產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株的篩選及鑒定

孫康，李盼盼，于爽，遲乃玉*

1(大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連，116622)2(遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連，116622)

2-氮雜二環(huán)-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮是一種雙環(huán)酰胺類化合物，俗稱γ-內(nèi)酰胺、文斯內(nèi)酯。它是制藥工業(yè)的一種重要醫(yī)藥中間體，可以合成包括治療艾滋病的阿巴卡韋及治療甲型流感的帕拉米韋在內(nèi)的諸多藥物[1]。作為多種藥物的合成原料，γ-內(nèi)酰胺自身卻是未經(jīng)拆分的外消旋體化合物，包含(-)γ-內(nèi)酰胺及(+)γ-內(nèi)酰胺兩種構(gòu)型。從源頭上拆分(±)γ-內(nèi)酰胺，能為合成單一構(gòu)型藥物奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)更安全和更有效的臨床給藥[2]。

目前，制備單構(gòu)型γ-內(nèi)酰胺的方法有不對(duì)稱合成法、循環(huán)優(yōu)先結(jié)晶法和生物不對(duì)稱拆分法[3-5]。前2種方法存在產(chǎn)率低純度不高等缺陷，生物不對(duì)稱拆分法是利用環(huán)境中篩選到的特定菌株，選擇性降解某一構(gòu)型的γ-內(nèi)酰胺，從而達(dá)到拆分(±)γ-內(nèi)酰胺的目的。生物法具有反應(yīng)條件溫和、效率高、環(huán)境友好、利于工業(yè)放大等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。TAYLOR等[7]最早利用產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶的菌株實(shí)現(xiàn)了(±)γ-內(nèi)酰胺的拆分，并利用(-)γ-內(nèi)酰胺合成了(-)阿巴卡韋。國(guó)內(nèi)鄭國(guó)鈞團(tuán)隊(duì)最早開(kāi)展這方面研究，相繼發(fā)現(xiàn)了硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、氧化烴微桿菌(Microbacteriumhydrocarbonoxydans)、磚紅色微桿菌(Microbacteriumtestaceum)等產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株[8-13]。目前存在的普遍問(wèn)題是菌株立體選擇性差，已報(bào)道菌株中相當(dāng)一部分既產(chǎn)(+)γ-內(nèi)酰胺酶又產(chǎn)(-)γ-內(nèi)酰胺酶，制約了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[14-15]。

本研究利用平板篩選法結(jié)合液相色譜法，從渤海海泥樣品中篩選出2株具有高立體選擇性的產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株，采用形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行了生產(chǎn)小試研究，為2種構(gòu)型γ-內(nèi)酰胺的制備提供了優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑

海泥，采集于遼寧省大連渤海灣；異丙醇、乙腈、正丁醇(均為色譜級(jí))，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；N-乙酰-L-苯丙氨酸(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；剩余其他試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基[16](g/L)：N-乙酰-L-苯丙氨酸2，酵母浸粉0.1，NH4Cl 2，NaH2PO40.1，Na2HPO40.1，MgSO40.1，瓊脂粉20，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基[17](g/L)：酵母浸粉5，葡萄糖5，KH2PO47，MgSO40.4，F(xiàn)eSO40.02，CaCl20.02，NH4Cl 5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高溫滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SHIMADZU-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；250 mm×4.6 mmAS-H手性色譜柱，日本大賽璐公司；LA2-4A1生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；LTI-700恒溫培養(yǎng)箱，上海愛(ài)郎儀器有限公司；2WY-2102C恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司；CR21N大容量冷凍離心機(jī)，日本日立公司；D-37520小容量離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；pHS-3EpH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；YXQ-LS-100Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有效公司；5 L發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司；RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)艾卡公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株的初篩

自然界中存在一些微生物能夠利用N-?；衔镒鳛樗鼈兾ㄒ坏奶荚?，它們中相當(dāng)一部分產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶[18]。篩選培養(yǎng)基以N-乙酰-L-苯丙氨酸作為主要碳源，微生物能在其上生長(zhǎng)即證明菌體有水解酰胺鍵的能力，是γ-內(nèi)酰胺酶的潛在來(lái)源菌株。大連渤海灣海泥樣品共5份，每次取1.0 g左右海泥土樣加入到5 mL無(wú)菌蒸餾水中，充分混勻，隨后進(jìn)行梯度稀釋，取200 μL梯度稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基平板，28 ℃條件下培養(yǎng)2～5 d，菌株陸續(xù)長(zhǎng)出，挑取單菌落使用平板劃線法進(jìn)一步純化。

1.2.2 產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于液體篩選培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)2～5 d。按5%(體積比)的接種量將菌液接種于種子培養(yǎng)基，菌株在種子培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)1 d即可。取100 mL菌液8 000 r/min離心10 min，棄上清液，離心沉淀表面用0.05 mol/L、pH 7.0的磷酸鈉緩沖液清洗，加入10 mL上述磷酸鈉緩沖液重懸菌體。設(shè)立1 h反應(yīng)組和24 h反應(yīng)組，分別取2 mL重懸菌液，加入0.5 mL含質(zhì)量濃度為50 g/L (±)γ-內(nèi)酰胺的磷酸鈉緩沖液，置于28 ℃、 150 r/min搖床中反應(yīng)1、 24 h。反應(yīng)完成后取1.5 mL反應(yīng)液8 000 r/min離心5 min，取0.75 mL上清液，加入0.75 mL正丁醇，反復(fù)混勻靜置實(shí)現(xiàn)萃取。將反應(yīng)液-正丁醇混合液10 000 r/min離心5 min，吸取上層液體過(guò)0.45 μm針頭式濾膜。

采用高效液相色譜檢測(cè)(±)γ-內(nèi)酰胺[19]，高效液相色譜條件為AS-H手性色譜柱，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(異丙醇)=9∶1，流速0.6 mL/min，上樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

1.2.3 產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將試驗(yàn)菌株劃線于固體LB(Luria-Bertani)平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，觀察菌株的菌落形態(tài)特征，并挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：挑取單菌落于5 mL種子培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組，以其為模板，利用引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對(duì)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20]，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，與已知菌種的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取若干條同源性較高的菌株的16S rDNA序列，采用MEGA-X軟件中的鄰接算法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株的小試生產(chǎn)

種子液的制備：將菌株接種于200 mL液體種子培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)1 d。

發(fā)酵罐培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化：按1%(體積比)接種量將種子液接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，裝液量為4 L/5 L，于25 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)20 h。將培養(yǎng)液8 000 r/min離心10 min，采用0.05 mol/L、pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液洗滌沉淀，將沉淀加入到裝有1 L 50 g/L (±)γ-內(nèi)酰胺磷酸鈉緩沖液的發(fā)酵罐中，于25 ℃、200 r/min條件下反應(yīng)24 h。其間每隔數(shù)小時(shí)取樣檢測(cè)，計(jì)算產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值(enantiomeric excess，ee值)，該數(shù)值能直觀反映手性化合物的光學(xué)純度，ee值越高，光學(xué)純度也越高[21]，對(duì)映體過(guò)量值計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：C-為液相分析中(-)γ-內(nèi)酰胺的峰面積；C+為液相分析中(+)γ-內(nèi)酰胺的峰面積。

產(chǎn)物回收：當(dāng)ee值達(dá)到99.0%及以上時(shí)，將反應(yīng)液8 000 r/min離心10 min，上清用500 mL乙酸乙酯萃取，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收干燥，即得到終產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株的篩選

2.1.1 菌株的初篩

利用篩選培養(yǎng)基從海泥樣品中篩選得到24株菌，它們能夠在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)即證明了它們具有水解酰胺鍵的能力，是γ-內(nèi)酰胺酶的潛在來(lái)源菌株，它們中部分在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1 部分初篩菌株的菌落形態(tài)圖Fig.1 Colony morphology of some primary screened strains

2.1.2 菌株的復(fù)篩

復(fù)篩過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，放線菌、霉菌不適合液體培養(yǎng)及離心以致于無(wú)法繼續(xù)復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，所以復(fù)篩檢驗(yàn)的主要是初篩結(jié)果中的各類細(xì)菌。如表1所示，初篩得到的菌株近乎都具有降解(±)γ-內(nèi)酰胺的能力，其中菌株LP7與LY9的立體選擇性較好，菌株LP7只降解(+)γ-內(nèi)酰胺，菌株LY9只降解(-)γ-內(nèi)酰胺。

表1 復(fù)篩菌株降解(±)γ-內(nèi)酰胺情況Table 1 Degradation of (±)γ-lactam by rescreened strains

菌株LP7及LY9降解(±)γ-內(nèi)酰胺的結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，反應(yīng)1 h內(nèi)，菌株LP7選擇性降解了(+)γ-內(nèi)酰胺，菌株LY9選擇性降解了(-)γ-內(nèi)酰胺。且反應(yīng)24 h組與反應(yīng)1 h組結(jié)果相當(dāng)，未有另一構(gòu)型的γ-內(nèi)酰胺被降解的跡象，所以菌株LP7和菌株LY9都不產(chǎn)另一種構(gòu)型的γ -內(nèi)酰胺酶，立體選擇較好。經(jīng)多次傳代，菌株LP7及LY9依舊具有較好的立體選擇性，菌株穩(wěn)定性良好。

值得注意的是，氧化烴微桿菌(Microbacteriumhydrocarbonoxydans)[22-23]、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)[24-25]、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)[17]等并不是一開(kāi)始就發(fā)現(xiàn)菌體內(nèi)包含(±)2種γ-內(nèi)酰胺酶，而是在進(jìn)一步研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的，究其原因還是實(shí)驗(yàn)方法中菌體參與量過(guò)小、反應(yīng)時(shí)間不夠長(zhǎng)，以致另一種酶的作用被掩蓋忽略。本研究在復(fù)篩方法中加大了菌體參與反應(yīng)的量，并在1 h和24 h兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)檢測(cè)底物降解情況，因而很容易觀察到第2種酶的存在，避免了上述情況的發(fā)生。

2.2 產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株LP7和菌株LY9菌落形態(tài)如圖3所示。由圖3-a可知，菌株LP7在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈淡粉紅色、圓形、表面光滑。由圖3-b可知，菌株LY9在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈米黃色、圓形、表面光滑。

a-菌株LP7;b-菌株LY9;c-對(duì)照組圖2 反應(yīng)1 h組菌株LP7及LY9底物降解液的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography of substrate degradation solution of strain LP7 and LY9 in 1 h group

a-菌株LP7的平板培養(yǎng);b-菌株LY9的平板培養(yǎng)圖3 菌株LP7和LY9的菌落形態(tài)Fig.3 Colonial morphology of strain LP7 and LY9

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將菌株LP7及LY9的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明，菌株LP7與Arthrobacter屬的多個(gè)菌種的序列相似性>97%，菌株LY9與Psychrobacter屬的多個(gè)菌種序列相似性>97%。采用MEGA-X軟件中的NJ算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，菌株LP7與運(yùn)動(dòng)節(jié)桿菌(Arthrobacteragilis)聚于一支，親緣關(guān)系最近，且菌株LP7與運(yùn)動(dòng)節(jié)桿菌菌落呈粉紅色的性狀一致，因此鑒定菌株LP7為運(yùn)動(dòng)節(jié)桿菌(Arthrobacteragilis)。菌株LY9與糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)聚于一支，親緣關(guān)系最近，且菌株LY9與糞嗜冷桿菌菌落呈米黃色的性狀一致，因此鑒定菌株LY9為糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)。

圖4 基于16S rDNA序列菌株LP7及菌株LY9的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain LP7 and strain LY9 based on 16S rDNA sequence

2.3 產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株的小試生產(chǎn)

相較菌種篩選，小試生產(chǎn)擴(kuò)大了反應(yīng)體系、降低了菌株參與反應(yīng)的比例、加大了底物質(zhì)量濃度，因而降解所需時(shí)間有所延長(zhǎng)，但更為經(jīng)濟(jì)實(shí)用。利用菌株LP7和LY9降解(±)γ-內(nèi)酰胺的產(chǎn)物ee值變化曲線如圖5所示。由圖5-a可知，利用LP7降解的產(chǎn)物第35 h ee值達(dá)到99.4%，(+)γ-內(nèi)酰胺基本降解完畢。由圖5-b可知，利用LY9降解的產(chǎn)物第10 h ee值達(dá)到99.5%，(-)γ-內(nèi)酰胺基本降解完畢。菌株LY9降解(-)γ-內(nèi)酰胺的效率要快于菌株LP7降解(+)γ-內(nèi)酰胺，后經(jīng)過(guò)產(chǎn)物回收，分別得到了光學(xué)純度達(dá)99.0%以上的(+)γ-內(nèi)酰胺、(-)γ-內(nèi)酰胺。

a-菌株LP7;b-菌株LY9圖5 菌株LP7、菌株LY9降解(±)γ-內(nèi)酰胺產(chǎn)物ee值變化圖Fig.5 Changes in ee values of (±)γ-lactam products degraded by strain LP7 and strain LY9

3 結(jié)論

本研究利用平板篩選法及液相色譜法，從渤海海泥中篩選得到2株具有高立體選擇性的產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株。菌株LP7產(chǎn)(+)γ-內(nèi)酰胺酶，通過(guò)16S rDNA測(cè)序分析結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，鑒定為運(yùn)動(dòng)節(jié)桿菌(Arthrobacteragilis)；菌株LY9產(chǎn)(-)γ-內(nèi)酰胺酶，通過(guò)16S rDNA測(cè)序分析結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，鑒定為糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)。經(jīng)小試生產(chǎn)驗(yàn)證，2株菌可分別用來(lái)制備高光學(xué)純度的(-)γ-內(nèi)酰胺、(+)γ-內(nèi)酰胺，因而具備有開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步合成單構(gòu)型藥物奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。