(tǒng)計(jì)時間其各濃度的抑菌率見表1。豚草粗提物抑菌濃度為 ? 8 mg/mL時，平均抑菌率為60.56%;濃度為16 mg/mL時，抑菌率達(dá)到73.62%，因此豚草粗提物對楊樹水泡型潰瘍病病原菌有明顯的抑菌效果。菌絲生長情況見圖1，對照菌落菌絲向外延伸至平皿邊緣，而豚草粗提物抑制后的菌落菌絲延伸很小，都未產(chǎn)生孢子，菌落為白色。

2.2 ?林間防治試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)室內(nèi)的試驗(yàn)結(jié)果，需要增大豚草粗提物的濃度才能達(dá)到更好的抑菌效果，設(shè)置了20、40、80、 ? ? 120 mg/mL 4個濃度的豚草粗提物溶液。不同濃度提取物對楊樹水泡型潰瘍病的林間防治效果都達(dá)到85%以上（表2），對照的抑菌率為90.14%，粗提物濃度為20 mg/mL抑菌率低于對照，其他濃度的抑菌率高于對照組，均達(dá)到95%以上。抑菌效果隨著豚草粗提物濃度的增加而緩慢增大，從藥劑使用量和抑菌效果綜合考慮，林間防治楊樹水泡型潰瘍病的最小粗提物濃度為40 mg/mL。防治效果見圖2。

3 ?結(jié)論與討論

室內(nèi)外的抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豚草粗提物對楊樹水泡型潰瘍病有較好的抑菌效果，抑菌率隨著粗提物濃度的增加而增大。室內(nèi)抑菌試驗(yàn)，當(dāng)濃度達(dá)到16 mg/mL時，抑菌率達(dá)到73.62%;林間防治試驗(yàn)，確定最小的抑菌濃度為40 mg/mL，抑菌率達(dá)到95.14%。林間防治試驗(yàn)在室內(nèi)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上加大了豚草粗提物的濃度，得到較高的抑菌率。

本研究是植物源農(nóng)藥豚草提取物防治楊樹潰瘍病的嘗試性試驗(yàn)，今后還要開展豚草粗提物與廣譜殺菌劑的抑菌效果比較，需進(jìn)一步對豚草粗提物的藥效成分及作用機(jī)理進(jìn)行研究，為研究開發(fā)林業(yè)用植物源抑菌劑提供更多理論依據(jù)，為確定用于生產(chǎn)和防治工作的新型植物源農(nóng)藥提供前期研究基礎(chǔ)，使豚草這種入侵植物變廢為寶，推進(jìn)無公害農(nóng)藥的研究和應(yīng)用。

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