多巴胺受體4對肝癌細胞增殖轉移的影響及預后

嚴 儼 ，張紅英，潘家浩，王冬音，周曉爽，元云飛，曾維安，陳東泰

（中山大學腫瘤防治中心//華南腫瘤學國家重點實驗室//腫瘤醫(yī)學協(xié)同創(chuàng)新中心，1.麻醉科，2.肝膽外科，廣東廣州 510060；3.惠州市中心人民醫(yī)院麻醉科，廣東惠州 516001；4.惠州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東惠州 516001）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在全球每年約出現(xiàn)70 萬例新增病例，其中大部分發(fā)生在亞洲，而在某些地區(qū)，死亡率與發(fā)病率的比值接近1，如今肝癌已經(jīng)成為全球威脅性疾?。?-3］?，F(xiàn)階段，早期肝癌的主要治療仍然是根治性手術，然而，肝癌早期診斷困難，一旦錯過手術時機，只能依靠非手術治療，其中一種確切有效的治療途徑就是分子靶向治療［4-5］。多巴胺受體分為D1 類（DRD1、DRD5）和D2 類（DRD2、DRD3、DRD4）受體并具有不同的理化特性［6］，這些年來，有關多巴胺受體對不同類型腫瘤發(fā)生發(fā)展影響的報道日益增多，如：DRD1 表達陽性的乳腺癌病人預后較差［7］，已有報道證明多巴胺受體抑制劑不僅能夠通過誘導腫瘤干細胞分化而終止腫瘤細胞的自我更新［8］，而且還可以通過抑制AKT 信號通路從而導致乳腺腫瘤的生長受限［9］，而DRD2 不僅在胰腺癌病人中的表達增加，而且其相關的阻滯劑可以抑制ERK 信號通路的激活，從而限制腫瘤進展［10］；ERK 作為MAPK 家族成員之一，已有大量研究證明其功能的激活可影響多種腫瘤細胞的生物學特性［11-12］。多巴胺受體與肝癌的關系已有報道，DRD2 激動劑可以有效抑制肝癌細胞的增殖和轉移［13］，DRD4 與DRD2 同為D2 類受體，但腫瘤相關研究相對比較少見，而DRD4 對肝癌包括預后以及治療相關的報道仍然沒有。本次研究旨在嘗試探討DRD4 是否可以用于預測肝癌患者預后，以及DRD4 對肝癌細胞的作用，從而初步揭示DRD4 在肝癌發(fā)生發(fā)展中扮演的角色，并為以后更深層次的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 肝癌組織樣本

本研究經(jīng)中山大學腫瘤防治中心臨床研究倫理委員會（中國廣州）批準，并獲得受試者的知情同意。本研究使用了196 例HCC 患者的組織樣本做免疫組化檢測，以及收取74 例患者的肝癌組織和相鄰非肝癌組織做real time qPCR 檢測。所有患者都是在2003 年至2008 年間在中山大學腫瘤防治中心（中國廣州）肝膽外科接受了同一位外科醫(yī)生執(zhí)行的原發(fā)性肝癌切除術。其中男168 人，女28 人，平均年齡49.7 歲（20～79 歲）。中位隨訪期為54 個月（1～127 個月）。

1.2 肝癌細胞系

人肝癌細胞株包括MHCC-97H、MHCC-97L、Hep-3B、SK-Hep-1、PLC-8024、Huh7、Hep-G2 以及非肝癌細胞（Miha）均來自中科院上海細胞庫。細胞培養(yǎng)基采用混勻100 mL/L 胎牛血清（GIBCO，USA）的DMEM（GIBCO，USA）并內含0.1 g/L 青霉素以及0.1 g/L streptomycin，細胞培養(yǎng)箱保持37 ℃恒溫，CO2濃度體積比為5%，濕度為85%。細胞培養(yǎng)至3～6 代作為實驗材料。

1.3 試 劑

DRD4 抗體（LS-C22901），購自LifeSpan（USA）；EnVision 免疫組化超敏試劑盒（Cat.NO：GK500710），購自Gene Tech；Dimethyl Sulfoxide（DMSO，20-139），DRD4激動劑PD-168077（P233）以及DRD4 阻滯劑L-745870（L131），購自Sigma（USA）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒從同濟化工研究所購置；ERK 抑制劑PD98059（S1177）購自Selleck（USA）；ERK（4695S），p-ERK（4370S）以及抗兔二抗購買自Cell signaling technology（USA）。

1.4 免疫組化

用100 mL/L 福爾馬林固定HCC 患者的組織標本，用石蠟包埋后進行連續(xù)切片備用。組織玻片經(jīng)過2 h 60 ℃烘烤并脫蠟后，使用酒精梯度水化并用30 mL/L H2O2封閉45 min。在檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中使用中高火微波5 min 以及中火15 min 修復抗原，4 ℃DRD4 抗體孵育過夜，一抗稀釋液為陰性對照；多次PBS 清洗抗體后，37℃溫箱孵育二抗30 min，DAB 試劑套裝（DAKO，Car?pinteria，CA）顯色并用蘇木素染細胞核。顯微鏡下進行檢測。兩位經(jīng)正規(guī)培訓的病理科醫(yī)生采用雙盲法并根據(jù)德國免疫反應評分（IRS）對結果進行評估。根據(jù)染色強度，將DRD4 蛋白染色分為：0=無染色，1=染色弱，2=染色中等，3=染色強。另外，腫瘤陽性組織的百分比分別為0（<10%）、1（10%～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）、4（>75%）。將兩個評分相乘，并對每個病例進行加權評分，確定結果分為兩組：≥2 分定為DRD4 高表達，<2 分為DRD4 低表達［14-15］。

1.5 實時定量PCR

實時定量PCR（real-time quantitative PCR，Real time qPCR）實驗按照說明書操作步驟使用TRIzol（Invitrogen，Carlsbad，CA）從HCC組織以及細胞系中提取RNA。采用PrimeScriptRT 試劑盒（Takara，Dalian）進行逆轉錄得到cDNA。以GAPDH 為內源性對照，GADPH 和DRD4 的特異性引物序列（Invitrogen）見表1。使用SYBR Green qPCR Super Mix 和ABI7900HT 序列檢測系統(tǒng)運行程序進行反應并以每個反應曲線只有一個峰視為有效結果。

表1 用于Real time qPCR 的引物序列Table 1 Primer sequences used in the Real time qPCR

1.6 細胞增殖實驗

參照肝癌細胞系Real time qPCR 的結果，選擇合適的細胞株進行細胞增殖實驗。根據(jù)實驗需要共分8組，其中PD-168077（100、10、1 nmol/L）3 組，對照組1 組；L-745870（10、1、0.1 nmol/L）3組，對照組1 組。在96 孔培養(yǎng)板上接種細胞，每組5 個孔，每個孔6×103個細胞，總體積為100 μL；過夜后加入對應濃度的藥物，對照組加入1 mL/L DMSO，經(jīng)過24 h作用后每個孔加入10 μL CCK-8，細胞培養(yǎng)箱孵育2 h，使用酶標儀在450 nm（OD450）處檢測各孔的OD 值。

1.7 蛋白免疫印跡實驗

HCC 細胞分為3 組：Control 組，PD-168077（100 nmol/L）處理組以及L-745870（1 nmol/L）處理組，藥物處理24 h 后，使用含蛋白酶抑制劑Cocktail Set I（Calbiochem）的細胞裂解緩沖液（Cell Signaling）提取蛋白，并根據(jù)BCA 蛋白檢測試劑盒（Pierce）的說明書測定蛋白濃度。待測蛋白用100 mL/L 的SDS-PAGE 電泳完畢后便電轉至polyvinylidene fluoride 膜（PVDF，Millipore）。一抗［（ERK（1∶1 000 稀釋）、p-ERK（1∶1 000 稀釋）］4 ℃孵育過夜后再用兔二抗（1∶5 000 稀釋）室溫孵育1 h。使用BeyoECL plus 發(fā)光液（Beyotime Bio?technology）發(fā)光并拍攝。

1.8 細胞遷移和侵襲實驗

該實驗通過Transwell 小室法測定，其中遷移實驗使用具有8-μm 孔聚碳酸酯膜的小室（BD Bioscience，Becton，NJ），而侵襲實驗則使用具有基質膠的小室（Corning，NY，USA）。將SK-Hep-1 的1×104個細胞分別加入含有PD-168077，L-745870和1 mL/L DMSO的無血清DMEM 的小室中，接著將小室放入含血清DMEM 的24 孔板中。培養(yǎng)箱孵育24 h 后，用棉簽擦拭未轉移的細胞，無水酒精固定穿過膜的細胞后使用結晶紫染色。顯微鏡下拍片并計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)分析使用GraphPad 和SPSS 22.0 版本進行?？ǚ綑z驗用于校驗DRD4 與臨床相關病理因素的關系。DRD4 預后生存分析通過使用Kaplan-Meier 法。Log-rank 和逐步Cox 回歸分析法分別對所有預后因素進行單因素以及多因素分析。獨立樣本Student′st檢驗用來分析比較兩組數(shù)據(jù)的差異；多組數(shù)據(jù)比較，采用One way-ANOVA 進行方差齊性分析，差異有統(tǒng)計學意義時采用Bonferroni 法進行兩兩比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DRD4 蛋白在肝癌組織切片中的表達情況

組織切片免疫組化染色結果顯示，在196 例肝癌組織中有85 例（43.4%）有DRD4 蛋白表達，表達定位主要在細胞漿中，而其余111 例（56.6%）則沒有表達DRD4 蛋白，證明DRD4 蛋白在肝癌組織中表達比例較低；本研究根據(jù)染色強度以及面積，把免疫組化結果分為DRD4 高表達以及DRD4 低表達（圖1）。

2.2 DRD4 mRNA 在肝癌以及非肝癌細胞株、肝癌組織以及相鄰非肝癌組織中的表達情況

Real time qPCR 結果顯示：在74 對肝癌以及非癌組織中，非癌組織中的DRD4mRNA（1.151±0.382）表達要高于癌組織（0.220±0.055；t=2.414，P=0.017；圖2A）；在蛋白和mRNA 表達水平上，DRD4在不同細胞株的表達中并不一致（圖2B，C）。

2.3 DRD4 與HCC 術后患者預后相關臨床病理因素的分析

由表2 的結果可見DRD4 的表達與患者年齡相關并差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而DRD4的表達與其他預后相關臨床病理因素無顯著相關性（P>0.05；表2）。

2.4 所有預后相關臨床病理因素與肝癌術后患者無復發(fā)生存期以及總生存期的單因素分析

本課題引入已有的臨床病理資料可能會影響患者完成肝癌切除術后的預后相關各種生理病理因素，而根據(jù)研究者的結果提示了乙肝表面抗原陽性、腫瘤大小、衛(wèi)星結節(jié)、腫瘤分期、TNM 分期以及DRD4 的表達都與無復發(fā)生存期（recurrencefree survival，RFS）相關，除此之外，腫瘤大小、衛(wèi)星結節(jié)、血管侵犯、腫瘤分期以及DRD4 的表達還與總生存期（overall survival，OS）相關（表3）。

2.5 196 例肝癌切除術后患者DRD4 表達與預后的生存分析

圖1 DRD4 在肝癌組織中的表達Fig.1 Immunohistochemical staining of DRD4 protein expression in HCC

通過Kaplan-Meier 法進行的DRD4 與術后患者預后生存分析，DRD4 表達陽性患者的RFS 中位生存期為60（26.5～88.5）個月；OS 中位生存期為74（51～91.5）個月；DRD4 表達陰性患者的RFS 中位生存期為30（12～77）個月；OS 中位生存期為62（40～88）個月。研究者發(fā)現(xiàn)DRD4 在肝癌組織中表達高的患者包括RFS 和OS 都要比DRD4 表達低的患者生存期長，而且差異具有統(tǒng)計學意義（RFS 的χ2=5.235，P=0.022，圖3A；OS 的χ2=7.866，P=0.005，圖3B）。

2.6 影響預后的臨床病理因素與肝癌術后患者RFS 以及OS 的多因素分析

圖2 DRD4 mRNA 在肝癌與非癌組織以及肝癌細胞系中的表達Fig.2 DRD4 expression in tumor（T）tissues，non-tumor（NT）tissues and HCC cell lines

表2 196 例肝癌組織DRD4 表達與臨床病理因素的關系Table 2 DRD4 expression and clinic pathological characteristics of 196 HCC1）［n（%）］

表3 196 例肝癌切除術后患者無復發(fā)生存期以及總生存期的單因素分析Table 3 Univariate analyses of RFS and OS rates for 196 HCC patients after curative

圖3 DRD4 表達水平與肝癌切除術后患者預后的生存分析Fig.3 DRD4 expression in correlation with RFS and OS of HCC patients after curative resection by Kaplan-Meier survival analysis

通過逐步Cox 多因素回歸分析所知的與RFS以及OS 預后相關的臨床病理因素包括乙肝表面抗原陽性、腫瘤大小、衛(wèi)星結節(jié)、血管侵犯、腫瘤分期、TNM 分期以及DRD4 表達水平等。研究者發(fā)現(xiàn)DRD4 表達水平是影響肝癌切除術后患者RFS以及OS 的獨立預后因素（P<0.05），另外乙肝表面抗原、腫瘤大小以及衛(wèi)星結節(jié)是影響患者RFS 的獨立因素，而腫瘤分級是影響患者OS 的獨立預后因素（P<0.05；表4）。

2.7 細胞增殖實驗

根據(jù)肝癌細胞系DRD4 的表達情況，選擇SKHep-1作為實驗細胞株，結果表明經(jīng)過24 h的DRD4激動劑PD-168077 處理后，細胞增殖受到抑制，并隨藥物濃度梯度遞增，其中100 nmol/L 濃度抑制明顯（t=4.834，P<0.001）；而經(jīng)過DRD4 阻滯劑L-745870 的處理后，研究者發(fā)現(xiàn)細胞增殖在藥物濃度0.1nmol/L 以及1 nmol/L 的時候有不同程度的升高，而且1 nmol/L 濃度L-745870 的效果更加顯著（t=5.212，P<0.001），而當使用10 nmol/L 濃度處理細胞后，細胞增殖不明顯（圖4）。

2.8 細胞遷移和侵襲實驗

根據(jù)不同濃度PD-168077 和L-745870 對SK-Hep-1 增殖的影響，選擇100 nmol/L 濃度的PD-168077 和1 nmol/L 濃度的L-745870 進行細胞遷移（Migration）和侵襲（Invasion）實驗。結果顯示PD-168077 能顯著抑制SK-Hep-1 的Migration（t=6.313，P=0.002）以及Invasion（t=3.051，P=0.045）；而L-745870 則出現(xiàn)相反的結果并明顯促進SKHep-1 的Migration（t=9.443，P<0.001）以及Inva?sion（t=4.049，P=0.014；圖5）。

表4 196 例肝癌切除術后患者無復發(fā)生存期和總生存期的逐步Cox 多因素回歸分析Table 4 Cox multivariate analysis of prognostic factors to RFS and OS in 196 HCC patients after curative resection

圖4 PD-168077 與L-745870 對SK-Hep-1 增殖的影響Fig.4 The influence on proliferation of SK-Hep-1 after treatments with PD-168077 or L-745870

2.9 DRD4 可能通過ERK 信號通路影響肝癌細胞功能

通過查詢KEGG 信號通路數(shù)據(jù)庫得知DRD4可調節(jié)MAPK 信號家族，而ERK 是MAPK 家族中重要的一員。Western blot 結果顯示PD-168077 抑制ERK 蛋白的磷酸化（t=3.318，P=0.032），而L-745870 則可促進ERK 蛋白的磷酸化（t=3.734，P=0.019）；而使用ERK 抑制劑PD98059（10 μmol/L）可以逆轉L-745870（1 nmol/L）的效應，提示DRD4可以通過調節(jié)ERK 信號通路的活動從而影響肝癌細胞的功能（圖6）。

3 討論

學習已有的研究，我們發(fā)現(xiàn)多巴胺受體與肺癌、乳腺癌、胃癌等涵蓋在內的多種腫瘤的增殖轉移等生物學特性有關，然而現(xiàn)有的研究對象多為DRD1、DRD2［7，10，13，16-21］兩種受體，而DRD4 與腫瘤相關的研究較少，據(jù)我們所知，DRD4 涉及肝癌的研究尚未見有報道，本研究首次嘗試探討DRD4與肝癌術后患者的預后關系以及對肝癌細胞增殖轉移等生物學行為的影響。

圖5 PD-168077 與L-745870 對SK-Hep-1 遷移和侵襲的影響Fig.5 The influence on migration and invasion of SKHep-1 after treatments with PD-168077 or L-745870

圖6 PD-168077 與L-745870 調節(jié)ERK 信號通路Fig.6 DRD4 might regulate the activities of HCC cells via ERK signaling pathway

通過免疫組化檢測肝癌組織切片，我們發(fā)現(xiàn)DRD4 蛋白在肝癌中的表達比例較低（43.4%），除此之外單因素分析結果顯示DRD4 高表達患者的RFS 和OS 均比低表達的患者顯著延長（P<0.05），而且多因素分析結果提示DRD4 更是與肝癌切除術后患者OS 預后相關的獨立因素（P<0.05）。另外Real time qPCR 結果顯示DRD4 mRNA 在肝癌組織中的表達要低于相鄰非肝癌旁組織，由此可知DRD4 從蛋白水平以及mRNA 水平在肝癌組織中都是處于低表達，而且非肝癌細胞株Miha 與肝癌細胞系相比較DRD4 mRNA 表達較高，這些結果都提示了DRD4 在肝癌中可能是一個潛在的抑癌分子。而細胞增殖、遷徙和侵襲實驗結果更是驗證我們的猜想。

通過查詢KEGG 信號通路數(shù)據(jù)庫得知在神經(jīng)系統(tǒng)中DRD4 可通過抑制腺苷酸環(huán)化酶的催化活性，減少cAMP 合成，cAMP 作為信號傳遞中的第二信使可以調控MAPK 家族信號通路，最終影響細胞的各種行為特性等，其中ERK 分子是MAPK 家族信號通路分子中的重要成員，該信號通路分子參與調控細胞的多種生物學特性其中包括腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷徙、侵襲和血管生存等行為［14，22-24］。Dolma 等人發(fā)現(xiàn)DRD4 阻滯劑可以抑制ERK 信號通路，從而阻礙膠質瘤干細胞的增殖自噬等［25］；而本次研究的結果發(fā)現(xiàn)DRD4 的激動劑和阻滯劑可以抑制或者激動ERK分子磷酸化，調控ERK 信號通路，可能從而影響肝癌細胞的惡性生物學行為，該結果與已有的報道不一致，可能的原因是多巴胺受體在不同的腫瘤類型和細胞類型扮演的角色是不一樣，例如：DRD2 在腦膠質瘤以及在肺癌中起到的作用是相反的［16，26］；多巴胺可以促進膽管癌細胞增殖［27］，也可以抑制膠質瘤的生長［28］。然而，腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制及其復雜，仍需進一步的研究明確具體的原因。

綜上所述，DRD4 在肝癌組織中高表達預示著患者有更好的預后，有可能成為獨立預測患者無復發(fā)生存期以及總生成期的分子標志物。DRD4的激動劑和阻滯劑可以通過調節(jié)ERK 信號通路相應增強或者減弱肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的能力，預示著DRD4 可能可以成為肝癌靶向分子治療的作用靶點。本次研究的結果可以為肝癌患者提供新的治療思路。