超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂蜜中九種氨基糖苷類藥物殘留

馬凱，蔡芳葉，黃永橋，吳新文，楊昌彪，李占彬*

1(貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽， 550000)2(貴州醫(yī)科大學(xué) 神奇民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州 貴陽， 550000)

Detectionofnineaminoglycosidesresiduesinhoneybyultra-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry

MA Kai1,CAI Fangye2,HUANG Yongqiao1,WU Xinwen1,YANG Changbiao1,LI Zhanbin1*

1(Guizhou Academy of Testing and Analysis, Guiyang 550000, China)2(Shenqi Ethnic Medicine College of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, China)

ABSTRACTUltra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous detection of aminoglycosides (neomycin, amikacin, dihydrostreptomycin, streptomycin, hygromyxin B, kananmycin, gendamicin, tobramycin, spectinomycin). The residues of aminoglycosides in the honey were extracted with TCA buffer, enriched and cleaned up with HLB solid phase extraction column, and eluted with aqueous elution. And the ion-pairing reagent was added to the final extract and used to optimize the chromatography conditions. Moreover, the extracts were separated on reversed-phase chromatographic column using acetonitrile-water as mobile phase by gradient elution, and detected by liquid chromatography-mass spectrometry under multiple reaction monitoring mode via positive ion mode. All the analytes were calibrated by the external method. The results showed that the method has a good linear relationship in the range of 20-1 000 ng/mL. Moreover, the quantification limit of neomycin, dihydrostreptomycin, streptomycin, kanamycin, and tobramycin is 5 μg/kg; the quantification limit of amikacin, hygromycin B, gentamicin, and spectinomycin is 10 μg/kg. Within the linear range, three concentrations of addition experiments were carried out in the blank honey samples, the sample recovery rates ranged from 72.6%-109.4%, and the relative standard deviations were 2.13%-8.23%. The method developed here has the advantages of easy operation, high sensitivity and good filter effect. By avoiding the use of ion-pairing reagent in the mobile phase, the method could effectively reduce the pollution of mass spectrometer and better meet the detection requirements of the aminoglycoside residues in honey.

Keywordsaminoglycosides; honey; ultra performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometry

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides, AGs)是一類含有氨基糖苷健的抗生素，具有廣譜抗菌性，臨床應(yīng)用廣泛，主要用于治療革蘭氏隱性菌、綠膿桿菌的感染，目前已有數(shù)十個(gè)天然抗生素或半合成品種[1-2]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，氨基糖苷類抗生素因其高效、低價(jià)，常常被用來治療或者添加到飼料中預(yù)防各種動(dòng)物疾病[3-5]，是使用較為普遍的抗生素種類之一，但AGs同時(shí)具有一定的毒副作用，主要表現(xiàn)在腎毒性、耳毒性、神經(jīng)肌肉毒性等[6]。在我國，AGs在養(yǎng)蜂業(yè)中被廣泛使用，主要是防治蜜蜂幼蟲病[7-9]。但是由于蜂農(nóng)不科學(xué)的使用，可能導(dǎo)致蜂蜜及其蜂產(chǎn)品中AGs的殘留，消費(fèi)者直接食用這類殘留超標(biāo)的食品會(huì)帶來潛在的危害。美國FDA、歐盟委員會(huì)和日本厚生勞動(dòng)省等相關(guān)管理機(jī)構(gòu)對動(dòng)物源性食品中常用的幾種AGs的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)作出了規(guī)定[10-12]。我國在新頒布實(shí)行的GB 31650—2019中對AGs在動(dòng)物源性食品中也有明確的限量要求[13]。

目前，針對AGs殘留的檢測方法主要有微生物法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[14-16]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其高通量、定性定量準(zhǔn)確、靈敏度高，而被廣泛應(yīng)用于此類抗生素的檢測。由于AGs極性較強(qiáng)，在反相色譜柱上保留很弱，其分離檢測仍然是此類藥物殘留檢測的難點(diǎn)之一。本研究以新霉素、阿米卡星、雙氫鏈霉素、鏈霉素、潮霉素B、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、大觀霉素9種藥物作為研究對象，結(jié)合固相萃取小柱前處理凈化，選取乙腈-水體系作為流動(dòng)相，在最終提取液中添加離子對試劑優(yōu)化色譜行為，采用反相色譜分離體系，建立了同時(shí)測定蜂蜜中9種氨基糖苷類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司(Agilent 1290/6470)；高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司(L-500型)；電子天平(精確到0.01 g)，常熟市雙杰測試儀器廠；瓶口分液器,德國普蘭德公司；(UMV-2)多管旋渦混合器,北京普立泰科儀器有限公司；Milli-Q實(shí)驗(yàn)室超純水制備系統(tǒng)(Milli-Q Intergra115)，美國Millipore公司產(chǎn)品；12管固相萃取裝置，美國SUPELCO公司；旋渦混合器(XW-80A型),蘇州江東精密儀器有限公司；移液器(規(guī)格10～100 μL、100～1 000 μL、1～5 mL)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試劑與材料

乙腈(色譜純)，德國Merck公司;甲酸、七氟丁酸(色譜純)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;異丙醇(分析純)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司;乙酸銨(優(yōu)級純)，山東西亞化學(xué)股份有限公司;乙二胺四乙酸二鈉、三氯乙酸(分析純)，成都市科龍化工試劑廠;NaCl(分析純)，成都金山化學(xué)試劑有限公司;HCl(優(yōu)級純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NaOH(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；CNW Poly-Sery HLB SPE 小柱(150 mg/6mL)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;有機(jī)微孔濾膜(0.22 μm),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；妥布霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素B、阿米卡星、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)，天津阿爾塔科技有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備：準(zhǔn)確移取氨基糖苷類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ℃避光可保存1個(gè)月。

樣品提取液的制備：準(zhǔn)確稱取0.77 g乙酸銨，置于1 L的燒杯中，加入約900 mL水，溶解，用稀HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，然后分別加入0.15 g乙二胺四乙酸二鈉、5 g NaCl和20 g三氯乙酸，使固體溶解，混合均勻，并轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 提取

稱取5 g(精確到0.01 g)樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL樣品提取液，置于多管旋渦混合器充分提取5 min；然后將樣品在4 200 r/min下離心5 min，收集上清液于另一聚丙烯離心管中，用稀HCl或NaOH溶液將上清液pH調(diào)節(jié)至6.5±0.5。

1.3.2 凈化

取HLB固相萃取小柱，預(yù)先以5 mL甲醇，5 mL水活化，然后將pH調(diào)節(jié)后的上清液全部過柱，控制上樣流速小于1 mL/min，棄去流出液，以5 mL水淋洗，棄去淋洗液并真空抽干2 min，用2 mLV(甲酸)∶V(異丙醇)∶V(水)=10∶5∶85洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于聚丙烯刻度管中，加入20 μL七氟丁酸，并用洗脫液定容至2 mL，旋渦混勻后，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，使用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析。

1.3.3 基質(zhì)匹配工作曲線

取空白蜂蜜樣品，按1.3.1和1.3.2前處理方法，得到空白基質(zhì)液，用空白基質(zhì)液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制出20、50、125、250、500、1 000 ng/mL氨基糖苷類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用UPLC-MS/MS分析后，經(jīng)儀器軟件數(shù)據(jù)處理后，得到基質(zhì)匹配工作曲線。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液(含0.5 mmol/L乙酸銨)，B為乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；梯度洗脫程序：0～2 min(5%B)，2～2.5 min (5%B～8%B)，2.5～6 min(8%B～40%B)，6～6.5 min (40%B～90%B)， 6.5～8.5 min(90%B)，8.5～9.5 min(90%B～5%B)，9.5～11 min(5%B)。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測模式，正離子掃描，毛細(xì)管電壓5 500 V，噴嘴電壓500 V，霧化氣壓力45 psi，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速6 L/min，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速10 L/min，Delta EMV值為600，氨基糖苷類藥物定性、定量離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)列于表1。

表1 目標(biāo)物的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for the analytes

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的選擇

AGs易溶于水，極性強(qiáng)，在反相色譜柱幾乎無保留，目前液相色譜法主要是在流動(dòng)相中使用離子對試劑，如庚烷磺酸鈉等，液質(zhì)聯(lián)用法在流動(dòng)相添加七氟丁酸、三氟乙酸等具有揮發(fā)性且能增強(qiáng)保留的物質(zhì)。然而，這將帶來新的問題，如與質(zhì)譜不兼容或者產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)(特別是對于負(fù)離子模式)等。隨著親水作用色譜的發(fā)展，有研究使用親水色譜柱進(jìn)行氨基糖苷類藥物的分析[17-19]，但常規(guī)的HILIC柱與比反相色譜柱相比，流動(dòng)相條件發(fā)生變化，重新平衡時(shí)間較長，在梯度洗脫程序中的平衡時(shí)間也相對較長，此外，為了縮短分析時(shí)間，提高藥物分離度，改善被分析物的峰形，需要使用高濃度鹽(100～200 mmol/L)做流動(dòng)相，如甲酸銨或者乙酸銨等，但會(huì)使目標(biāo)物產(chǎn)生較強(qiáng)的離子抑制現(xiàn)象，降低靈敏度。

本實(shí)驗(yàn)將離子對試劑，如庚烷磺酸鈉和七氟丁酸等，添加到最終提取溶液中，以常規(guī)C18色譜柱(Agilent Eclipse plus C18)為分析柱，選取乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相體系，考察9種AGs藥物的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，最終提取溶液中添加磺酸鹽和七氟丁酸，都具有增強(qiáng)保留能力，提高各目標(biāo)物的分離度，但七氟丁酸與磺酸鹽相比，沸點(diǎn)較低，易揮發(fā)，能改善質(zhì)譜的電離效果，增強(qiáng)被分析物的響應(yīng)，此外，在最終提取溶液中使用七氟丁酸，避免了在流動(dòng)相中使用對質(zhì)譜負(fù)離子模式的離子抑制效應(yīng)。因此，本研究確定在最終提取液中添加七氟丁酸，以反相色譜柱為分析柱，通過優(yōu)化梯度洗脫條件，獲得了9種目標(biāo)物的合適的保留時(shí)間和較好的峰形，如圖1所示。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

AGs藥物結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)或者多個(gè)羥基和氨基，呈弱堿性，在質(zhì)譜上有很強(qiáng)的正離子響應(yīng)，同時(shí)該類藥物具有很強(qiáng)的極性，需采用電噴霧源進(jìn)行質(zhì)譜分析[20-21]。本實(shí)驗(yàn)在正離子模式下，采用ESI離子源，將9種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成1 μg/mL進(jìn)行母離子掃描，得到的母離子均為[M+H]+，優(yōu)化錐孔電壓，對得到的母離子進(jìn)行子離子掃描，選擇響應(yīng)較好的2個(gè)特征離子作為定量定性離子對，優(yōu)化碰撞能量，然后聯(lián)機(jī)液相色譜儀，優(yōu)化干燥氣溫度和流量，鞘氣溫度和流量，霧化氣壓力，毛細(xì)管電壓等質(zhì)譜參數(shù)，見1.4.2所述。

本方法中阿米卡星與卡那霉素、雙氫鏈霉素與大觀霉素、潮霉素B與鏈霉素、慶大霉素與新霉素保留時(shí)間較為接近，但根據(jù)質(zhì)譜檢測器的原理，對于不同質(zhì)荷比的化合物具有質(zhì)量分辨功能，若無法實(shí)現(xiàn)有效的色譜分離，也可通過目標(biāo)物的特征離子對，實(shí)現(xiàn)專屬的測定。

2.3 樣品前處理的選擇

2.3.1 樣品的提取

與其他大多數(shù)抗生素不同，AGs藥物易溶于水，難溶于乙腈等有機(jī)溶劑，這些化合物無法使用乙腈或其他有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，因此常采用低pH的緩沖鹽[22-23]進(jìn)行提取。本研究中，使用含有三氯乙酸的緩沖鹽溶液將氨基糖苷類抗生素從樣品中萃取出來，并進(jìn)一步利用有效的固相萃取凈化，除去殘留的三氯乙酸，減少共萃取干擾。

A-最終提取液中未添加七氟丁酸；B-最終提取液中添加七氟丁酸圖1 九種氨基糖苷類藥物特征離子色譜圖Fig.1 Chromatograms of 9 kinds of aminoglycoside

2.3.2 樣品的凈化與基質(zhì)效應(yīng)的考察

根據(jù)AGs藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，凈化時(shí)用到的通用型固相萃取柱主要有HLB柱和離子交換柱(如SCX、PCX、WCX、CBX等)[24-28]，由于離子交換柱多用于單個(gè)或者幾種藥物的檢測，而HLB柱對多種AGs藥物的凈化具有較好的效果。本實(shí)驗(yàn)選擇HLB柱對提取液進(jìn)行凈化處理，采用HLB固相萃取柱凈化時(shí)有推薦的活化、淋洗、洗脫方法，推薦的洗脫液一般為甲醇。由于AGs藥物為強(qiáng)極性化合物，水溶性極強(qiáng)，因此本研究嘗試采用水性洗脫液，添加洗脫能力較強(qiáng)的異丙醇，并降低洗脫液的pH值，考察對洗脫效果的影響，分別用體積分?jǐn)?shù)1%、5%、10%、15%的甲酸水性洗脫液進(jìn)行洗脫，使用量為5 mL，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洗脫液中甲酸的體積分?jǐn)?shù)≥10%時(shí)，9種AGs可被洗脫，回收率均大于70%，如圖2所示。對洗脫液的使用量進(jìn)行了考察，使用5 mL的水性洗脫液進(jìn)行洗脫，按1 mL/管分別收集洗脫液，上機(jī)測定洗脫液中的目標(biāo)物含量，結(jié)果顯示，收集的洗脫液第3管里目標(biāo)物質(zhì)含量已經(jīng)很低，為節(jié)約分析時(shí)間，提高方法的靈敏度，洗脫液體積選擇為2 mL。

圖2 不同洗脫條件下AGs的回收率Fig.2 Recoveries of AGs under different elution conditions

比較了水性洗脫液和純甲醇洗脫液的凈化效果，其凈化效果評價(jià)方式主要是考察AGs的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)的計(jì)算方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[29-30]進(jìn)行，即基質(zhì)效應(yīng)(ME)=A/B，其中A代表含有空白蜂蜜樣品基被分析物的離子響應(yīng)值，B代表純?nèi)軇┲斜环治鑫锏南嗤瑵舛鹊碾x子響應(yīng)值。若ME值為0.8～1.2時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；若ME值介于0.5～0.8或1.2～1.5時(shí)，則為中等程度的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME值<0.5或>1.5，表明基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)。用純?nèi)軇┡渲瀑|(zhì)量濃度為50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用空白樣品提取液配制同濃度水平的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，做6組平行，考察樣品基質(zhì)對各藥物的基質(zhì)效應(yīng)，其結(jié)果如圖3所示。使用水性洗脫液洗脫目標(biāo)物，除新霉素有較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)外，其他8種藥物ME值均在0.8～1.2，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，而使用純甲醇作為洗脫溶劑，樣品基質(zhì)對目標(biāo)藥物均有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果表明，與有機(jī)型洗脫液相比，使用水性洗脫液洗脫AGs藥物時(shí)，固相萃取柱能保留大量的基質(zhì)干擾成分，可使凈化效果得以提高。

圖3 不同洗脫溶劑下的氨基糖苷類藥物的基質(zhì)效應(yīng)Fig.3 Matrix effects of aminoglycoside in different elution solve

2.4 線性范圍與定量限

準(zhǔn)確移取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用1.3前處理方法得到的空白基質(zhì)液稀釋，配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照已優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各目標(biāo)物定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，做線性回歸，結(jié)果顯示9種AGs在20～1 000 ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(R2>0.995)。

以不含待測組分的蜂蜜為空白樣品，采用空白樣品添加目標(biāo)物，按照1.3前處理方法進(jìn)行處理，并上機(jī)測定，以定量離子色譜峰的信噪比(S/N)≥10為方法的定量限，計(jì)算9種AGs的定量限，具體參數(shù)列于表2。

2.5 方法回收率與精密度

對蜂蜜樣品分別進(jìn)行3個(gè)質(zhì)量濃度水平(50、100、200 μg/kg)的空白加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平取6個(gè)平行樣品，按1.3和1.4實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行前處理和測定，計(jì)算各個(gè)分析物的平均回收率和精密度。

由表3可以看出，被分析物的平均回收率在72.6%～109.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.13%～8.23%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿足蜂蜜樣品中9種AGs藥物的檢測要求。

表2 九種AGs藥物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and LOQs of 9 AGs

表3 蜂蜜樣品中9種AGs藥物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 9 AGs in honey samples(n=6)

2.6 實(shí)際樣品測定結(jié)果

經(jīng)過確認(rèn)的方法應(yīng)用于實(shí)際蜂蜜樣品的9種AGs藥物殘留量的測定，以考察該方法的適用性。選取了本實(shí)驗(yàn)室在流通環(huán)節(jié)抽取的53批次的蜂蜜樣品作為檢測對象，其中有2批次樣品中鏈霉素有檢出，檢測值分別為29.7 μg/kg和62.1 μg/kg，其他8種AGs藥物均未檢出。檢測結(jié)果表明，鏈霉素作為殺菌類藥物在養(yǎng)蜂業(yè)中被使用。

3 結(jié)論

本研究使用三氯乙酸的緩沖鹽溶液提取目標(biāo)物，以HLB固相萃取柱富集凈化，選擇水性洗脫液洗脫，在最終提取液中添加離子對試劑優(yōu)化色譜行為，選取乙腈-水體系作為流動(dòng)相，采用反相色譜柱進(jìn)行分離，建立了同時(shí)測定蜂蜜樣品中妥布霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素B、阿米卡星、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素9種氨基糖苷類藥物殘留的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法操作簡單，靈敏度高，凈化效果好，在流動(dòng)相中避免使用離子對試劑，有效減少了對質(zhì)譜儀的污染，各項(xiàng)目標(biāo)參數(shù)均達(dá)到日常檢測的技術(shù)要求，能夠較好滿足蜂蜜中氨基糖苷類藥物殘留檢測的需要。