甲狀腺乳頭狀癌雌激素受體β表達(dá)及其5′非翻譯區(qū)甲基化

茍 茜，許琳婉，劉智敏

（重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶 400016）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是一種常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，占甲狀腺癌的85%～90%［1-4］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PTC 的發(fā)病率逐年增加，女性發(fā)病率約為男性的3 倍，這表明雌激素與PTC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5-6］。雌激素受體β（estrogen receptor β，ERβ）屬于類固醇受體，可介導(dǎo)雌激素的生理功能［7］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ERβ對PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移有抑制作用，但與正常甲狀腺相比，ERβ在PTC 中表達(dá)水平較低［8］，因此我們將進(jìn)一步探討ERβ在PTC 中低表達(dá)的原因及其機(jī)制。ERβ基因存在兩種不同的啟動(dòng)子（啟動(dòng)子0K 和啟動(dòng)子0N），可轉(zhuǎn)錄生成兩種含有不同5′非翻譯區(qū)的異構(gòu)體，即ERβ mRNA（0K-1）和ERβ mRNA（0N-1），由外顯子0K和外顯子0N 可變剪接至外顯子1 產(chǎn)生［9］。在啟動(dòng)子0K 中，大小為295（-137～+158）bp 的區(qū)域，包含15 個(gè)CpG 位點(diǎn)。在啟動(dòng)子0N 和外顯子0N 中，大小為509（-211～+298）bp 的區(qū)域，包含45 個(gè)CpG 位點(diǎn)［10］。在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，CpG 島甲基化可引起基因沉默，抑癌基因啟動(dòng)子超甲基化則會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)展［11］。已有研究證實(shí)，ERβ作為抑癌基因，可在PTC 中抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展［12］。但ERβ在PTC 中的甲基化狀態(tài)研究仍未見報(bào)道，因此，我們將進(jìn)一步分析ERβ5′非翻譯區(qū)CpG 島在PTC中的甲基化狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測正常甲狀腺、結(jié)節(jié)性增生以及PTC 組織與細(xì)胞中ERβ蛋白表達(dá)、ERβ及其異構(gòu)體mRNA 表達(dá)與ERβ基因5′非翻譯區(qū)甲基化狀態(tài)，并使用DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2′-deoxycytidine（5-aza-dC）處理細(xì)胞，進(jìn)一步觀察ERβ及其異構(gòu)體mRNA 表達(dá)的變化。探討ERβ在PTC 中低表達(dá)的原因及機(jī)制，有助于對PTC 的病理機(jī)制、臨床診斷及治療預(yù)后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與組織標(biāo)本

研究使用人PTC 細(xì)胞株BCPAP 和正常甲狀腺細(xì)胞株Nthy-ori3-1 由本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)于含10 g/L 胎牛血清、100 μg/mL 青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2、溫度為37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱。常規(guī)培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集2018 年6 月至2018 年12 月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科進(jìn)行手術(shù)后經(jīng)病理診斷為PTC 的10 例PTC 腫瘤組織、取自甲狀腺良性疾病患者的10 例結(jié)節(jié)性增生組織和10 例癌旁正常甲狀腺組織。將所有組織標(biāo)本包裹在鋁箔中，并立即在液氮中冷凍直至后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。本研究標(biāo)本收集經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得患者知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；兔抗人ERβ和βactin 多克隆抗體和羊抗兔二抗購自美國Bioworld公司；RIPA 裂解緩沖液、SDS-PAGE 配膠試劑盒和BCA 試劑盒購自上海碧云天公司；免疫組化（S-P）法試劑盒、DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司；冷凍切片包埋劑購自美國Sakura 公司；HE 染色試劑盒購自上海碧云天公司；乙烯乙酸乙烯酯膜帽、RNA 提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen 公司；qRT-PCR 試劑盒購自美國ABI 公司；DNA 提取試劑盒、亞硫酸氫鹽修飾試劑盒、多重PCR 試劑盒與凝膠回收試劑盒購自德國Qiagen 公司；DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑購自美國Sigma 公司；DMSO 購自北京Solarbio 公司；PCR 引物由上海生工公司合成。

1.2.2 儀器設(shè)備 冷凍切片機(jī)購自德國Leica 公司；LCM 儀器和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

1.3 Western Blot

收集細(xì)胞，使用RIPA 提取細(xì)胞總蛋白。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離總細(xì)胞蛋白，并將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST 洗膜3 次，每次10 min。按比例稀釋ERβ和β-actin 一抗，4 ℃孵育過夜。PBST 洗膜3次后，放入稀釋后的二抗，孵育2 h。PBST 洗膜3 次，每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯影，采集圖像。采用quantity one 分析軟件分析目的蛋白條帶相對表達(dá)水平。

1.4 免疫組織化學(xué)染色與評分標(biāo)準(zhǔn)

使用鏈霉親和素-過氧化物酶法（sreptavidinperosidase，SP）測定ERβ的表達(dá)。標(biāo)本經(jīng)10 %甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片。放入二甲苯于烘箱脫蠟1 h，水化，抗原熱修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3 %H2O2覆蓋整個(gè)組織切片，輕輕搖晃，孵育30 min。山羊血清室溫封閉30 min。加入ERβ一抗，4 ℃孵育過夜。室溫復(fù)溫30 min 后，PBS 洗3 次，每次5 min。滴加生物素標(biāo)記的兔抗人IgG，37 ℃孵育30 min。PBS 洗3 次，每次5 min。加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明30 min，中性樹脂封片。用PBS 替代一抗，作陰性對照。由兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行判定。每張切片在200 倍光鏡下選取5 個(gè)視野。陽性細(xì)胞<5%為0、6%～25%為1、26 %～50 %為2、51 %～75 % 為3、>75 %為4。不顯色為0、淺棕色為1、棕色為2、深棕色為3。采用Remmele 半定量評分（陽性細(xì)胞百分率×顯色強(qiáng)度等級）。評分<6 為陰性，≥6 為陽性。

1.5 激光捕獲顯微切割

將冷凍的組織標(biāo)本使用組織包埋劑包埋，在-16°C 冷凍切片機(jī)中切片，切片厚度10 μm，輕輕轉(zhuǎn)移至PEN 膜載玻片上。將含有組織切片的載玻片在低溫恒溫器中干燥2 min 后，在冰盒中進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，以最大限度地降低RNase活性。將HE 染色后的載玻片放在激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）儀器的模塊化平臺(tái)上，調(diào)整照明對比度和放大倍數(shù)以獲得最佳可視化效果。使用繪圖工具選擇正常、增生性和PTC 組織標(biāo)本中的濾泡上皮細(xì)胞進(jìn)行顯微切割。在顯微鏡下檢查捕獲的所需細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到乙烯乙酸乙烯酯膜帽上，以進(jìn)行再次確認(rèn)。

1.6 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄和qPT-PCR

使用RNA 提取試劑盒提取Nthy-ori3-1 細(xì)胞、BCPAP 細(xì)胞和從組織獲得的濾泡上皮細(xì)胞中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后利用qRT-PCR 檢測ERβ mRNA（0K-1）、ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA表達(dá)水平。引物序列如下：ERβ mRNA（0K-1）上游引物：5′-AGTTACTGAGTCCGATGAATGT?GCTTG-3′，下游引物：5′-CTCAAAGATTCGTGGG?CAAGTATAATG-3′；ERβ mRNA（0N-1）上游引物：5′-CGGGAGACCCCCCCTAATGC-3′，下游引物：5′-CTCAAAGATTCGTGGGCAAGTATAATG-3′；總ERβ mRNA 上游引物：5′-TGGTCCATCGCCAGT?TATCA-3′，下游引物：5′-AGGTGTGTTCTAGCGA?TCTTGCTT-3′；GAPDH 上游引物：5′-GAAGGTG?AAGGTCGGAG?T-3′，下游引物：5′-GAAGATGGT?GATGGGATTTC-3′。以GAPDH 作為內(nèi)參進(jìn)行qRTPCR，反應(yīng)條件為50 ℃2 min，95℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min（40 個(gè)循環(huán)）。使用公式2-ΔΔCT計(jì)算相對表達(dá)量。

1.7 DNA 提取和亞硫酸氫鹽基因組測序

使用DNA 提取試劑盒提取Nthy-ori3-1 細(xì)胞、BCPAP 細(xì)胞以及從組織獲得的濾泡上皮細(xì)胞中的DNA。使用DNA 修飾試劑盒對DNA（1μg）進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾后，行PCR 擴(kuò)增，使用引物如下：啟動(dòng)子0K 上游引物：5′-GTTGGGGTTATTT?CGGGGTTGTT-3′，下游引物：5′-CCTCCAACAAA?ACAAACACATTCA-3′；啟動(dòng)子0N和外顯子0N上游引物：5′-GTTATTATTTTTGTGGGTGGATTGG-3′，下游引物：5′-ACCTTACCTTCTCTAAAATAC-3′。PCR 產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察后，從凝膠上切下條帶，純化。對純化的DNA進(jìn)行測序。甲基化狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)：CpG 島中0%CpG 位點(diǎn)發(fā)生甲基化為未甲基化（-）；1%～20%為低甲基化（+）；20%～60%為中度甲基化（++）；60%～100%為廣泛甲基化（+++）。

1.8 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理

將Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞以每孔5.0×105細(xì)胞（2.0 mL/孔）的密度接種在6 孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)過夜后，以1 μmol/L 的終濃度加入DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT）抑制劑5-aza-dC。每2 d 添加1 次含有5-aza-dC 的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)至第8 天，提取RNA。使用qRT-PCR 檢測5-aza-dC 處理后Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞中ERβ mRNA（0K-1）、ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA 表達(dá)水平。使用DMSO載體處理對照組細(xì)胞。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad prism 8軟件進(jìn)行分析，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。兩組均數(shù)間比較，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊性采用t檢驗(yàn)；多組間比較，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊性采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 法，非正態(tài)分布或方差不齊采用Kruskal WallisH檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)的形式描述，采用Fisher 確切概率法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERβ在正常甲狀腺細(xì)胞和PTC細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot 檢測正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1和PTC 細(xì)胞BCPAP 中ERβ的蛋白表達(dá)。與Nthyori3-1 細(xì)胞相比，ERβ在BCPAP 細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.020，P=0.001；圖1）。

圖1 ERβ在正常甲狀腺細(xì)胞和PTC 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 The protein expression of ERβ in human normal thyroid cells and PTC cells

2.2 ERβ在正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織和PTC 組織中的表達(dá)

免疫組化染色觀察ERβ在正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織和PTC 組織的表達(dá)，結(jié)果顯示，ERβ陽性表達(dá)數(shù)分別為5/10 例、3/10 例、0 例（圖2A～C）。與正常甲狀腺組織相比，ERβ在PTC 組織中的蛋白表達(dá)水平顯著降低（Fisher′s exact，P=0.033）。ERβ蛋白表達(dá)水平從正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織到PTC 組織逐漸降低。

圖2 ERβ在正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織和PTC 組織中的表達(dá)Fig.2 The expression of ERβ in tissue specimens of normal thyroid，nodular hyperplasia and PTC

2.3 ERβ mRNA 及其異構(gòu)體在正常甲狀腺細(xì)胞和PTC 細(xì)胞中的表達(dá)

如圖3A 所示，ERβ5′非翻譯區(qū)外顯子0K 和外顯子0N 可變剪接至外顯子1 形成ERβ的兩個(gè)異構(gòu)體，即ERβ mRNA（0K-1）和ERβ mRNA（0N-1）［7］。qRT-PCR 檢測正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1和PTC細(xì)胞BCPAP 中ERβ mRNA（0K-1）、ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞中，ERβ mRNA（0N-1）與總ERβ mRNA 的表達(dá)水平都顯著高于ERβ mRNA（0K-1）（F=132.510，P=0.000；F=75.056，P=0.000；圖3B）；ERβ mRNA（0K-1）在Nthy-ori3-1細(xì)胞和BCPAP細(xì)胞中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.568，P=0.600；圖3B）。BCPAP 細(xì)胞中ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA 的表達(dá)水平顯著低于Nthy-ori3-1細(xì)胞（t=9.056，9.815，P=0.001，0.001；圖3B）。結(jié)果說明，總ERβ mRNA主要由ERβ mRNA（0N-1）構(gòu)成，與正常甲狀腺細(xì)胞相比，ERβ mRNA（0N-1）與總ERβ mRNA 在PTC 細(xì)胞中的表達(dá)水平下調(diào)。

2.4 ERβ mRNA 及其異構(gòu)體在正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織和PTC 組織中的表達(dá)

qRT-PCR 檢測在從正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織和PTC 組織中提取的濾泡上皮細(xì)胞中ERβ mRNA（0K-1）、ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA 的表達(dá)水平。如表1 所示，ERβ mRNA（0K-1）的表達(dá)水平在正常甲狀腺組織與結(jié)節(jié)性增生組織間以及結(jié)節(jié)性增生組織與PTC 組織間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.045，P=0.956；表1）。與正常甲狀腺組織相比，ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA 在結(jié)節(jié)性增生組織中表達(dá)水平顯著降低（H=25.806，P=0.000；表1）；與結(jié)節(jié)性增生組織相比，ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA在PTC 組織中的表達(dá)水平顯著降低（F=25.812，P=0.000；表1）。以上結(jié)果表明ERβ mRNA（0N-1）在總ERβ mRNA 中發(fā)揮主要作用，且ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA 的表達(dá)水平從正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織到PTC 組織逐漸降低。

2.5 ERβ5′非翻譯區(qū)在正常甲狀腺細(xì)胞和PTC細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)

圖3 ERβ mRNA 及其異構(gòu)體在正常甲狀腺細(xì)胞和甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.3 The expression levels of ERβ mRNA and ERβ mRNA isforms in human normal thyroid cells and PTC cells

亞硫酸氫鹽測序檢測Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BC?PAP 細(xì)胞中ERβ基因啟動(dòng)子0K、啟動(dòng)子0N 和外顯子0N 的甲基化狀態(tài)。如圖4 和表2 所示，啟動(dòng)子0K CpG 島在Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞中未甲基化或低甲基化。啟動(dòng)子0N 和外顯子0N CpG島在Nthy-ori3-1 細(xì)胞中未甲基化或低甲基化，而在BCPAP 細(xì)胞中呈現(xiàn)中度甲基化狀態(tài)。

2.6 ERβ 5′非翻譯區(qū)在正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織和PTC 組織中的甲基化狀態(tài)

亞硫酸氫鹽測序檢測從正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織和PTC 組織中提取的濾泡上皮細(xì)胞中ERβ基因啟動(dòng)子0K、啟動(dòng)子0N 和外顯子0N的甲基化狀態(tài)。如圖5 所示，在所有組織中，啟動(dòng)子0K CpG 島甲基化程度都較低，而啟動(dòng)子0N 和外顯子0N 的CpG 島甲基化程度較高。如表3 所示，在正常甲狀腺組織中，啟動(dòng)子0K、啟動(dòng)子0N和外顯子0N CpG 島未甲基化（6/10，6/10）或低甲基化（4/10，4/10），無中度甲基化和高甲基化；在結(jié)節(jié)性增生組織中，啟動(dòng)子0K CpG 島無中度甲基化和高甲基化，而啟動(dòng)子0N 和外顯子0N CpG 島有6/10 例中度甲基化和1/10 例高甲基化；在PTC組織中，啟動(dòng)子0K CpG 島無中度甲基化和高甲基化，而啟動(dòng)子0N和外顯子0N CpG 島有4/10 例顯示中度甲基化，以及5/10 例顯示高甲基化。以上結(jié)果顯示，啟動(dòng)子0N 和外顯子0N 在ERβ基因CpG島甲基化中占主導(dǎo)地位，且啟動(dòng)子0N 和外顯子0N CpG 島甲基化狀態(tài)從正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織到PTC 組織逐漸增加。

表1 ERβ mRNA 及其異構(gòu)體在各組中的表達(dá)Table 1 The expression levels of ERβ mRNA and ERβ mRNA isforms in tissue specimens of each groups ［n=10，M（P25～P75）］

圖4 ERβ5′非翻譯區(qū)在正常甲狀腺細(xì)胞和甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中的DNA 甲基化狀態(tài)Fig.4 DNA Methylation status of ERβ 5′-untranslated region in human normal thyroid cells and PTC cells

表2 ERβ5′非翻譯區(qū)在正常甲狀腺細(xì)胞和甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中的DNA 甲基化狀態(tài)Table 2 DNA Methylation status of ERβ 5′-untranslated region in human normal thyroid cells and PTC cells

圖5 ERβ5′非翻譯區(qū)在正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織和PTC 組織中的DNA 甲基化狀態(tài)Fig.5 DNA Methylation status of ERβ 5′-untranslated region in tissue specimens of normal thyroid，nodular hyperplasia and PTC

表3 ERβ5′非翻譯區(qū)在各組中的甲基化狀態(tài)Table 3 DNA Methylation status of ERβ 5′-untranslated region in tissue specimens of each groups

2.7 DNA 去甲基化對ERβ mRNA 及其異構(gòu)體表達(dá)水平的影響

應(yīng)用DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2′-de?oxycitidine（5-aza-dC）處理Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP細(xì)胞后，qRT-PCR結(jié)果顯示，在Nthy-ori3-1細(xì)胞中，ERβ mRNA（0K-1）、ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA 在兩組間的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.998，0.160，0.159，P=0.374，0.880，0.881；圖6A）。在BCPAP細(xì)胞中，ERβ mRNA（0K-1）處理前后的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.054，P=0.351；圖6B），而5-aza-dC 處理后的ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA 表達(dá)水平顯著高于未處理組（t=7.722，6.573，P=0.002，0.003；圖6B）。結(jié)果說明，5-aza-dC 處理重新激活了BCPAP 細(xì)胞中ERβ mRNA（0N-1）與ERβ mRNA的表達(dá)，而對ERβ mRNA（0K-1）無影響。

3 討論

已有研究表明雌激素對PTC 的發(fā)生發(fā)展具有刺激作用，其生物學(xué)作用主要由ERα和ERβ介導(dǎo)［13］。ERα可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和生長，與之相反的是，ERβ可抑制腫瘤細(xì)胞生長，并在PTC 中具有保護(hù)作用［14］。多項(xiàng)研究表明ERβ可作為腫瘤治療的潛在靶標(biāo)，因其對腫瘤細(xì)胞增殖有負(fù)調(diào)控作用，ERβ還可調(diào)節(jié)控制細(xì)胞進(jìn)程與凋亡的基因來介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展，其丟失可能與癌變、預(yù)后不良以及對內(nèi)分泌治療抵抗相關(guān)［15-16］。我們課題組前期研究［8］發(fā)現(xiàn)，ERβ可抑制PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，而腫瘤較大、存在甲狀腺外擴(kuò)散、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期高（Ⅲ-Ⅳ）的甲狀腺乳頭狀癌患者的ERβ蛋白表達(dá)水平較低。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常甲狀腺細(xì)胞及組織相比，ERβ蛋白表達(dá)水平以及ERβ mRNA（0N-1）和總ERβ mRNA 的表達(dá)水平在PTC 中明顯下調(diào)，且從正常甲狀腺組織到結(jié)節(jié)性增生組織再到PTC 組織逐漸降低，我們將進(jìn)一步探討這是否與其5′非翻譯區(qū)CpG 島甲基化相關(guān)。

DNA甲基化通常發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤（CpG）二核苷酸的胞嘧啶上，CpG 二核苷酸簇即CpG 島，一般位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的啟動(dòng)子區(qū)域［17］。在腫瘤研究中常認(rèn)為DNA 甲基化是一種阻止基因表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制，DNA 高甲基化可抑制基因表達(dá)［18-19］。在正常細(xì)胞組織中未甲基化的CpG島常在癌變過程中發(fā)生高甲基化，因此許多對DNA 甲基化的研究都聚焦于CpG 島的甲基化狀態(tài)［20］。例如，研究發(fā)現(xiàn)，腺瘤性結(jié)腸息肉?。╝de?nomatouspolyposis coli，APC）基因啟動(dòng)子CpG 島在結(jié)腸癌［21］、乳腺癌［22］等腫瘤中發(fā)生高甲基化。E-cadherin基因在乳腺癌［23］、卵巢癌［24］等腫瘤中轉(zhuǎn)錄沉默與其CpG 島甲基化相關(guān)。本研究通過亞硫酸氫鹽測序發(fā)現(xiàn)，ERβ啟動(dòng)子0N 和外顯子0N CpG 島在PTC 細(xì)胞和組織中的甲基化程度明顯高于正常甲狀腺，且其甲基化狀態(tài)從正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性增生組織到PTC 組織逐漸增強(qiáng)，在PTC組織中最為廣泛。由此可見，ERβ基因CpG 島甲基化可能是引起ERβ表達(dá)在PTC 形成過程中逐漸降低的原因。

圖6 DNA 去甲基化對正常甲狀腺細(xì)胞和甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中ERβ mRNA 及其異構(gòu)體的影響Fig.6 Effects of DNA demethylation on the expression levels of ERβ mRNA and ERβ mRNA isoforms in human normal thyroid cells and PTC cells

Suzuki 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中，ERβ啟動(dòng)子0N 和外顯子0N 高甲基化與ERβ1，ERβ2 和ERβ4 mRNA 表達(dá)缺失之間存在著顯著的相關(guān)性。Al-Nakhle H 等［9］研究認(rèn)為位于ERβ基因5′非翻譯區(qū)的啟動(dòng)子0N 和外顯子0N 異常DNA 甲基化可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。與以上研究結(jié)果相似的是，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子0N 和外顯子0N CpG 島在PTC 中廣泛甲基化，而啟動(dòng)子0K CpG島未甲基化或呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。應(yīng)用DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC 處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC 可恢復(fù)ERβ mRNA（0N-1）在PTC 細(xì)胞中的表達(dá)，但不能恢復(fù)ERβ mRNA（0K-1）的表達(dá)。這表明啟動(dòng)子0N 和外顯子0N CpG 島甲基化在ERβ基因低表達(dá)中占主導(dǎo)地位。DNA 甲基化過程主要由三種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltrans?ferase，DNMT）（DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b）介導(dǎo)，DNMTs 可催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至CpG 島中的胞嘧啶［25-27］，而PTC 中ERβ是否存在特異的DNMTs 和去甲基化酶目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道，需進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，ERβ常在甲狀腺乳頭狀癌中低表達(dá)可能是其5′非翻譯區(qū)CpG 島甲基化引起的，尤其是啟動(dòng)子0N 和外顯子0N CpG 島廣泛甲基化。DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC 可逆轉(zhuǎn)ERβCpG 島甲基化，這可為PTC 的基礎(chǔ)研究與治療預(yù)后提供新的研究方向。但ERβ發(fā)生DNA 甲基化的原因及機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。