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    地衣芽孢桿菌的分離和鑒定

    2020-10-12 14:15:09布帕提買(mǎi)木·麥麥提潘姣姣阿迪萊·卡哈曼伍麥爾·麥海提陳薈旭張秋林李蓮瑞
    農(nóng)業(yè)與技術(shù) 2020年17期
    關(guān)鍵詞:芽孢菌落平板

    布帕提買(mǎi)木·麥麥提 潘姣姣 阿迪萊·卡哈曼 伍麥爾·麥海提陳薈旭 張秋林 李蓮瑞

    摘 要:為了從土壤中分離得到地衣芽孢桿菌,開(kāi)展后續(xù)研究,試驗(yàn)采集塔里木盆地的土壤進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),采用臺(tái)盼藍(lán)平板方法,對(duì)分離培養(yǎng)得到的單菌落進(jìn)行生物學(xué)特性研究、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA鑒定。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,初步鑒定為芽孢桿菌,提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送測(cè)序。結(jié)果表明,從塔里木盆地土壤中分離得到的細(xì)菌為地衣芽孢桿菌,說(shuō)明該土壤中存在地衣芽孢桿菌,并為后續(xù)進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:土壤;分離和鑒定;16S rDNA;地衣芽孢桿菌

    中圖分類(lèi)號(hào):S-3

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    DOI:10.19754/j.nyyjs.20200915005

    收稿日期:2020-08-17

    基金項(xiàng)目:大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):201810757029)

    作者簡(jiǎn)介:布帕提買(mǎi)木·麥麥提(1996-),女,碩士在讀。研究方向:動(dòng)物性食品衛(wèi)生與安全;通信作者李蓮瑞(1968-),女,博士,教授。研究方向:動(dòng)物性食品衛(wèi)生與安全。

    地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)為革蘭氏陽(yáng)性菌,廣泛分布于微生物混合培養(yǎng)物中[1]。呈桿狀,芽孢為橢圓形,孢囊稍膨大,為非致病性菌,細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度約為50℃,酶的最適生長(zhǎng)溫度為37℃。地衣芽胞桿菌耐熱、含酶量多、產(chǎn)酶量高的優(yōu)良特性被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中,主要用來(lái)生產(chǎn)淀粉酶[2]及蛋白酶[3]。芽孢桿菌具有耐酸、耐鹽、耐高溫等特點(diǎn),這使得其可以在條件不利的情況下形成芽孢,自我保護(hù),并在環(huán)境適宜的條件下復(fù)活。地衣芽孢桿菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生多種酶和活性物質(zhì),具有益生保健[4],降解農(nóng)藥[5]和凈化水體[6]的作用。為了解塔里木盆地土壤中是否存在地衣芽孢桿菌,本試驗(yàn)從塔里木盆地的1份土壤中篩選出1株鏡檢有芽孢的單菌落,對(duì)該菌株進(jìn)行分離純化,經(jīng)過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定、16S rDNA基因測(cè)序,最終鑒定為地衣芽孢桿菌,且為后續(xù)開(kāi)展地衣芽孢桿菌的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

    1?材料

    1.1?樣品采集

    新疆塔里木大學(xué)校園肥沃菜地距地表20~80cm土樣。

    1.2?主要試驗(yàn)儀器

    恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)為GHP-9080),購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;小型臺(tái)式高速離心機(jī)(型號(hào)為Eppendorf 5453),購(gòu)自北京創(chuàng)世云博科技發(fā)展有限公司;潔凈工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-2ED),購(gòu)自上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司;顯微鏡(型號(hào)為尼康 ECLIPSE Ci-L),購(gòu)自成貫儀器(上海)有限公司;搖床(型號(hào)為ZWY-2102C),購(gòu)自濟(jì)南宇晗醫(yī)療器械有限公司;加熱制冷循環(huán)器(型號(hào)為JULABO Labortechnik GmbH F12),購(gòu)自?xún)?yōu)萊博技術(shù)(北京)有限公司。

    1.3?試驗(yàn)藥品

    鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、明膠、氯化鈉、七水硫酸鎂、淀粉、硫酸銨、盧哥氏碘液、硝酸鉀、格里斯亞硝酸鹽試劑、0.04%酚紅、Ehrlish試劑、二甲苯、DL-苯丙氨酸、10%氯化鐵、磷酸二氫銨、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、0.1%酪氨酸、臺(tái)盼藍(lán)、瓊脂粉、酵母粉、酵母膏、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、濃鹽酸、可溶性淀粉,均為國(guó)產(chǎn);牛肉浸粉、牛肉膏、蛋白胨,均購(gòu)自Sigma公司。

    2?方法

    2.1?細(xì)菌的分離處理

    2.1.1?制樣品稀釋液

    取樣品土壤500g置于80℃烘箱中烘烤24h,過(guò)篩,稱(chēng)取150g土壤放入燒杯中,加水至350mL,煮沸15min,過(guò)濾,取濾液,制成1∶10濃度的懸液。另取裝有無(wú)菌水的試管6支,編號(hào)10-1、10-2、10-3、10-4,10-5、10-6進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)迫?00μL 10-1管中土壤懸液于10-2管中混勻,然后移取500 μL 10-2管中土壤懸液于10-3管中混勻,直至稀釋到10-6管,另取500μL 10-6管中液體棄去。

    2.1.2?培養(yǎng)

    從10-4、10-5、10-6管的稀釋液中取150μL滴加到臺(tái)盼藍(lán)選擇培養(yǎng)基平板上,用涂布棒均勻涂布,并將培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)于37℃恒溫箱中,培養(yǎng)24h。

    2.1.3?分離單菌落

    挑取有透明圈的單菌落,接種于滅菌的LB液體培養(yǎng)基中,置于37℃,180rpm搖床中培養(yǎng)6h。

    2.1.4?純化

    采用平板涂布法,用微量移液器分別移取20μL、50μL、100μL、150μL、200μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng)24h,并重復(fù)此步驟多次達(dá)到純化。

    2.2?生物學(xué)特性研究

    2.2.1?菌落培養(yǎng)特征

    在臺(tái)盼藍(lán)選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),觀察并記錄。

    2.2.2?菌體形態(tài)觀察

    挑取培養(yǎng)的單菌落,進(jìn)行革蘭染色與孔雀石綠染色,鏡檢,觀察形態(tài)。

    2.2.3?革蘭染色[7]

    用接種環(huán)挑取LB平板上生長(zhǎng)的單菌落,在滴有蒸餾水的載玻片上均勻涂開(kāi),將涂好的玻片用酒精燈火焰固定,在涂片處用結(jié)晶紫染色液處理1min,用水沖洗干凈;碘液處理1min,用水沖洗干凈;95%的乙醇脫色處理30s,用水沖洗干凈;沙黃復(fù)染15s,用水沖凈,烘干,油鏡下觀察。

    2.2.4?孔雀石綠染色[8]

    切片用飽和的孔雀石綠水溶液染10min,蒸餾水沖洗;0.5%番紅復(fù)染30s;水洗,吸干;鏡檢,芽孢呈綠色,菌體和芽孢囊呈微紅色。

    2.2.5?血平板試驗(yàn)

    采用新疆多浪綿羊血制作血平板,將菌株接種于血平板上,觀察溶血現(xiàn)象。

    2.3?細(xì)菌的生化鑒定

    地衣芽孢桿菌鑒定參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]的方法,對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

    2.3.1?檸檬酸鹽利用試驗(yàn)

    無(wú)菌條件下,將單菌落接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)3~7d,觀察顏色變化。

    2.3.2?丙酸鹽利用試驗(yàn)

    將菌種劃線(xiàn)接種于丙酸鹽培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng),連續(xù)3代移種,觀察顏色變化。

    2.3.3?淀粉水解試驗(yàn)

    用接種環(huán)取菌種涂布在培養(yǎng)基表面,37℃恒溫培養(yǎng)24~48h,取出后滴加碘液,觀察菌落周?chē)兓?/p>

    2.3.4?卵黃卵磷脂酶試驗(yàn)

    接種環(huán)取少量幼齡菌種(培養(yǎng)18~24h)涂布于卵黃卵磷脂酶平板上,37℃恒溫培養(yǎng)24~48h,觀察菌落四周是否出現(xiàn)不透明區(qū)。

    2.3.5?硝酸鹽還原試驗(yàn)

    取純培養(yǎng)物接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)18~24h,加入試劑3~5滴,30s內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。

    2.3.6?吲哚試驗(yàn)

    將菌種接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)24h后,取出加入2mL二甲苯,搖勻靜置,沿試管壁緩慢加入Ehrlish試劑2mL,靜置,觀察顏色變化。

    2.4?地衣芽孢桿菌16S rDNA的鑒定

    2.4.1?基因組DNA的提取

    細(xì)菌DNA提取方法按照北京全式金生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒(M10208)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

    2.4.2?16S rDNA基因擴(kuò)增

    選擇通用引物擴(kuò)增芽孢桿菌16S rDNA的全長(zhǎng)序列。細(xì)菌通用引物序列為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:DNA模板1μL;上游引物和下游引物各1μL;EasyTaq Super Mix 25μL,加入ddH2O補(bǔ)至50μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火30s;72℃延伸90s;35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。

    2.4.3?純化和測(cè)序

    PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD19-T載體連接,送由北京天一輝遠(yuǎn)有限公司測(cè)序,將測(cè)定的序列通過(guò)NCBI/BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì),確定其具體的菌屬。

    3?結(jié)果與分析

    3.1?細(xì)菌的培養(yǎng)

    對(duì)菌液用無(wú)菌水分別進(jìn)行6個(gè)梯度稀釋?zhuān)糜谂_(tái)盼藍(lán)篩選平板上。結(jié)果表明,隨著稀釋倍數(shù)的增大平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)減少,逐漸出現(xiàn)單菌落。

    3.2?細(xì)菌形態(tài)

    挑取白色透明圈的單菌落,進(jìn)行革蘭染色,鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖1,待檢菌革蘭染色呈陽(yáng)性,菌體呈直桿狀,兩端鈍圓??兹甘G染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖2。

    3.3?菌落形態(tài)及血平板毒力測(cè)試

    將該菌接種于LB固體培養(yǎng)基上,觀察菌落呈圓形、扁平、表面粗糙,邊緣不整齊,灰白不透明,培養(yǎng)24h后菌落趨于相互融合,菌苔表面出現(xiàn)山丘狀和裂葉狀(見(jiàn)圖3);將該菌劃線(xiàn)接種于血平板上,培養(yǎng)24h后,未出現(xiàn)溶血環(huán),觀察落菌形態(tài)邊緣光滑,不規(guī)則,表面濕潤(rùn),無(wú)透明或不透明的灰白色小菌落(見(jiàn)圖4)。

    3.4?生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果

    3.4.1?丙酸鹽利用、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    在丙酸鹽利用試驗(yàn)中,將菌種劃線(xiàn)接種于丙酸鹽培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基變藍(lán),實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性;在檸檬酸鹽的利用試驗(yàn)中,適溫培養(yǎng)4d后,培養(yǎng)基對(duì)光旋轉(zhuǎn)呈藍(lán)色,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

    3.4.2?淀粉、卵黃卵磷脂、硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果

    將該菌接種于淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,滴加碘液,菌落周?chē)霈F(xiàn)不變色透明圈,淀粉水解呈陽(yáng)性;將該菌接種到卵黃卵磷脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,觀察菌落四周有渾濁環(huán)出現(xiàn),表示卵磷脂分解成脂肪,說(shuō)明分離純化的菌株中含有卵磷脂酶;將該菌接種到硝酸鹽還原為亞硝酸鹽培養(yǎng)基24h后,滴加試劑,30s內(nèi)出現(xiàn)紅色,表明該菌能將硝酸鹽還原;將該菌接種到吲哚培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)24h后,取出加入二甲苯和Ehrlish試劑,培養(yǎng)基不變色,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

    3.4.3?生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

    淀粉水解試驗(yàn)、丙酸鹽利用試驗(yàn)、卵黃卵磷脂酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)等生物化學(xué)試驗(yàn)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

    3.5?16S rDNA的鑒定結(jié)果

    3.5.1 16S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果

    由圖5可以看出,成功擴(kuò)增了該菌的16S rDNA的基因序列。

    3.5.2?16S rDNA克隆鑒定結(jié)果

    該細(xì)菌16S rDNA的基因序列與pMD19-T連接后轉(zhuǎn)化DH5α,提取質(zhì)粒送測(cè)序,陽(yáng)性克隆鑒定如圖6。

    3.5.3?16S rDNA的序列進(jìn)化樹(shù)同源性分析結(jié)果

    將測(cè)序所得序列去掉相關(guān)的載體序列后,得到該菌的全長(zhǎng)16S rDNA序列信息。該菌株的16S rDNA長(zhǎng)度為1500bp,將其結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核酸比對(duì)后,建立進(jìn)化樹(shù)。分析表明,該菌株與登錄號(hào)為KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢桿菌處于同一分支,且根據(jù)同源性分析,該菌株與登錄號(hào)為KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢桿菌同源性為100%,進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖7,同源性比較見(jiàn)表2。根據(jù)上述結(jié)果,可以確定該菌株為地衣芽孢桿菌。

    4?結(jié)論與討論

    面對(duì)土壤中龐大的微生物群體,通過(guò)對(duì)一份土壤進(jìn)行高溫烘烤處理,培養(yǎng)獲得單菌落,取該菌落在臺(tái)盼藍(lán)平板上培養(yǎng),反復(fù)純化,最終挑選長(zhǎng)出白色透明圈的菌落作為實(shí)驗(yàn)出發(fā)用菌,進(jìn)行革蘭染色和孔雀石綠染色鏡檢后,觀察細(xì)菌形態(tài)呈桿狀,兩端鈍圓,芽孢中生,孢囊稍膨大,確定分離得到1株芽孢桿菌。通過(guò)參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,又結(jié)合地衣芽孢桿菌所特有的能夠利用丙酸鹽的特性,初步鑒定為地衣芽孢桿菌。

    同時(shí),對(duì)該菌進(jìn)行檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等一系列的生化鑒定試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,該菌具備地衣芽孢桿菌的不可形成吲哚、不可水解酪氨酸、不具有苯丙氨酸脫氫酶的生化特征,由此可以初步斷定該菌為地衣芽孢桿菌。最終通過(guò)對(duì)該菌進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、純化及測(cè)序,將其16S rDNA基因序列信息進(jìn)行建立進(jìn)化樹(shù)及同源性分析,進(jìn)一步確定該菌為地衣芽孢桿菌。

    地衣芽孢桿菌在較高溫度下仍能生長(zhǎng)繁殖,并且能夠產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶,對(duì)有些有害菌如葡萄球菌、白色念珠菌具有明顯的抑制作用。然而,近年來(lái)對(duì)地衣芽孢桿菌的研究進(jìn)展仍報(bào)道得比較少,雖已證實(shí)其擁有良好的使用效果,但具體作用機(jī)理機(jī)制尚不明確,且其研究主要集中在抗菌特性方面,未來(lái)可利用基因工程將該菌的優(yōu)良特性與其它菌結(jié)合,構(gòu)建和表達(dá)出一種更優(yōu)良的基因,并將其應(yīng)用到更加廣泛的領(lǐng)域中。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步豐富了我國(guó)地衣芽孢桿菌的研究進(jìn)展,為地衣芽孢桿菌的進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn)

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    (責(zé)任編輯?周康)

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