INI1誘導上皮樣肉瘤細胞向脂肪方向分化

謝顯彪，溫麗麗，呂東明，鄒雨桐，姚 浩，彭挺生

（1.中山大學附屬第一醫(yī)院骨腫瘤科，廣東廣州 510080；2.廣東省骨科學重點實驗室，廣東廣州 510080；3.中山大學腫瘤防治中心麻醉科，廣東廣州 510060；4.中山大學附屬第一醫(yī)院病理科，廣東廣州 510080）

上皮樣肉瘤是一種好發(fā)于青少年四肢及軀干的軟組織惡性腫瘤。本病組織來源不明，現(xiàn)多認為其起源于原始間葉細胞，腫瘤細胞具備向上皮及間葉方向分化能力，同時表達上皮標志物如細胞角蛋白（cytokeratin）、上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）及間葉標志物如波形蛋白（vimentin）。臨床上該腫瘤表現(xiàn)為皮下或深部軟組織緩慢生長的無痛性腫塊，易通過淋巴道及血道轉移，切除后易復發(fā)，預后較差。目前手術是該病主要治療手段，患者五年生存率僅為60%～75%，復發(fā)率29%～85%，局部淋巴結轉移率22%～48%，遠處轉移率27%～62.5%，肺是最常見遠處轉移部位［1-2］。近年來研究者們發(fā)現(xiàn)約90%上皮樣肉瘤中存在特征性的整合酶相互作用分子1（integraseinteractor 1，INI1）表達缺失現(xiàn)象［3-4］，然而INI1 在上皮樣肉瘤中的作用及分子機制尚未闡明。因此，本研究主要是進一步探討INI1 在上皮樣肉瘤中的作用及分子機制，為治療上皮樣肉瘤提供相應理論基礎及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

DMEM 培養(yǎng)基、2.5 g/L 胰酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（廣州天駿生物科技有限公司，貨號：C11995、03-050-1A、10270-106、03-034-1B、A056），pTet-tTS質粒（Clontech 公司），強力霉素（doxycycline，Dox）購于江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司（貨號：M40613-5g），RIPA 裂解液、DMSO（廣州恒研生物科技有限公司，貨號：RIPA-EA0002、DMSO-1084ML100），INI1 抗體、Cytokeratin 抗體、Vimentin抗體、Leptin 抗體、Adiponectin 抗體、LPL 抗體、PPAR-γ抗體、CEBP-α抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（上海艾博抗生物科技有限公司，貨號：ab192864、ab756、ab92547、ab3583、ab133347、ab21356、ab45036、ab40764、ab6728），β-actin（CST公司，貨號：4970）。

1.2 細胞株與細胞培養(yǎng)

上皮樣肉瘤細胞株VA-ES-BJ、上皮惡性腫瘤細胞株A549 及MDA231、其他間質肉瘤細胞株MFH 及SK-LMS、正常細胞NHDF 及HC-SMC 均購于ATCC，在含有100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃及體積分數(shù)5%CO2下培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次。

1.3 MTT 法檢測細胞增殖速度

取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化制成單細胞懸液并計數(shù)，吹勻細胞，接種于96 孔板中，每組設3 個復孔，接種密度1×104個/孔。接種后24 h 分別更換成含Dox 1 mg/mL 及0 mg/mL 的培養(yǎng)基，連續(xù)7 d 進行測定，加入20 μL 的5 g/L MTT 溶液后培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，待結晶完全溶解后，在Bio-Rad550 酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度，繪制增殖曲線。

1.4 蛋白印跡法

將107個細胞收集于預冷的EP 管中，向EP 管中加入0.2 mL 的裂解緩沖液（7 mol/L urea，2 mol/L thiourea，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，2 mmol/L PMSF）后反復吹打直至細胞完全裂解；室溫靜置30 min，4℃，15 000×g離心60 min，取上清即為總蛋白質。按照碧云天的試劑盒說明書抽提細胞漿蛋白。進行SDS 電泳后電轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。1∶1 000一抗4 ℃孵育過夜。1∶5 000 二抗室溫孵育1 h，最后加入化學發(fā)光劑進行檢測，X 線片暗室曝光，常規(guī)顯影定影。使用Image J 軟件進行目標蛋白相對表達水平的分析。

1.5 石蠟切片免疫組化

將組織切片脫蠟并水化；加入EDTA 修復液于微波中檔修復10 min；加入3%的過氧化氫滅活；加入5%正常血清37℃封閉30 min；加入一抗（1∶200）4 ℃濕盒孵育過夜，PBS 沖洗3 次，每次3 min；滴加辣根過氧化物酶標記二抗，37 ℃孵育30 min；滴加新鮮配制的DAB 顯色液10 min，水洗；蘇木素復染1 min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，水洗；脫水固定，滴加中性樹脂，加蓋玻片，自然晾干，在顯微鏡下觀察并采集圖像。染色結果判讀標準，把染色腫瘤細胞強度分為0、1、2、3 四類，分別為無、弱、中、強信號。把染色腫瘤細胞百分比分為0、1、2、3、4 五級，分別對應無染色、1%～10%、11%～50%、51%～80%及81%～100%。每個組織的得分是用染色值乘以百分比分類值來計算的，最后得分取兩位病理學家雙盲閱片下的平均分，陽性等級：0 分為陰性，1～4 分為弱陽性，5～8 分為陽性，9～12 分為強陽性。

1.6 油紅染色

細胞爬片，用10%中性甲醛固定30 min，60%異丙醇浸洗，0.5%油紅O 60 ℃染色8 min，85%異丙醇洗3 min，蒸餾水洗，Mayer 蘇木素復染，水洗并甘油明膠封片，倒置顯微鏡下拍片。

1.7 INI1 Tet-on 誘導表達建立

將pTet-tTS 質粒以脂質體法轉染VA-ES-BJ細胞，通過G418 篩選細胞克隆。以雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)篩選挑選高表達低背景的嚴密型Tet-on 細胞克隆。共轉染PBI-EGFP-INI1-HA/PTK-Hyg，通過潮霉素B 篩選并鑒定相關克隆。加入Dox 1 mg/mL 培養(yǎng)基培養(yǎng)后收集細胞提取蛋白做INI1 蛋白表達鑒定，同時取部分細胞于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白GFP 的表達情況，鑒定出高表達低背景的細胞克隆擴增凍存。

1.8 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析使用SPSS 21.0 軟件，圖形繪制使用GraphPad Prism 8.0。每組實驗重復3 次，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差描述；兩組間比較，各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時用t檢驗；若呈正態(tài)分布但方差不齊時則采用秩和檢驗。多組計量資料數(shù)據(jù)比較，符合正態(tài)分布及方差齊性的用one-way ANOVA 分析方法；組間兩兩比較用Tukey 檢驗。檢驗水準α=0.05（雙側），P<0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 INI1 在上皮樣肉瘤中表達缺失

通過Western blot 檢測正常細胞間葉細胞-成纖維細胞NHDF 及平滑肌細胞HC-SMC，上皮來源性惡性腫瘤-肺癌細胞株A549 及乳腺癌細胞株MDA231，上皮樣肉瘤細胞株VAESBJ 及Epi544，其他間質來源惡性腫瘤-惡性纖維組織細胞瘤細胞株MFH 及平滑肌肉瘤細胞株SK-LMS，我們發(fā)現(xiàn)正常細胞株、上皮來源惡性腫瘤細胞株及其他間質來源的肉瘤細胞株中均存在INI1 表達，僅僅在上皮樣肉瘤細胞株VA-ES-BJ、Epi544 中存在INI1 表達缺失的現(xiàn)象（P<0.05；圖1A）。免疫組化檢測上皮樣肉瘤臨床標本發(fā)現(xiàn)91%標本中存在INI1 蛋白表達缺失（圖1B）。

2.2 利用Tet-on 系統(tǒng)重建VA-ES-BJ 細胞中INI1 表達

首先轉染pTet-tTS 質粒建立Tet-on 細胞，最后轉染PBI-EGFP-INI1-HA/PTK-Hyg，通過潮霉素B 篩選并鑒定穩(wěn)定轉染INI1 克隆，獲得5 及21號克隆細胞。在細胞培養(yǎng)液加入Dox 1mg/ml 誘導后，可見5、21 號克隆細胞中INI1 表達顯著上調，而對照組INI1 表達仍為缺失（P<0.05；圖2）。倒置熒光顯微鏡下可以觀察到Dox 1mg/mL 誘導后5、21號克隆細胞中出現(xiàn)明顯的綠色熒光（圖2）。

2.3 重建INI1 表達誘導VA-ES-BJ 細胞向脂肪方向分化

在加入Dox 誘導INI1 持續(xù)表達7 d 后，在普通倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)發(fā)生改變，胞漿逐步豐富變，胞漿中出現(xiàn)大量空泡，細胞增殖速度明顯抑制（P<0.05，圖3A、B），同時上皮細胞標記分子Cytokeratin 明顯下調，間質細胞標記分子Vimentin依然大量表達（P<0.05；圖3C），進一步檢測脂肪細胞相關標記物，發(fā)現(xiàn)瘦蛋白（Leptin）、脂聯(lián)素（adiponectin）和脂蛋白酯酶（lipoprotein，LPL）表達上調（P<0.05；圖3D）。這些結果提示重建INI1 表達可誘導上皮樣肉瘤細胞向脂肪方向分化。

2.4 重建INI1 誘導的VA-ES-BJ 細胞中脂肪形成轉錄因子的表達上調

圖1 INI1 在上皮樣肉瘤中的表達情況Fig.1 Expression of INI1 in epithelioid sarcoma

圖2 重建VA-ES-BJ 細胞中的INI1 表達Fig.2 Reconstruction of INI1 expression in VA-ES-BJ cells

我們進一步在VA-ES-BJ 細胞中檢測脂肪分化過程中的兩種脂肪分化過程中關鍵轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome prolif?erators-activated receptor-γ，PPAR-γ）及CCAAT 增強子結合蛋白-α（CCAATenhancer binding proteinα，CEBP-α）的蛋白表達水平。我們發(fā)現(xiàn)隨著INI1誘導表達，PPAR-γ和CEBP-α表達均明顯上調（P<0.05；圖4A）。同時，重建INI1 后油紅染色出現(xiàn)顯著陽性（圖4B）。上述結果表明INI1 可能通過上調脂肪分化中的關鍵轉錄因子PPAR-γ和CEBP-α來促進上皮樣肉瘤細胞向脂肪方向分化。

3 討論

圖3 重建INI1 誘導VA-ES-BJ 細胞向脂肪方向分化的影響Fig.3 Reconstruction of INI1 induces adipocytic differentiation of VA-ES-BJ

本研究證實在上皮樣肉瘤細胞VA-ES-BJ 及Epi544 中INI1 蛋白表達缺失，在臨床標本中91%存在INI1 蛋白表達缺失，與既往報道的基本一致。Hornick［5］等報道臨床上約90%上皮樣肉瘤中存在INI1 缺失現(xiàn)象。INI1 是ATP 依賴的染色質重塑復合物SWI/SNF（switch/sucrose non-ferment?able）的核心蛋白亞基之一。SWI/SNF 復合物是一種進化保守的多亞單位蛋白復合物，它能夠利用ATP 水解產(chǎn)生能量動員核小體，通過滑動、重建、分離、置換等作用介導染色質解壓縮、重塑，從而調節(jié)靶基因轉錄，這種基因表達調解方式是表觀遺傳學重要調控機制之一［6-7］。INI1缺失可嚴重影響SWI/SNF 復合物活性，染色質重塑異常，導致基因表達失控［8-9］。INI1 純合性缺失的小鼠在胚胎早期死亡，雜合性缺失小鼠中約20%在12 個月左右形成低分化或未分化軟組織肉瘤，這些腫瘤侵襲性極強，75%發(fā)生淋巴結或肺轉移［10］。Brenca等［11］證明上皮樣肉瘤細胞系VASEBJ 中INI1 表達的缺失是由于外顯子1 突變導致INI1 純合缺失所致，INI1 的重建導致細胞增殖和細胞遷移減少，并增加了對遺傳毒性應激的敏感性。而Imura 等［12］發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR 信號通路在兩個INI1 缺失的細胞系VAESBJ 和Asra-EPS 中持續(xù)激活，通過干擾mTOR 可以抑制腫瘤細胞的增殖。由此可見，INI1在腫瘤發(fā)生過程中起到重要的抑癌作用。INI1 的缺失通過對基因組穩(wěn)定性、細胞周期調控及其他信號通路相關靶基因的異常調控導致腫瘤轉化［13］。由此可見，INI1 在上皮樣肉瘤發(fā)病中具有重要作用。

圖4 INI1 上調脂肪形成轉錄因子的表達Fig.4 INI1 up-regulates expression of adipogenic transcription factors

鑒于INI1 的抑癌功能，本研究通過Tet-on 系統(tǒng)在上皮樣肉瘤細胞中重建INI1 表達。最新研究發(fā)現(xiàn)INI1 在胚胎發(fā)育和細胞分化中扮演重要角色。Gresh 等［14］采用肝臟特異性INI1 敲除動物模型發(fā)現(xiàn)70%與正常肝臟發(fā)育相關的基因下調，表明INI1 與肝細胞分化密切相關。在鼠3T3-L1 脂肪前體細胞及人間充質干細胞中，干擾INI1 表達可抑制其向脂肪及神經(jīng)細胞方向分化［15］，鼠PC12細胞中干擾INI1 表達可抑制神經(jīng)生長因子誘導的神經(jīng)細胞向分化［16］。誘導表達INI1 后我們發(fā)現(xiàn)胞漿豐富，胞漿中出現(xiàn)大量空泡，細胞增殖速度明顯抑制，上皮細胞相關標志物Cytokeratin 消失，脂肪細胞相關標記物如瘦蛋白、脂聯(lián)素、脂蛋白脂酶表達上調，同時油紅染色出現(xiàn)特征性陽性，提示腫瘤細胞出現(xiàn)向脂肪方向分化。

既往有研究報道，棕色脂肪細胞和白色脂肪細胞分化都需要轉錄因子PPAR-γ和CEBP-α，它們在細胞向脂肪方向分化中起到關鍵作用［17-18］。脂肪生成刺激信號通過激活PPAR-γ誘導前脂肪細胞終末分化，隨后PPAR-γ和CEBP-α協(xié)同調控下游脂肪細胞相關基因的表達［19］。特異性靶向抑制PPAR-γ基因可促進人骨髓基質干細胞向成骨分化，同時抑制其成脂防分化［20］。最新研究報道PPAR-γ激動劑吡格列酮和曲貝替定的聯(lián)用能促進粘液樣脂肪肉瘤的終末脂肪分化［21］。本研究在上皮樣肉瘤細胞中重建INI1 后發(fā)現(xiàn)細胞向脂肪方向分化，伴隨PPAR-γ和CEBP-α的上調，表明INI1 可能通過上調PPAR-γ和CEBP-α的表達，促使上皮樣肉瘤細胞向脂肪方向分化，刺激并維持脂肪細胞的表型。

綜上所述，上皮樣肉瘤組織起源于原始間葉細胞，同時具備上皮及間葉方向分化能力，腫瘤細胞中INI1 蛋白表達缺失。在上皮樣肉瘤細胞中重建INI1 表達，通過上調轉錄因子PPAR-γ和CEBP-α表達，誘導其向脂肪方向分化，為該腫瘤提供了誘導分化治療的潛在靶點。