富含乳酸菌的脫腥海參肽粉的制備

汪韜，溫運(yùn)啟，于嬌，薛勇，薛長湖

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266003)

海參作為我國“海產(chǎn)八珍”之一，具有高蛋白、低脂肪和低糖的特點(diǎn)，其富含人體所需的氨基酸、維生素、脂肪酸和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。同時(shí)，海參中含有的海參多糖、海參皂甙具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等功效[2-5]。目前，海參的加工方法主要有鹽漬、鹽干、糖干、淡干和凍干等。由于傳統(tǒng)干制海參存在泡發(fā)工藝復(fù)雜、耗時(shí)長等問題[6]，因此研究人員基于方便、速食和大眾化的優(yōu)點(diǎn)開發(fā)出多種海參速食產(chǎn)品，例如即食海參、海參果凍、海參膠、海參口服液等[7-9]。

海參肽的腥味是影響海參肽類產(chǎn)品接受度的重要因素，其腥味去除方法主要包括吸附、掩蓋、包埋等物理方法。盡管，這一類方法能夠?qū)⑿任栋l(fā)揮一定作用，但仍有不足。其中，吸附法會(huì)造成一定的海參原有風(fēng)味的缺失以及海參多肽17.51%～50.81%的損失[10]，掩蓋法和包埋法會(huì)使得海參成分占比較低，且產(chǎn)品貯藏一段時(shí)間后存在返腥現(xiàn)象[11-12]。研究表明，乳酸菌發(fā)酵法對(duì)牡蠣的去腥和風(fēng)味提升具有良好的效果[13]，同時(shí)乳酸菌具有調(diào)節(jié)免疫力、降低膽固醇以及改善腸道等功效[14-15]。因此，本文探究了乳酸菌發(fā)酵法對(duì)海參酶解液去腥和風(fēng)味的影響，并通過冷凍干燥技術(shù)制備了富含乳酸菌的海參肽粉制劑，旨在為海參的精深加工和產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論依據(jù)和科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽漬海參，青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng)；鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；MRS肉湯、MRS瓊脂，青島海博生物科技有限公司。

NaCl、NaOH(均為分析純)，蔗糖、脫脂乳粉、谷氨酸鈉、VC、食用甘油(均為食品級(jí))，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)，蘇州蘇泰凈化設(shè)備工程有限公司；GHP-9270恒溫培養(yǎng)箱，蘇州國飛實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；料理機(jī)，小熊電器股份有限公司；IKA渦旋混合器，德國IKA有限公司；Agilent 7980A GC氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；Delta1-24 LSC plus冷凍干燥器，德國Marin Christ公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 海參酶解液的制備

將鹽漬海參洗凈，用去離子水浸泡脫鹽，置于4 ℃條件下，每12 h換1次水，浸泡3 d。去除海參的沙嘴，洗凈，斬拌，加入去離子水至固形物含量為15%。煮沸10 min，殺滅初始微生物。加入20 mg/g枯草桿菌蛋白酶，在50 ℃下，酶解5 h。然后用60目篩網(wǎng)過濾，濾液在90 ℃水浴10 min滅酶，然后急速冷卻至4 ℃滅菌。得到滅菌海參酶解液。

1.3.2 發(fā)酵液的制備

將鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌分別用MRS肉湯培養(yǎng)24 h，活化2代，然后第3代培養(yǎng)48 h。第3代在4 ℃，8 000 r/min條件下離心10 min。沉淀用無菌生理鹽水清洗2次，然后菌液沉淀用滅菌酶解液配制成濃度為107CFU/mL的發(fā)酵液，4 ℃條件下備用。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)，以風(fēng)味感官得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察發(fā)酵時(shí)間、蔗糖添加量、接種量對(duì)發(fā)酵液的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

按照因素的影響程度，選擇發(fā)酵時(shí)間、蔗糖添加量及接種量為主要影響因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)。其他條件為鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌接種比例為3∶1，乳粉添加量為3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，發(fā)酵溫度為37 ℃。

1.3.5 凍干和貯藏

在酶解液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的谷氨酸鈉、0.5%VC和1%食用甘油復(fù)合使用作為凍干保護(hù)劑[16-17]，進(jìn)行凍干得到粉劑，測(cè)定凍干樣品的乳酸菌濃度，以未加凍干保護(hù)劑的樣品為對(duì)照，按照公式(1)計(jì)算存活指數(shù)。將制得的粉劑分別常壓塑封和真空塑封，包裝好的粉劑分別于4 ℃和25 ℃條件下貯藏。即得到4 ℃常壓、4 ℃真空、25 ℃常壓和25 ℃真空這4種貯藏條件下的樣品，每2個(gè)月測(cè)定樣品中乳酸菌濃度。

(1)

式中：Y，乳酸菌存活指數(shù)；k0，對(duì)照組樣品中乳酸菌濃度，CFU/g；k1，凍干樣品中乳酸菌濃度，CFU/g。

1.3.6 風(fēng)味感官評(píng)定

由8位感官評(píng)定員組成，主要以樣品的組織狀態(tài)、腥味、風(fēng)味和口感為評(píng)價(jià)指標(biāo)。去掉每種樣品的最高分和最低分，取平均分作為樣品的感官值[18]，如表1所示。

1.3.7 理化指標(biāo)測(cè)定

酸度(吉爾捏爾度)按照鮮乳的檢驗(yàn)中酸度的測(cè)定方法測(cè)定[19]；菌落計(jì)數(shù)按照GB4789.35——2016中方法測(cè)定乳酸菌含量[20]。

表1 感官評(píng)價(jià)表Table 1 Sensory evaluation form

1.3.8 頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用分析揮發(fā)性成分

樣品前處理：取海參酶解液發(fā)酵前后的樣品置于20 mL頂空瓶中，于60 ℃下平衡5 min后，用固相微萃取針萃取40 min。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件：色譜柱為HP-INNOWAXS毛細(xì)管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He，流速1 mL/min，分離比5∶1；進(jìn)樣溫度為250 ℃；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：EI電離源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍30～500m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參酶解液發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

以感官值為判定指標(biāo)、酸度值為參考指標(biāo)，探究發(fā)酵時(shí)間、加糖量和接種量對(duì)海參發(fā)酵液的影響。由圖1-a可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，感官值呈先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵時(shí)間為7 h時(shí)達(dá)到最大值，且酸度值隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而升高。這表明發(fā)酵是一個(gè)持續(xù)產(chǎn)酸的過程，在發(fā)酵7 h時(shí)糖酸比達(dá)到一個(gè)較優(yōu)值。而持續(xù)發(fā)酵因產(chǎn)酸過多，使得感官值降低。由圖1-b可知，隨著加糖量的增加，感官值和酸度值都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，感官值在加糖量為3%達(dá)到最高。這表明加糖量在一定范圍內(nèi)有利于乳酸菌的發(fā)酵，產(chǎn)生較好的風(fēng)味，而加糖量過高時(shí)，會(huì)對(duì)乳酸菌的生長有一定的抑制作用，使得產(chǎn)酸不夠，樣品偏甜，感官值下降。由圖1-c可知，隨著接種量的增加，感官值和酸度值先上升后下降，感官值在接種量為4%時(shí)最高。這表明在一定的接種量條件下，乳酸菌在指數(shù)生長期內(nèi)產(chǎn)酸量和糖分達(dá)到了一個(gè)較好的糖酸比，使得感官值較好。而接種量過高時(shí)，由于乳酸菌在指數(shù)增長期內(nèi)的大量繁殖使得產(chǎn)酸量過高，從而降低感官值[21]。

a-發(fā)酵時(shí)間；b-加糖量；c-按種量圖1 發(fā)酵時(shí)間、加糖量和接種量對(duì)發(fā)酵感官值的影響Fig.1 Effects of fermentation time, sugar content and inoculation amount on sensory value

2.2 海參酶解液發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵時(shí)間(A)，蔗糖添加量(B)，接種量(C)為3因素，設(shè)置3水平，以感官評(píng)價(jià)值為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，根據(jù)極差分析法來確定發(fā)酵最佳條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，通過極差分析可知，各因素對(duì)海參酶解液風(fēng)味提升的影響大小依次為蔗糖添加量>發(fā)酵時(shí)間>接種量。由K值可知，最佳組合為A2B3C2。由表2感官評(píng)價(jià)值可知，最佳組合為A3B3C1。經(jīng)驗(yàn)證，組合A2B3C2的感官評(píng)價(jià)值為83.62分，高于組合A3B3C1的得分(81.75分)。故發(fā)酵最優(yōu)組合為A2B3C2，即發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間7 h，蔗糖添加量為4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，菌液接種量為3%。

表2 正交試驗(yàn)表Table 2 Orthogonal test table

2.3 海參酶解液發(fā)酵前后風(fēng)味成分分析

經(jīng)過正交試驗(yàn)優(yōu)化后的發(fā)酵工藝制得的海參酶解發(fā)酵液，通過感官值可知其腥味較海參酶解液明顯降低，且有益風(fēng)味有了明顯提升。本研究采用頂空固相微萃取法結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定發(fā)酵前后海參液的揮發(fā)性風(fēng)味成分及變化。表3為發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物的歸屬、占比及氣味特點(diǎn)。采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)發(fā)酵前后的海參酶解液進(jìn)行風(fēng)味分析。結(jié)果表明，發(fā)酵前和發(fā)酵后的揮發(fā)性化合物分別為28種和39種。且發(fā)酵前后，海參酶解液中揮發(fā)性風(fēng)味成分總相對(duì)含量分別為44.12%，50.39%。發(fā)酵前呈不愉快氣味的揮發(fā)性化合物有10種，占總揮發(fā)性風(fēng)味成分相對(duì)含量為12.65%，呈愉快氣味的揮發(fā)性化合物有18種，占總揮發(fā)性風(fēng)味成分相對(duì)含量為31.46%。發(fā)酵后呈不愉快氣味的揮發(fā)性化合物有6種，占總揮發(fā)性風(fēng)味成分相對(duì)含量為6.36%，呈愉快氣味的揮發(fā)性化合物有33種，占總揮發(fā)性風(fēng)味成分相對(duì)含量為44.03%。經(jīng)過對(duì)比，呈不愉快氣味的揮發(fā)性化合物占比由發(fā)酵前的12.65%降低為發(fā)酵后的6.36%。呈愉快氣味的揮發(fā)性化合物占比由發(fā)酵前的31.46%上升為發(fā)酵后的44.03%。其中，經(jīng)過發(fā)酵還產(chǎn)生了辛酸、癸酸、棕櫚酸、己醛、庚醛、反-2-辛烯醛等15種呈愉快氣味的揮發(fā)性化合物[22]，并且2-氨基丙烷、十五烷、2,6,10,14-四甲基十五烷、2,5-二叔丁基酚和吡啶這5種呈不愉快風(fēng)味的揮發(fā)性化合物經(jīng)過發(fā)酵后消失[23]。

表3 海參酶解液發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物的歸屬、峰面積比例及氣味特點(diǎn)[22-24]Table 3 Attribution, peak area ratio and odor characteristics of volatile compounds before and after fermentation of sea cucumber enzymatic hydrolysate

2.4 海參酶解發(fā)酵液的凍干及貯藏

將海參發(fā)酵液加入凍干保護(hù)劑凍干后，以未加凍干保護(hù)劑的發(fā)酵液作為對(duì)照，測(cè)定乳酸菌的存活率及乳酸菌濃度，并測(cè)定貯藏期間海參凍干粉中的乳酸菌濃度。由圖2可知，相對(duì)于未加凍干保護(hù)劑，添加凍干保護(hù)劑的海參發(fā)酵液經(jīng)過凍干后乳酸菌含量為對(duì)照組的1.9倍。凍干后得到的粉劑中乳酸菌濃度為6.54×1010CFU/g、海參質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54%的粉劑。且該凍干粉劑初始乳酸菌含量和市售益生菌固體飲料基本一致。將添加保護(hù)劑的凍干粉劑分別置于4種不同條件下貯藏。由圖3可知，粉劑的活菌數(shù)在貯藏期呈下降趨勢(shì)，且不同貯藏條件之間存在顯著差異。采用4 ℃真空貯藏的活菌存活率在3個(gè)月后降為67.58%，為最優(yōu)貯藏條件，且貯藏3個(gè)月后活菌數(shù)仍遠(yuǎn)高于企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的1×106CFU/g[25]。

圖2 添加凍干保護(hù)劑后凍干效果對(duì)比Fig.2 Comparison of lyophilization effect after adding lyophilization protection agent

圖3 海參肽凍干粉貯藏過程中乳酸菌存活率Fig.3 Survival rate of lactic acid bacteria during storage of sea cucumber peptide lyophilized powder

3 結(jié)論

綜上研究可知，通過乳酸菌發(fā)酵海參酶解液可以很好去除海參酶解液的腥味，同時(shí)提升風(fēng)味。在發(fā)酵時(shí)間7 h，蔗糖添加量4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，菌液[V(鼠李糖乳桿菌)∶V(嗜酸乳桿菌)=3∶1]接種量3%時(shí)達(dá)到最佳發(fā)酵效果，此時(shí)海參發(fā)酵液風(fēng)味最佳。且頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)果表明，海參酶解液中呈不愉快氣味的化合物占比由發(fā)酵前的12.65%降為發(fā)酵后的6.36%，呈愉快氣味的化合物占比由發(fā)酵前的31.46%上升為發(fā)酵后的44.03%。這表明乳酸菌發(fā)酵減少了海參酶解液的不良風(fēng)味物質(zhì)，還能產(chǎn)生風(fēng)味良好的物質(zhì)。通過凍干制得的海參粉劑含海參質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54 %，乳酸菌濃度為6.54×1010CFU/g，且乳酸菌活性較好。該粉劑能同時(shí)滿足消費(fèi)群體對(duì)海參和乳酸菌的攝入，且風(fēng)味較好。因此，該海參發(fā)酵液制備的粉劑具有開發(fā)為富含乳酸菌的海參固體飲料的潛力，也可用于咀嚼片、海參酸奶發(fā)酵劑等產(chǎn)品中。