MiR-204-3p靶向EphB2調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制

謝傳華 ，陳海龍，黃 萍，郭守俊，邱伊連，王 碩，潘宜云，胡志蘋

（1.贛州市腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，贛州江西 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院生理教研室，贛州江西 341000）

肺癌是全球發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，嚴(yán)重公眾衛(wèi)生健康［1-2］。肺癌病理類型主要分為非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）與小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）［3］。其中NSCLC 占比約80%以上，是肺癌主要的存在形式，且NSCLC 易出現(xiàn)早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與侵襲的特點(diǎn)［4-5］。microRNA 是一類經(jīng)典的非編碼的單鏈小RNA，長(zhǎng)度在22 個(gè)核苷酸左右［6-7］。microRNA 的存在非常廣泛，可調(diào)控多項(xiàng)生命活動(dòng)，且microRNA 在物種間高度保守，是目前腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［8-9］。目前有多項(xiàng)研究表明，microRNA 與肺癌發(fā)生進(jìn)展關(guān)系密切，深入研究microRNA 對(duì)探究肺癌分子機(jī)制具有重要意義［10-11］。有研究表明，miR-204-3p 可抑制大腸癌、胃癌、宮頸癌、和胰腺癌等［12-15］。miR-204-3p對(duì)肺癌的調(diào)控機(jī)制的研究罕見(jiàn)報(bào)道。EphB2 是一種絡(luò)氨酸蛋白激酶受體，在癌癥的進(jìn)程中起重要的作用，研究指出該蛋白受miRNA 調(diào)控［16-18］。但目前尚無(wú)研究證實(shí)miR-204-3p 與EphB2 在NSCLC 中的調(diào)控關(guān)系。因此，本研究將明確miR-204-3p/EphB2 在NSCLC 中的作用及其機(jī)制，有助于豐富NSCLC 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，及為靶點(diǎn)治療提供指導(dǎo)方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

非小細(xì)胞癌A549 細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)（Rockville，MD，USA），DMEM（Gibco，Life Technologies，美國(guó)），PGL3 載體（Genefarma，上海，中國(guó)），LipofectamineTM2000（Invitrogen，San Diego，美國(guó)），MTT 溶液（Sigma，美國(guó)），自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀檢測(cè)（BIO-RAD，Cal，美國(guó)），Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒（4030ES20，Sigma，美國(guó)），GaliOS 型號(hào)流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國(guó)），Trizol（Invit?rogen，Calsbad，美國(guó)），兔多抗EphB2（ab252935，Abcam，美國(guó)），GAPDH（ab128915，Abcam，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

A549 細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)，加入10% 胎牛血清、50 U/mL 青霉素和50 mg/mL 鏈霉素，在37°C、體積分?jǐn)?shù)95%空氣和5% CO2的環(huán)境下生長(zhǎng)。構(gòu)建miR-204-3p 及EphB2 重組載體，轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞后，分組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為5 組：NC mimic 組（miR-204-3p 過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組）、miR-204-3p mimic組（miR-204-3p過(guò)表達(dá)組）、oe-NC組（EphB2 過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組）、oe-EphB2 組（EphB2過(guò)表達(dá)組）、miR-204-3p mimic+oe-EphB2 組（miR-204-3p 與EphB2 均過(guò)表達(dá)組）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基制備成2.5×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，每組各設(shè)8 孔，每孔100 μL，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)12、24、36、48、72 h 時(shí)取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液10 μL 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)后，棄上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使其充分溶解，自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀檢測(cè)570 nm 處測(cè)定各孔吸光度（OD）值。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h 后，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，離心并丟棄上清液，重懸浮后將細(xì)胞濃度調(diào)整到約1×105/mL。在-20 ℃預(yù)冷75%乙醇，吸取1 mL 乙醇固定細(xì)胞，反應(yīng)1 h 后，吸去乙醇，PBS 洗滌2 次，離心并丟棄上清液，加入100 μL RNase A，在37 ℃，避光的條件下孵育30 min，然后加入400 μL PI 染色，混合，4 ℃下暗反應(yīng)30 min，GaliOS 型號(hào)流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國(guó)）記錄488 nm 處熒光強(qiáng)度，檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布情況。

轉(zhuǎn)染24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集在流動(dòng)管中，離心，并丟棄上清液。PBS 洗滌細(xì)胞3 次，離心除去上清液。根據(jù)Annexin VFITC 凋亡檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明，將Annexin VFITC、PI、HEPES 緩沖液按1∶250 的比例制備染液。每100 μL染料溶液再懸浮大約1×106個(gè)細(xì)胞，搖勻。室溫下孵育15 min 后，加入1 mL HEPES 緩沖液，搖勻。在488 nm 處，分別激發(fā)525 和620 nm帶通濾波器，檢測(cè)FITC 和PI 熒光，從而得到各組細(xì)胞凋亡情況。

1.3.3 Transwell 試驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，將Tran?swell 小室放置在24 孔板中，小室底部膜的上室面通過(guò)Matrigel 1∶8 稀釋液包被，以室溫進(jìn)行風(fēng)干；將各組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化后，用過(guò)濾后的PBS 輕洗2 次，RPMI 1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，將細(xì)胞密度大至調(diào)整到1×105個(gè)/mL，取200 μL 的懸液，移入到已處理的小室底部膜的上室面，另外取含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL，加入下室。正常培養(yǎng)24 h 后，取出小室，去除上室內(nèi)面多余的細(xì)胞，40 g/L 的多聚甲醛進(jìn)行固定，15 min 后，使用0.5%的結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色。用過(guò)濾好的PBS 進(jìn)行清洗，洗去多余染液。使用倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取其中5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.3.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h 的A549 細(xì)胞接種于6 孔板上，貼壁后用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基代替。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%～100%時(shí)，10 μL 槍口垂直于6孔板底部進(jìn)行緩慢劃痕，每孔約4～5處劃痕，以保證每一處劃傷的寬度相同。然后用已過(guò)濾與預(yù)冷的PBS 沖洗細(xì)胞3 次，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h 后，觀察劃痕區(qū)的移動(dòng)距離，隨機(jī)選取多個(gè)視野，對(duì)視野進(jìn)行拍攝。使用ipp7.0 軟件進(jìn)行細(xì)胞融合率分析。

1.3.5 PGL3 重組載體構(gòu)建和鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳后切出目的條帶，用試劑盒純化PCR 產(chǎn)物后再次電泳確認(rèn)。確認(rèn)以后使用XhoⅠ酶、HindⅢ酶對(duì)膠回收純化產(chǎn)物和空白載體pGL3.0-Basic進(jìn)行37℃雙酶切過(guò)夜，用同樣的方法純化回收過(guò)夜的酶切物。將純化后的pGL3.0-Basic 載體和CTGF 片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為酶切純化后pGL3.0-Basic 載體2 μL、酶切純化后CTGF 片段4 μL、T4 DNA 連接酶0.8 μL、T4 DNA 連接酶緩沖液（5×）2 μL、雙蒸水1.2 μL，共10 μL 體系，置于PCR 中16 ℃連接過(guò)夜。連接后的產(chǎn)物使用超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞TreliefTM5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化，之后將細(xì)胞沉淀接種到含氨芐霉素的LB 固體培養(yǎng)平板中培養(yǎng)篩選過(guò)夜。在每個(gè)培養(yǎng)平板中選取5 個(gè)單克隆菌落，各用5 μL 的無(wú)菌水溶解得到菌液，取2 μL 作為模板進(jìn)行菌落PCR，擴(kuò)增后采用1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定；剩余3 μL 菌液加入到3 mL 含氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后小提質(zhì)粒。提取得到的質(zhì)粒用XhoⅠ酶、HindⅢ酶雙酶切2 h，瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段是否插入。對(duì)經(jīng)過(guò)初步鑒定的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告分析 構(gòu)建靶基因NC mim?ic、miR-204-3pmimic、PGL3-EphB2wt 和PGL3-EphB2mut 載體，將NC mimic、miR-204-3p mimic載體分別與PGL3-EphB2 wt和PGL3-EphB2 mut 載體共轉(zhuǎn)至HEK 293T 細(xì)胞中。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)。首先將各組細(xì)胞裂解，裂解后以13 000×g離心1 min，去沉淀，收集上清液。雙熒光素酶報(bào)告試劑盒（E1910，Promeg，美國(guó)威斯康辛州麥迪遜市），按照試劑盒操作，測(cè)量熒光素酶活性。操作步驟如下：將裂解后的細(xì)胞樣品吸入EP管中，每10 μL樣品中加入螢火蟲(chóng)熒光素酶工作溶液100 μL，測(cè)得螢火蟲(chóng)熒光素酶活性之后加入海腎熒光素酶工作溶液100 μL，測(cè)得海腎熒光素酶活性結(jié)果。最后熒光素酶活性比值由螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性獲得。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，收集細(xì)胞，冷PBS 清洗細(xì)胞1 次，由Trizol 提取各組組織中總RNA。根據(jù)TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription primer（4427975，Applied Bio?systems，USA）的說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA，取2 μL cDNA 稀釋至50 ng/μL，PCR 擴(kuò)增體系是20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)5 s。miR-204-3p、U6、EphB2、GAPDH的引物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成（表1）。使用定量PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)條件是在預(yù)變性95 ℃反應(yīng)10 min，變性95 ℃反應(yīng)10 s，退火60 ℃反應(yīng)20 s，35 個(gè)循環(huán)。PCR 體系為20 μL：qPCR 正向引物（10 μmol/L）0.8 μL，qPCR 反向引物（10 μmol/L）0.8 μL，ROX 參考染料Ⅱ0.4 μL，SYBRPremix Ex TaqTMⅡ10 μL，cDNA模板2.0 μL，滅菌蒸餾水6.0 μL。其中miR-204-3p的相對(duì)表達(dá)以U6作為內(nèi)參，EphB2mRNA 相對(duì)表達(dá)以GAPDH的表達(dá)作為內(nèi)參。2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)水平，公式如下：ΔΔCT=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCtGAPDH，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參。其中Ct 表示qPCR 的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

1.3.8 Western Blot 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，收集細(xì)胞，冷PBS 清洗細(xì)胞1 次，Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞中EphB2 蛋白的表達(dá)。RIPA（BB-3209，Bebe Bio，中國(guó)上海）提取細(xì)胞中總蛋白。將蛋白樣品置于沸水浴中10 min，完成蛋白質(zhì)變性處理。通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，在80 V 的恒定電壓下轉(zhuǎn)移至NC 印跡膜。5%脫脂牛奶封閉溶液1 h后，加入一抗兔多抗EphB2，GAPDH，在搖床中，4 ℃下封閉過(guò)夜。TBST在室溫下洗滌3次，每次洗滌5 min。將HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ab150077，Abcam，USA）在37 ℃下振蕩孵育2 h。用TBST 在室溫下洗滌3 次，每次洗滌5 min，將PVDF 膜進(jìn)行顯色。蛋白相對(duì)表達(dá)=蛋白帶灰度值/相同樣品GAPDH 帶灰度值。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.9 EphB2 數(shù)據(jù)獲取 非小細(xì)胞肺癌中EphB2基因的生存分析數(shù)據(jù)，來(lái)自表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（Gene Expression Prolifing Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer-pku.cn/），GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)是基于9 736 個(gè)來(lái)自癌癥和腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TGCA）、基因型組織表達(dá)（Genotype Tissue Expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)的8 537個(gè)正常樣本的基因表達(dá)分析的相互式Web 應(yīng)用程序。對(duì)肺鱗癌和肺腺癌中EphB2表達(dá)分析，以正常組織表達(dá)為基線，設(shè)置分組閾值：EphB2表達(dá)＞50%為高表達(dá)組，＜50%為低表達(dá)組，共計(jì)960 例肺癌組織（肺腺癌+肺鱗癌）納入生存統(tǒng)計(jì)分析，以Log-rank test 進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)分析。

1.3.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 IBM SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，呈正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)比較時(shí)，各組定量資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性采用One way-ANOVA 進(jìn)行分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-204-3p 及EphB2 對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響

我們通過(guò)MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況（圖1），結(jié)果顯示，和NC mimic 組相比，miR-204-3p mimic組細(xì)胞增殖能力顯著降低（P<0.05）。和oe-NC組相比，oe-EphB 組細(xì)胞增殖能力顯著升高（P<0.05）。和miR-204-3p mimic 組相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 組細(xì)胞增殖能力顯著升高（P<0.05）。以上結(jié)果表明miR-204-3p 過(guò)表達(dá)會(huì)抑制A549 細(xì)胞增殖，而EphB 過(guò)表達(dá)則會(huì)促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖，且EphB 過(guò)表達(dá)會(huì)阻斷miR-204-3p 對(duì)A549 細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.2 miR-204-3p 及EphB 對(duì)A549 細(xì)胞周期及凋亡的影響

為探究miR-204-3p、EphB 對(duì)A549 細(xì)胞周期和凋亡的影響，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞周期（圖2A、B）和凋亡情況（圖2C、D），結(jié)果顯示，和NC mimic 組相比，miR-204-3p mimic組細(xì)胞G0/G1 期細(xì)胞比例顯著升高，S 期細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞凋亡比例明顯升高（P<0.05）。和oe-NC 組相比，oe-EphB 組細(xì)胞G0/G1 期細(xì)胞比例顯著降低，S 期細(xì)胞比例顯著升高，細(xì)胞凋亡比例明顯降低（P<0.05）。和miR-204-3p mimic組相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 組細(xì)胞G0/G1 期細(xì)胞比例顯著降低，S 期細(xì)胞比例顯著升高，細(xì)胞凋亡比例明顯降低（P<0.05）。以上各組細(xì)胞G2/M 期細(xì)胞比例均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。以上結(jié)果綜合表明miR-204-3p 會(huì)抑制周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，EphB 會(huì)促進(jìn)周期進(jìn)程，而抑制細(xì)胞凋亡，且EphB 過(guò)表達(dá)會(huì)阻斷miR-204-3p對(duì)A549細(xì)胞周期進(jìn)程的阻滯作用以及對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

圖1 miR-204-3p 及EphB 過(guò)表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.1 Over-expression of miR-204-3p and EphB effects on proliferation of A549 cells

圖2 miR-204-3p 及EphB 過(guò)表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞周期及凋亡的影響Fig.2 Over-expression of miR-204-3p and EphB effects on cell cycle and apotosis of A549 cells

2.3 miR-204-3p 及EphB 對(duì)A549 細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況（圖3A、B），結(jié)果顯示，和NC mimic 組相比，miR-204-3p mimic組細(xì)胞侵襲能力顯著降低（P<0.05）。和oe-NC組相比，oe-EphB 組細(xì)胞侵襲能力顯著升高（P<0.05）。和miR-204-3p mimic組相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 組細(xì)胞侵襲能力顯著升高（P<0.05）。以上結(jié)果表明miR-204-3p 過(guò)表達(dá)會(huì)抑制A549 細(xì)胞侵襲，而EphB 對(duì)A549 細(xì)胞侵襲能力的影響則剛好相反，且EphB 過(guò)表達(dá)會(huì)阻斷miR-204-3p 對(duì)A549 細(xì)胞侵襲的抑制作用。

2.4 miR-204-3p 及EphB2 對(duì)A549 細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況（圖4A、B），結(jié)果顯示，和NC mimic 組相比，miR-204-3p mimic 組細(xì)胞遷移能力顯著降低（P<0.05）。和oe-NC 組相比，oe-EphB 組細(xì)胞遷移能力顯著升高（P<0.01）。和miR-204-3p mimic 組相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 組細(xì)胞遷移能力顯著升高（P<0.05）。以上結(jié)果表明miR-204-3p 過(guò)表達(dá)會(huì)抑制A549 細(xì)胞遷移，EphB 明顯促進(jìn)A549 細(xì)胞的遷移能力，且EphB 過(guò)表達(dá)會(huì)阻斷miR-204-3p 對(duì)A549 細(xì)胞遷移的抑制作用。

圖3 miR-204-3p 及EphB 過(guò)表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.3 Overexpression of miR-204-3p and EphB effects on invasion of A549 cells

圖4 miR-204-3p 及EphB 過(guò)表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞遷移能力的影響Fig.4 Over-expression of miR-204-3p and EphB effects on migration of A549 cells

2.5 miR-204-3p 與EphB2 之間的調(diào)控關(guān)系

我們通過(guò)生信網(wǎng)站（http：//www.targetscan.org/vert_72/）查詢發(fā)現(xiàn)miR-204-3p與EphB2之間存在結(jié)合位點(diǎn)（圖5A），為進(jìn)一步探究miR-204-3p 與EphB2 之間是否存在調(diào)控關(guān)系，我們首先通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告分析進(jìn)行檢測(cè)（圖5B），結(jié)果顯示，和NCmimic 相比，miR-204-3pmimic 與EphB2wt共轉(zhuǎn)染后，EphB2wt 報(bào)告載體熒光素酶活性顯著降低，這表明miR-204-3p會(huì)顯著抑制miR-204-3p的活性。為探究在A549 細(xì)胞中，miR-204-3p 是否會(huì)影響EphB2 的表達(dá)，我們分別通過(guò)qRT-PCR（圖5C）和WB（圖5D）檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-204-3p 和EphB2 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，和NC mimic組相比，miR-204-3p mimic 組細(xì)胞中miR-204-3p表達(dá)升高，EphB2 mRNA 和蛋白表達(dá)降低（P<0.01）。和oe-NC 組相比，oe-EphB 組miR-204-3p表達(dá)無(wú)顯著性差異（P>0.05），EphB2 mRNA 和蛋白表達(dá)升高（P<0.01）。和miR-204-3p mimic 組相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 組miR-204-3p表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），EphB2 mRNA 和蛋白表達(dá)升高（P<0.01）。以上結(jié)果綜合表明，在NSCLC中，miR-204-3p 可靶向抑制EphB2 的表達(dá)。

2.6 miR-204-3p 與EphB2 在NSCLC 的表達(dá)及預(yù)后關(guān)系

查詢TGCA數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)NSCLC中mir-204-3p與EphB2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.636，P=0.000，n=66），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A）。利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析TGCA 來(lái)源的NSCLC（肺腺癌+肺鱗癌），結(jié)果顯示EphB2高表達(dá)的NSCLC 較EphB2低表達(dá)總生存時(shí)間短（logrank χ2=3.899，P=0.049，n=480；圖6B），提示EphB2高表達(dá)是NSCLC不良預(yù)后的標(biāo)志分子。

3 討論

NSCLC 是肺癌最常見(jiàn)的病理類型，占所有類型的80%以上［19-20］。目前NSCLC 的治療主要采取放療、化療及手術(shù)等綜合治療，但中晚期患者總體生存預(yù)后較低［21-23］。近年來(lái)，靶向治療及免疫治療逐漸進(jìn)入公眾視野，是癌癥治療的趨勢(shì)。盡管有大量的基礎(chǔ)研究，但NSCLC 的發(fā)病機(jī)理仍不明確，探尋更多的確切有效的靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)難點(diǎn)。

圖5 miR-204-3p 靶向下調(diào)EphBFig.5 MiR-204-3p targeted down-regulation of EphB

圖6 非小細(xì)胞肺癌中miR-204-3p 與EphB2 表達(dá)相關(guān)性Fig.6 Correlation between miR-204-3p and EphB2 expression in non-small cell lung cancer

MicroRNA（miRNA）是非編碼RNA 之一，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，在功能上廣泛參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡、個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育以及器官形成等［24］。miR-204-3p 屬于microRNA 家族成員之一，是miR-204 的成熟體之一。Zhang 等［25］研究發(fā)現(xiàn)miRNA-204作為抑癌基因，其過(guò)表達(dá)可顯著抑制NSCLC 進(jìn)展。研究報(bào)道在胃癌、胰腺癌、食管癌等中miR-204-3p 高表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲作用，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展［24-26］。而miR-204-3p 在NSCLC 中的作用尚不清楚，在本研究中，我們通過(guò)在A549 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-204-3p，明顯抑制NSCLC 的增殖、遷移及侵襲能，并阻滯在G0/G1 期促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，miR-204-3p在NSCLC 中發(fā)揮抑癌作用，其下游調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

MicroRNA 可以通過(guò)與靶基因3′-非翻譯區(qū)（UTR）特異結(jié)合，使靶基因降解或翻譯受阻，從而在轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-204靶向抑制ATF2的表達(dá)，進(jìn)而抑制NSCLC增殖、遷移、侵襲［25-28］。miRNA-204-3p 還可靶向乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDHA）介導(dǎo)的糖酵解負(fù)向調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖［29］。經(jīng)Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，EphB2基因作為miR-204-3p的候選靶基因，EphB 作為受體絡(luò)氨酸蛋白激酶之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［29］。Hagen等［30］研究發(fā)現(xiàn)EphB2是胃癌患者是獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲性作用。Megiorni等［31］研究也表明，EphB2 在橫紋肌肉瘤中表達(dá)異常升高［31］。Wang 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，EphB2 參與細(xì)胞平滑肌細(xì)胞向毛細(xì)淋巴管的異常遷移。Salgia［33］的研究也表明EphB 的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移相關(guān)。在本研究中，EphB2 作為致癌因子，過(guò)表達(dá)促進(jìn)NSCLC 增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡。miR-204-3p 在NSCLC 中下游的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，為探究miR-204-3p 與EphB2 之間是否存在靶向關(guān)系，我們通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告以及qPCR 和WB 檢測(cè)均表明在NSCLC 中，miR-204-3p 能夠靶向結(jié)合并抑制EphB2 的表達(dá)。其中miR-204-3p表達(dá)與EphB2 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)過(guò)表達(dá)EphB2后能挽救miR-204-3p 高表達(dá)所抑制NSCLC 增殖、侵襲、遷移能力及細(xì)胞凋亡。因此，mir-204-3p/EphB2是NSCLC 進(jìn)展的重要調(diào)控機(jī)制之一，EphB2高表達(dá)是NSCLC 不良預(yù)后的標(biāo)志分子，

本研究存在的不足，僅在體外細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證這一機(jī)制，需在動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證該機(jī)制，并且深入探究mir-204-3p 上游調(diào)控機(jī)制，可進(jìn)一步的完善NSCLC 發(fā)生進(jìn)展的機(jī)制，有望為臨床上靶向治療提供了新的依據(jù)。