HER2與膀胱尿路上皮癌臨床病理分子分型的相關性

王婧婧，吳 景，尹恬恬，何 杰，

（1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院//中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院，安徽合肥 230031；2.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院臨床病理中心，安徽合肥 230031）

膀胱尿路上皮癌（urothelial bladder cancer，UBC）是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第2位的泌尿系惡性腫瘤，初次診斷時，約有75%的患者為非肌層浸潤膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC），20%的患者為肌層浸潤膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC），5%的患者為轉移性UBC［1］。UBC具有異質(zhì)性，在同一臨床分期病理分級的患者中常?？梢杂^察到不同的臨床結局［2］，迫切需要個體化治療。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）根據(jù)基因表達譜等信息獲得了MIBC的兩種內(nèi)在的分子亞型，即管腔型和基底/鱗狀型［3］。Hedegaard 等［2］發(fā)現(xiàn)該分子分型對NMIBC 同樣適用。管腔型UBC 主要表達尿路上皮分化標記如CK20、GATA3 等；基底/鱗狀型UBC 主要表達鱗狀分化標記CK5/6 和CK14 等［2-4］。管腔型和基底/鱗狀型UBC 具有不同的預后和治療意義，類似于乳腺癌［2］。對臨床病理分子分型的研究將有助于理解UBC 的生物學行為，在UBC 患者的預后判斷和個體化治療方面有重要的臨床價值。人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是受體酪氨酸激酶類原癌基因，在多種惡性腫瘤中可檢測到HER2 蛋白高表達，且表達水平越高，腫瘤的侵襲性越高，預后越差［5］。在HER2陽性的乳腺癌、胃癌中，HER2靶向治療聯(lián)合化療已成為標準的一線治療方案［6］。UBC暫無統(tǒng)一的HER2 判讀標準，基本都參考乳腺癌HER2 評估指南［7-8］。研究結果表明0%～59%的UBC 存在HER2基因擴增，0%～89%的UBC存在HER2蛋白過表達［9-11］。一些病例報告HER2過表達的晚期UBC患者經(jīng)曲妥珠單抗聯(lián)合化療獲得了持久的完全緩解［12］。然而已經(jīng)開展的幾項HER2 靶向治療MIBC的臨床試驗并未取得療效的共識［6，13］。療效的差異可能與UBC 內(nèi)在的異質(zhì)性有關，僅以HER2 預測患者對靶向治療的反應或許是不夠的，可能需要結合UBC 的分子分型。本文是國內(nèi)首篇探討HER2與UBC 的臨床病理分子分型的相關性的論著。

1 材料與方法

1.1 患者和組織樣本

收集了中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院臨床病理中心2015年至2019年359例病理診斷為UBC的病例，排除高級別與低級別共存或伴有組織學變異的病例，排除伴有其他部位原發(fā)惡性腫瘤的病例，最終納入50例浸潤性UBC 和20例非浸潤性UBC 病例。本研究已獲患者知情同意，并通過本單位倫理委員會批準實施。非浸潤性UBC 的手術標本類型有TURBT、膀胱部分切除術和膀胱根治術，浸潤性UBC 的手術標本類型有膀胱部分切除術和膀胱根治術。收集了患者的性別、年齡、病理組織學診斷與分級、腫瘤最大徑、肌層浸潤、脈管侵犯、局部淋巴結轉移和臨床分期的數(shù)據(jù)。

1.2 免疫組織化學

所有病例均選取組織學形態(tài)具有代表性的切片。每個病例采用IHC 檢測HER2 蛋白表達，50例浸潤性UBC采用IHC檢測管腔型標記（CK20、GATA3）、基底/鱗狀型標記（CK14、CK5/6）和Ki67蛋白表達。IHC 使用全自動免疫組織化學染色儀（ventana bechmark XT，ROCHE，美國）進行。所有切片均設置陽性對照，癌旁正常膀胱尿路上皮、淋巴細胞和血管作為陰性內(nèi)對照。表1 列出了IHC使用的所有抗體。

本研究的HER2 檢測根據(jù)2018 年ASCO/CAP乳腺癌HER2 評估指南進行［7］，結合染色強度和染色細胞百分比對HER2 蛋白的表達分級如下，0 為無著色或≤10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細胞膜染色；1+為>10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細胞膜染色；2+有兩種情況，第1 種為> 10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)弱-中等的完整細胞膜染色，第2 種為≤10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)強而完整的細胞膜染色；3+為> 10%的浸潤癌細胞呈現(xiàn)強、完整且均勻的細胞膜染色。對于特殊的基底及側膜U 型染色模式若呈現(xiàn)弱-中等強度的細胞膜染色，應判為HER2 2+，若浸潤癌的細胞膜已呈很深的棕褐色U 型染色，可等同于完整的細胞膜染色。半定量評分0～1+為HER2 蛋白陰性；2+～3+為HER2蛋白陽性。

Ki-67 的評估為高倍鏡下計數(shù)超過500 個腫瘤細胞，計數(shù)腫瘤細胞核中Ki-67 著色的百分比而不論著色強度。所有其他標記根據(jù)Remmele 和Stegner的免疫反應評分（immunoreactive score，IRS）分析［14］，得到染色細胞百分比得分（0=0，1=10%，2=10%～50%，3=51%～80%，4 ≥80%）和染色強度評分（陽性細胞染色強度的評估：0=陰性，1=弱，2=中間，3=強）的乘積。根據(jù)每個類別中分子標記物的得分之和對UBC 進行分類［10］。CK20和GATA-3 的得分之和> CK14 和CK5/6 的得分之和為管腔型；反之為基底型。

1.3 熒光原位雜交

根據(jù)2018 年ASCO/CAP 乳腺癌HER2 評估指南［7］，HER2IHC 得分2+的病例進行FISH 檢測HER2基因擴增。FISH 根據(jù)HER2基因擴增FISH檢測試劑盒（武漢康錄生物技術有限公司，中國）的說明在全自動FISH 前處理儀（TL101，武漢康錄生物技術有限公司，中國）和原位雜交儀（Thermo?Brite，Abbott StatSpin，美國）上進行。

隨機在兩個代表性區(qū)域內(nèi)計數(shù)20 個以上腫瘤細胞，腫瘤細胞應連續(xù)、均質(zhì)，細胞核無重疊信號清晰，且占浸潤癌的10%以上。計算HER2基因紅色熒光信號數(shù)目和17 號染色體著絲粒綠色熒光信號數(shù)目的比值。比值≥2.0 或者比值< 2.0 但平均單個細胞HER2基因拷貝數(shù)≥6.0 為擴增陽性；比值< 2.0 且平均單個細胞HER2基因拷貝數(shù)<4.0為擴增陰性；比值<2.0且平均單個細胞HER2基因拷貝數(shù)< 6.0，但≥4.0 時為擴增結果不確定，重新計數(shù)20 個腫瘤細胞，若仍不確定此時HER2的狀態(tài)依照IHC 的結果判定。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS軟件統(tǒng)計（SPSS 22.0，美國芝加哥）。采用卡方檢驗分析HER2 與浸潤性UBC 肌層浸潤、臨床分期和腫瘤最大徑的關系。采用Fisher確切概率法（雙側）分析HER2 與浸潤性UBC 病理組織學分級、性別、年齡、脈管侵犯、局部淋巴結轉移、Ki67 增殖指數(shù)和病理分子分型）的關系。P<0.05 具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理資料

50例浸潤性UBC包括男性44名，女性6名，中位年齡71（43～87）歲。20 例非浸潤性UBC 包括男性15 名，女性5 名，中位年齡66（30～86）歲。50 例浸潤性UBC 包含MIBC 30 例（60%），NMIBC 20 例（40%）；其中浸潤性高級別UBC 42 例（84%），浸潤性低級別UBC 8 例（16%）。20 例非浸潤性UBC 包含非浸潤性高級別UBC 10 例（50%），非浸潤性低級別UBC 10 例（50%；圖1）。表2 記錄了詳細的臨床病理資料。

表1 免疫組織化學實驗使用的一抗Table 1 Antibodies used for immunohistochemistry on a Bench Mark Ultra automatic stainer（Ventana）

圖1 膀胱尿路上皮癌組織學診斷Fig.1 Histomorphological spectrum of UBC

2.2 浸潤性和非浸潤性UBC 中HER2 陽性率

根據(jù)2018 年ASCO/CAP 乳腺癌HER2 評估指南，IHC 3+判斷為HER2 陽性，IHC 0 和1+判斷為HER2 陰性。IHC 2+者需進一步應用FISH 進行HER2基因擴增狀態(tài)檢測。HER2 蛋白陽性指IHC 2+和3+的病例；HER2 陽性指IHC 3+陽性和FISH 陽性的病例。

50 例浸潤性UBC 的HER2 IHC 蛋白陽性率（IHC 2+和3+）為52%（26/50）（圖2）。IHC 2+者進行FISH 檢測，其中5 例擴增陽性，4 例擴增陰性（圖3）。浸潤性UBC 的HER2 陽性率（IHC 3+和FISH 陽性）為44%（22/50）。

20 例非浸潤性膀胱尿路上皮癌IHC 蛋白陽性率（IHC 2+和3+）為25%（5/20），IHC 2+者進一步FISH 檢測5 例均為陰性，非浸潤性膀胱尿路上皮癌HER2 陽性率（IHC 3+和FISH 陽性）為0（0/20）。浸潤性UBC 和非浸潤性UBC 的HER2 陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000；表3）。

2.3 HER2 陽性與浸潤性膀胱尿路上皮癌Ki67≥30%的關系

50 例浸潤性UBC 中，36 例Ki67≥30%，其中21例HER2 陽性（58.3%）；14 例Ki67＜30%，其中1 例HER2 陽性（7.1%）。HER2 陽性與浸潤性膀胱尿路上皮癌Ki67≥30%有關，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001；圖4，表4）。

2.4 HER2 陽性率在分子分型的分布

50 例浸潤性UBC 進行病理分子分型，管腔型41 例（82%），基底/鱗狀型9 例（18%，圖5）。管腔型HER2 陽性率53.7%（22/41），基底/鱗狀型9 例HER2 未見陽性。管腔型HER2 陽性率高于基底/鱗狀型，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003；表4）。

2.5 HER2 陽性與浸潤性UBC 臨床病理特征的關系

50 例浸潤性UBC 中，HER2 陽性與高級別、脈管侵犯有關，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006；P=0.004）；與肌層浸潤（P=0.295）、腫瘤大?。ㄅR界值3 cm，P=0.962）、臨床分期（P=0.070）、局部淋巴結轉移（P=0.502）、性別（P=0.457）、年齡（P=0.086）等均無關（表4）。

3 討論

3.1 不同地理人群中UBC 的HER2 表達差異

HER2 陽性率在不同的UBC 患病地理人群中具有較大差異。Bellmunt［15］等分別在20%的西班牙人UBC患者和4%的希臘人UBC患者中發(fā)現(xiàn)HER2基因擴增。文獻報道0%～59%的UBC 存在HER2基因擴增，0%～89%的UBC 存在HER2 蛋白過表達［9-11］。因此在中國，甚至不同省份的UBC 患病人群中，HER2 的表達情況很可能和國外人群有差異。本研究人群均分布于中國安徽省，浸潤性UBC 中HER2 IHC 蛋白陽性率（IHC 2+和3+）為52%（26/50），HER2 陽性率（IHC 3+和FISH 陽性）為44%（22/50），非浸潤性膀胱尿路上皮癌IHC 蛋白陽性率為25%（5/20），未見HER2 陽性。

表2 UBC 臨床病理特征Table 2 Clinicopathological features of the analyzed cohort［n，n（%）］

表3 浸潤性UBC 和非浸潤性UBC 的HER2 陽性率比較Table 3 Comparison of HER2 positive rate between invasive UBC and non-invasive UBC ［n，n（%）］

圖2 膀胱尿路上皮癌中免疫組化HER2 蛋白表達Fig.2 HER2 in urothelial bladder carcinoma by IHC

圖3 膀胱尿路上皮癌中熒光原位雜交HER2 基因擴增Fig.3 HER2 gene amplification in urothelial bladder carcinoma by FISH

圖4 浸潤性膀胱尿路上皮癌中免疫組化Ki67 表達Fig.4 Ki67 expression in invasive urothelial bladder carcinoma by IHC

圖5 管腔型和基底型浸潤性膀胱尿路上皮癌Fig.5 Luminal and basal invasive urothelial bladder carcinoma

3.2 UBC 的HER2 陽性率與腫瘤細胞的侵襲性特征相關

本研究HER2陽性與細胞增殖指數(shù)Ki67≥30%有關，而Tan 等［1］發(fā)現(xiàn)HER2mRNA 高表達的UBC的DNA 復制和細胞周期信號傳導水平均顯著升高。這些發(fā)現(xiàn)提示UBC 的HER2 陽性率與腫瘤細胞的增殖水平相關。本研究HER2 陽性與浸潤性UBC脈管浸潤有關，而Moktefi 等［8］發(fā)現(xiàn)HER2陽性率在局部原發(fā)UBC 腫瘤和其轉移淋巴結中高度一致（126/126，100%）。HER2 陽性的轉移淋巴結極可能由局部原發(fā)UBC 腫瘤中HER2 陽性的腫瘤細胞轉移而來。UBC 病理組織學分級根據(jù)組織形態(tài)和細胞異型性分為高級別和低級別，病理分級反映了腫瘤的惡性程度。本研究HER2 陽性與浸潤性UBC 的病理組織學分級高級別有關，與之前的幾項研究一致［16］。以上發(fā)現(xiàn)提示UBC 的HER2 陽性率與腫瘤細胞的侵襲性特征相關。

3.3 UBC 的HER2 陽性率與肌層浸潤及臨床分期相關性

值得注意的是本研究中HER2 陽性與UBC 的不同浸潤深度具有不同的相關性。HER2陽性與侵及基底膜（即浸潤性UBC）有關，而在NMIBC和MIBC中分布均勻。Tan 等［1］同樣發(fā)現(xiàn)HER2擴增及其信號傳導在NMIBC 和MIBC 中分布均勻。而本研究HER2 陽性在浸潤性UBC 不同臨床分期的分布也無顯著差異。HER2 陽性與UBC 腫瘤細胞的侵襲性特征有關，卻在肌層是否浸潤和臨床分期的分布無顯著差異，這提示UBC 的腫瘤進展尚有其他因素作用。這可能是部分患者從HER2 靶向治療中獲益，而已經(jīng)開展的幾項HER2 靶向治療MIBC 的臨床試驗并未取得療效共識的原因。HER2 在UBC的發(fā)生進展中所起到的作用仍需要深入研究。

3.4 管腔型UBC 具有更高的HER2 陽性率

本研究管腔型UBC 具有更高的HER2 陽性率，與之前的幾項研究一致［16］。在具有管腔特征的腫瘤中如乳腺癌、胃癌，更常發(fā)現(xiàn)HER2 陽性，HER2 可能在管腔途徑中起作用［17-18］。盡管HER2陽性率更高，管腔型UBC 的整體預后較基底/鱗狀型更好［18］。需要指出的是，管腔型中既有預后較好的組織學類型，也有預后較差的組織學類型如微乳頭變異型尿路上皮癌（micropapillary urothelial carcinoma，MPUC）［19］。MPUC 與預后不良相關，而大多數(shù)MPUC 的分子分型表現(xiàn)為管腔型［8，19］，其HER2 陽性率也較常規(guī)UBC 和其他組織變異型更高［19］。UBC 中HER2 陽性對預后的價值目前仍存在爭議，一些研究提出HER2 不能作為判斷預后的依據(jù)［15］，一些提出HER2 與癌癥預后不良相關［20］，極少數(shù)認為與預后較好相關［10］。單獨依靠HER2 狀態(tài)判斷預后是不足的，需要大樣本和長時間的隨訪結合HER2、分子亞型及組織學類型分析不同類型UBC 的預后。這些發(fā)現(xiàn)提示需要對HER2 陽性的患者進一步區(qū)分，以篩選出能從HER2 靶向治療中獲益的患者。

表4 HER2 陽性與浸潤性膀胱尿路上皮癌部分臨床病理特征的關系Table 4 Relationship between HER2 positive and partial clinicopathological features of invasive urothelial bladder carcinoma［n，n（%）］

綜上所述，HER2 與浸潤性高級別UBC 的侵襲性密切相關，卻與肌層浸潤和臨床分期無關。HER2 狀態(tài)結合分子分型或許有助于篩選潛在的HER2 靶向治療有效的UBC 患者。