反式阿魏酸釕配合物的合成、表征、熒光光譜及其與DNA/蛋白作用

陶 欽 吳 健 葛 超 王萌萌 呂夢迪 薛旭玲 劉紅科

(南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，南京 210023)

配合物具有良好的生物特性，有望成為新一代金屬基抗癌藥物，其中非鉑類金屬(Ru、Ir和Os等)配合物的設(shè)計(jì)與研究已得到了廣泛關(guān)注[1-2]。Sadler等發(fā)現(xiàn)這類配合物相較于傳統(tǒng)鉑類配合物具有溶解性好、耐藥性小以及光學(xué)性能優(yōu)良等優(yōu)勢；同時其配位點(diǎn)眾多，利于通過設(shè)計(jì)獲得多變的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)入生物體內(nèi)識別或匹配生物大分子；此外，這類配合物具有低毒性，易于被生物體攝取和代謝，從而具有良好的生物相容性與應(yīng)用可行性[3-10]。其中，環(huán)金屬釕（Ⅱ）配合物具有基于其相關(guān)配體的、可調(diào)節(jié)的、優(yōu)越且獨(dú)特的光物理和化學(xué)性質(zhì)[11]，包括高量子產(chǎn)率、長壽命光致發(fā)光、較大Stokes位移以及高效的單線態(tài)氧生成能力等，這使得它們被廣泛用于蛋白質(zhì)監(jiān)測[12]、疾病診斷[13]、光動力治療[5,14]等。

以血清白蛋白為代表的生物分子作為生物體內(nèi)重要組成部分，具有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸、脂肪酸、金屬離子以及藥物等物質(zhì)的作用[15]。金屬配合物與其發(fā)生作用將會影響自身在體內(nèi)的吸收、釋放與代謝[16]，通過改變與金屬中心配位的配體，可以調(diào)節(jié)配合物的結(jié)構(gòu)，從而影響其與蛋白質(zhì)的作用[17]。同為生物大分子的DNA影響著生命與遺傳性狀的翻譯與轉(zhuǎn)錄，甚至影響著疾病和進(jìn)化[18-19]，因此研究配合物與DNA作用引起了人們極大的關(guān)注。Ru2+、Zn2+、Co3+等配位飽和的金屬配合物可以識別DNA的二級結(jié)構(gòu)[20]，且Ru（Ⅱ）配合物與DNA的相互作用已有很多文獻(xiàn)報(bào)道[21-22]，例如被稱為“DNA光開關(guān)”的[Ru(bpy)2(dppz)]2+(dppz為二吡啶并吩嗪)及其衍生物，可以插入雙鏈DNA堿基對之間并穩(wěn)定DNA。有些環(huán)金屬配合物已被作為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、RNA聚合酶抑制劑等進(jìn)行研究[23]。

反式阿魏酸(trans-ferulic acid，trans-FA)是一種存在于植物中的酚酸類化學(xué)物質(zhì)，具有良好的穩(wěn)定性，并被證明具有多種生物活性，例如抗氧化[24]、抗癌[25-27]等，其對正常的生物組織基本無毒，具有很好的生物利用度。基于此，我們設(shè)計(jì)并合成了2種尾接反式阿魏酸的新型釕配合物[Ru(cym)(L)Cl]Cl(Ru-1)與[Ru(bpy)2(L)]Cl2(Ru-2)(cym=對傘花烴，bpy=2,2′-聯(lián)吡啶，L=(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-((4′-methyl-(2，2′-bipyridin)-4-yl)methyl)acrylamide)，通過1H NMR及ESI-MS對其進(jìn)行了基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)表征，并利用紫外及熒光方法等研究了配合物的光學(xué)性質(zhì)、單線態(tài)氧生成能力，以及與BSA及CT-DNA的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用溶劑均采用分析純試劑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，無須進(jìn)一步純化。除特殊要求，所有反應(yīng)均在氬氣保護(hù)氛圍下進(jìn)行。4，4′-dimethyl-2，2′-bipyridine購自阿拉丁試劑公司，反式阿魏酸購自安耐吉試劑公司。根據(jù)文獻(xiàn)方法制備了配體(4′-methyl-(2，2′-bipyridin)-4-yl)methanamine[28-29]與金屬釕前驅(qū)體[(η6-p-cym)RuCl2]2[30]與 cis-[Ru(bpy)2Cl2][31]。

1H NMR采用Bruker AVANCE 400 spectrometer測定(德國)。ESI-MS使用 Thermo Scientific LCQ FLEET電噴霧質(zhì)譜儀(美國)測定，測試條件為：Source Voltage 4.0 kV，Sheath Gas Flow Rate 8 arb，Capillary Voltage 70 V，Capillary Temp 275 K，流動相為甲醇，流速為200 pL·min-1，進(jìn)樣方式為直接進(jìn)樣，樣品溶于甲醇。紫外吸收光譜為PerkinElmer Lambda 365紫外-可見光譜儀(美國)測定。熒光光譜為Edinburgh FS5熒光光譜儀(英國)測定。共聚焦成像實(shí)驗(yàn)用Nikon A1熒光共聚焦顯微鏡(日本)進(jìn)行。

1.2 配體及配合物的合成與表征

1.2.1 配體L

在氬氣保護(hù)、冰浴條件下，將34.1 μL的三乙胺加入反式阿魏酸(48.5 mg，0.3 mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI，49.8 mg，0.3 mmol)的無水DMF溶液(8 mL)中，攪拌15 min后，加入1-羥基苯并三唑(HOBt，28.1 mg，0.2 mmol)并繼續(xù)攪拌10 min，最后將(4′-methyl-(2，2′-bipyridin)-4-yl)methanamine(50.0 mg，0.3 mmol)緩慢加入上述混合溶液中,反應(yīng)過夜。待反應(yīng)結(jié)束后向溶液中加入80 mL冰水,有黃色沉淀生成，過濾并依次用熱水、乙醇和乙醚清洗多次，得到41.7 mg較純的產(chǎn)物L(fēng)，產(chǎn)率為45%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 9.48(s，1H)，8.68(t，J=6.1 Hz，1H)，8.63～8.59(m，1H)，8.53(d，J=5.2 Hz,1H)，8.32(d，J=0.8 Hz，1H)，8.26～8.22(m，1H)，7.40(dd，J=12.8，9.1 Hz，1H)，7.34(dd，J=5.0，1.6 Hz，1H)，7.31～7.27(m，1H)，7.18(t，J=3.3 Hz，1H)，7.04(dd，J=8.2，1.9 Hz，1H)，6.81(d，J=8.1 Hz，1H)，6.57(d，J=15.7 Hz，1H)，4.51(d，J=6.0 Hz，2H)，3.82(s，3H)，2.42(s，3H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ 166.20，155.81,155.42,150.36,149.60,149.44，148.88，148.43，148.27,140.31,126.67,125.47,123.05，122.20，121.73，119.10，118.77，116.10，111.25，55.95，42.01，21.19。MALDI-MS：[L+H]+m/z的理論值為376.16，實(shí)驗(yàn)值為376.29。

1.2.2 配合物[Ru(cym)(L)Cl]Cl(Ru-1)

在氬氣氛圍下，將芳基釕二聚體[(η6-p-cym)RuCl2]2(25.0 mg，0.04 mmol)、配 體 L(36.0 mg，0.1 mmol)溶于無水甲醇(10 mL)中，338 K回流過夜。待反應(yīng)結(jié)束后除去溶劑，將粗產(chǎn)物通過柱層析分離，洗脫劑為二氯甲烷/甲醇(10∶1，V/V)時得到黃色粉末，產(chǎn)量 35.7 mg，產(chǎn)率為 65%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 9.56(s，1H)，9.45(d，J=5.9 Hz，1H)，9.38(d，J=5.9 Hz，1H)，8.90(t，J=5.9 Hz，1H)，8.62～8.56(m，1H),8.54(s，1H)，7.68～7.58(m，2H)，7.42(d，J=15.7 Hz，1H),7.18(d，J=1.8 Hz，1H),7.05(dd，J=8.2，1.8 Hz,1H)，6.84(t，J=7.1 Hz，1H)，6.63(d，J=15.8 Hz，1H)，6.20(t，J=6.6 Hz,2H)，5.96(t，J=5.7 Hz，2H)，4.72～4.58(m，2H)，3.85～3.79(m，3H)，2.62～2.53(m，4H)，2.17(s，3H)，0.95(dd，J=6.9，2.5 Hz，6H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ 166.50，155.91，155.50，154.62，154.30，153.90，152.47,149.01,148.27,140.43,128.75，126.60，125.84，124.85,122.38,122.17,118.66,116.14，111.40，103.73，103.68,86.94,86.83,84.25，84.09，56.00，41.85，30.85，22.20，22.13，21.13，18.79。ESI-MS：[Ru-1-Cl]+m/z的理論值為646.17，實(shí)驗(yàn)值為646.42。

1.2.3 配合物[Ru(bpy)2(L)]Cl2(Ru-2)

在氬氣氛圍下，將環(huán)金屬釕前驅(qū)體cis-[Ru(bpy)2Cl2](50.0 mg，0.1 mmol)、配體 L(36.0 mg，0.1 mmol)溶于乙醇/水(5.0 mL/2.5 mL)混合溶劑中，353 K下回流24 h。除去溶劑，將粗產(chǎn)物通過柱層析分離(洗脫劑為二氯甲烷/甲醇，9∶1，V/V)，得到亮紅色粉末，產(chǎn)量57.4 mg，產(chǎn)率為67%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 9.56(s，1H)，8.95(t，J=6.0 Hz，1H)，8.86(d，J=7.5 Hz，5H)，8.80(s，1H)，8.21～8.11(m，4H)，7.74(dd，J=12.4，5.5 Hz，4H)，7.65(d，J=5.9 Hz，1H)，7.59～7.49(m,5H),7.41～7.34(m，3H)，7.13(d，J=1.8 Hz，1H),7.01(dd，J=8.2，1.8 Hz,1H),6.82(d，J=8.1 Hz，1H)，6.62(d，J=15.8 Hz，1H)，4.61(t，J=5.5 Hz，2H)，3.80(s，3H)，2.55～2.52(m，3H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ 166.43，157.05，157.01，156.65，156.39，151.71，151.62,151.54,151.49,151.41,150.77，150.27，149.00，148.25,140.22,138.28,138.23,129.15，128.34，128.30，126.59,126.30,125.78,124.97,123.32，122.02，118.78，116.14，111.44，56.00，41.77，21.20。ESI-MS：[Ru-2-2Cl]2+m/z的理論值為394.60，實(shí)驗(yàn)值為394.75。

1.3 配合物的親脂性

通過搖瓶法分別將配合物Ru-1與Ru-2溶于水相與有機(jī)相的混合溶液中，并采用紫外-可見光譜進(jìn)行定量分析。將水和正辛醇飽和2 d后分液，將配合物溶解于水相中，再向溶液中加入等體積正辛醇，置于搖床上振搖2 h，將混合相離心3 min(7 000 r·min-1)，用紫外-可見光譜分別檢測水相與有機(jī)相中配合物的吸光度，脂水分配系數(shù)lgPO/W值可通過配合物在有機(jī)相和水相中濃度的比值取對數(shù)獲得。

1.4 配合物的紫外吸收光譜與熒光光譜

在298 K下，將配合物用5 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4，含 10 mmol·L-1NaCl)配制為濃度為35 μmol·L-1的溶液(DMSO和PBS的體積分?jǐn)?shù)分別為5%和95%)。將溶液置于1 cm路徑的石英比色皿中，測定的吸收波長范圍為250～600 nm。將Ru-2的相應(yīng)溶液(10 μmol·L-1)使用熒光光譜測試其發(fā)射光譜，激發(fā)波長為454 nm，測定的發(fā)射波長范圍為480～750 nm。

1.5 配合物Ru-2的熒光pH響應(yīng)

配合物Ru-2的pH熒光響應(yīng)與抗離子干擾實(shí)驗(yàn)均在DMSO水溶液(體積分?jǐn)?shù)1%)中完成。Ru-2濃度為 10 μmol·L-1，用 HCl或 NaOH 調(diào)節(jié)溶液的 pH=3～12，配制完成后進(jìn)行熒光測試。將各種離子對應(yīng)的鹽溶于水，其中堿金屬與堿土金屬(K+、Na+、Mg2+、Ca2+)濃度為 10 mmol·L-1，過渡金屬離子(Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+)濃度為 10 μmol·L-1，溶液配制完成后直接進(jìn)行熒光光譜測試，激發(fā)波長設(shè)置為454 nm，掃描范圍為500～850 nm。

1.6 配合物的水解

在298 K下通過紫外-可見光譜測定配合物的水解曲線。將配合物Ru-1、Ru-2配制成濃度為45 μmol·L-1的溶液(DMSO和H2O的體積分?jǐn)?shù)分別為5%和95%)，置于1 cm光路路徑的石英比色皿中，測定波長范圍為250～450 nm，在24 h內(nèi)記錄吸光度值，間隔時間為10 min～4 h。

1.7 配合物與CT-DNA相互作用

用 PBS(5 mmol·L-1,pH=7.4,含 10 mmol·L-1NaCl)將CT-DNA溶解，儲存在269 K溫度下。溶液在PBS稀釋后，進(jìn)行濃度測定：置于1 cm路徑的石英比色皿中通過紫外-可見光譜在波長為260 nm處測定吸光度，計(jì)算其濃度(ε=6 600 L·mol-1·cm-1)。其在 260與280 nm處的吸光度比值約為1.9，說明CT-DNA不含蛋白質(zhì)，可正常使用。在298 K下，將25 μmol·L-1配合物溶液(DMSO和H2O的體積分?jǐn)?shù)分別為5%和95%)置于1 cm光路路徑的石英比色皿中，依次加入16 μL CT-DNA溶液，CT-DNA與配合物的濃度比例r為 0.2～1.4，其濃度為 5～35 μmol·L-1，并將混合物室溫孵育7 min以達(dá)到平衡，測試時以相應(yīng)濃度的CT-DNA溶于測試溶液體系作為空白對照進(jìn)行基線掃描，測定波長范圍為200～600 nm。

1.8 配合物對DNA粘度的影響

控制恒溫水浴槽溫度為(25±0.1)℃，使用烏氏粘度計(jì)對配合物影響的CT-DNA粘度進(jìn)行測量。用上述PBS配制50 μmol·L-1的DNA溶液。測定時需固定DNA的濃度，依次向DNA溶液(10 mL)中依次加入 2 mmol·L-1配合物溶液 5～25 μL，即配合物與DNA的濃度之比r為0.02～0.1。室溫孵育7 min后記錄樣品流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間。

1.9 配合物與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用

將 BSA 溶解在 PBS(5 mmol·L-1，pH=7.4，含 10 mmol·L-1NaCl)中并于269 K冰箱保存。測試時，在室溫條件下將 BSA(3 μmol·L-1)溶液置于 1 cm 光路路徑的石英比色皿中，依次加入等體積的配合物溶液，使配合物與BSA的比例r為0～6.7，其濃度為0～20.0 μmol·L-1。 室 溫孵育 15 min 達(dá)到平 衡 后，于BSA的激發(fā)波長280 nm處測定熒光強(qiáng)度，測定發(fā)射波長范圍為300～550 nm。

1.10 配合物的單線態(tài)氧產(chǎn)率

使用1，3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)標(biāo)定Ru-2的單線態(tài)氧產(chǎn)率[32]，[Ru(bpy)3]2+用作標(biāo)準(zhǔn)物。在298 K下，將DPBF、標(biāo)準(zhǔn)物[Ru(bpy)3]2+、Ru-1、Ru-2均溶于CH3OH/H2O(1∶4，V/V)中，使DPBF在411 nm處的吸光度約為1.0；標(biāo)準(zhǔn)物、配合物的吸光度為0.2～0.3(Ru-2與BSA的混合溶液的濃度比為1∶1，先將等濃度混合的Ru-2/BSA水溶液在室溫孵育15 min，再加入DPBF配制為上述溶液)。待溶液配制好后，依次使用波長為450 nm的光源照射3 s后測試，照射時間為0～24 s，測定吸收波長范圍為200～600 nm。

1.11 配合物Ru-2的細(xì)胞成像

取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，以每孔5×104個接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的氣氛和310 K條件下孵育24 h，將配合物Ru-2用培養(yǎng)基稀釋成濃度為 25 μmol·L-1的溶液(DMSO 和DMEM的體積分?jǐn)?shù)分別為1%和99%)，在相同條件下與A549細(xì)胞共孵育9 h，隨后移除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，使用激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長設(shè)置為488 nm，發(fā)射通道為570～620 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 配體及配合物的合成及結(jié)構(gòu)表征

將具有多種生物活性的天然產(chǎn)物反式阿魏酸進(jìn)行化學(xué)改造，并結(jié)合金屬中心釕，獲得了2種全新釕配合物。如圖1所示，配體(L)是由反式阿魏酸與(4′-methyl-(2，2′-bipyridin)-4-yl)methanamine通過酰胺化反應(yīng)制得；配合物Ru-1是由芳基釕二聚體[Ru(η6-p-cym)Cl2]2與配體L在甲醇中制備得到，配合物Ru-2是由環(huán)金屬釕前驅(qū)體cis-[Ru(bpy)2Cl2]與配體L在乙醇/水(2∶1，V/V)中制備得到。2種配合物均通過柱層析提純，并利用1H NMR、ESI-MS對化合物進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示2個配合物均為單核釕（Ⅱ）配合物，含有一個化學(xué)修飾的反式阿魏酸配體。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.1 Synthetic route of the target complexes

2.2 配合物的脂水分配系數(shù)

由Lipinski規(guī)則可知，化合物的親脂性與親水性是很重要的性能指標(biāo)[33]。較低的親脂性會使化合物穿過細(xì)胞磷脂雙分子層能力的下降，但較高的親脂性又使得化合物水溶性變差，進(jìn)而導(dǎo)致在實(shí)際應(yīng)用時的困難[34]。因此我們測定了2種配合物的脂水分配系數(shù)，以配合物在有機(jī)相與水相中的吸光度(315與287 nm處)的比值取對數(shù)即可得到相應(yīng)的脂水分配系數(shù)lgPO/W，Ru-1和Ru-2的分別為0.378 9和-1.036 3，說明2種配合物均具有很高的親水性，這是由于其結(jié)構(gòu)中羥基(-OH)較強(qiáng)的親水性造成的；同時，Ru-2的lgPO/W甚至為負(fù)值，說明在配體相同的情況下，多聯(lián)吡啶的結(jié)構(gòu)使其具有更強(qiáng)的親水性。與文獻(xiàn)報(bào)道的其他芳基金屬配合物[(η6-p-cym)Ru(N^N)Cl]PF6(lgPO/W=1.80)[35]和多聯(lián)吡啶釕配合物[Ru(bpy)(phpy)dppz]+(lgPO/W=1.00)[21]相比，Ru-1 與 Ru-2都具有更好的親水性。

2.3 配合物Ru-2的熒光光譜

三聯(lián)吡啶釕配合物因其較大的共軛平面，表現(xiàn)出良好的熒光性質(zhì)[36]，因此我們進(jìn)一步研究了Ru-2的熒光性質(zhì)。Ru-2的激發(fā)與發(fā)射光譜如圖2A所示，其最大激發(fā)波長為454 nm，最大發(fā)射波長為631 nm，均屬于可見光，其近紅外的最大發(fā)射波長比已報(bào)道的用于成像治療的環(huán)金屬釕配合物[Ru(phen)2dppz](ClO4)2[37]大(λem=618 nm)。Ru-2 具有比已知的環(huán)金屬釕配合物[Ru(bpy)2L](PF6)2[38](166 nm)更大的Stokes位移(177 nm)，這表明Ru-2具有較好的光學(xué)特性，可以有效避免光學(xué)測試時自發(fā)熒光的干擾。

圖2 (A)Ru-2的激發(fā)與發(fā)射光譜;(B)Ru-2在不同pH值條件下的熒光強(qiáng)度變化;(C)根據(jù)Henderson-Hasselbach方程將631 nm處熒光強(qiáng)度對pH值進(jìn)行擬合所得曲線圖;(D)Ru-2在不同金屬離子條件下于631 nm處的相對熒光強(qiáng)度Fig.2 (A)Fluorescence spectra of Ru-2;(B)Emission spectra of Ru-2 under different pH values;(C)Curve obtained by fitting the fluorescence intensity at 631 nm to pH value according to Henderson-Hasselbach equation;(D)Relative fluorescence intensity of Ru-2 at 631 nm with different metal ions

此外，酚羥基(-OH)是一種pH敏感基團(tuán)，在酸性或中性條件下，羥基是弱電子給體，但是堿性條件下，去質(zhì)子化的O-會改變分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移[39]，導(dǎo)致Ru-2的熒光光譜發(fā)生改變。因此，我們進(jìn)一步對Ru-2在不同pH值(pH=3.00～11.99)條件下的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了測定。如圖2B所示，Ru-2的熒光發(fā)射波長始終未見移動，但Ru-2在pH=3.00～8.56之間的熒光強(qiáng)度發(fā)生了少許減弱，熒光強(qiáng)度下降比率為11.7%，說明Ru-2在酸性至弱堿性環(huán)境中有相對穩(wěn)定且較強(qiáng)的熒光；隨著pH值增大至10.01時，其熒光強(qiáng)度由 2.56×105急劇下降至 8.49×104，比率高達(dá)66.8%，根據(jù)插圖中其最大發(fā)射強(qiáng)度與pH的擬合直線圖可發(fā)現(xiàn)較好的線性關(guān)系，表明Ru-2可以有效地對該范圍內(nèi)的pH進(jìn)行快速的響應(yīng)；當(dāng)pH值增大至11.99時，Ru-2的熒光強(qiáng)度在強(qiáng)堿性環(huán)境中降低至5.60×104后再次趨于穩(wěn)定。造成Ru-2熒光強(qiáng)度發(fā)生上述變化的原因是溶液的堿性提高，羥基的去質(zhì)子化作用增強(qiáng)從而發(fā)生了光致電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)(PET)。將Ru-2在631 nm處的熒光強(qiáng)度對pH作圖，得到其熒光pH滴定曲線(圖2C)。根據(jù)Henderson-Hasselbach方程對該滴定曲線進(jìn)行擬合，可得Ru-2的pKa約為9.41，即該配合物在酸性至弱堿性條件下可以保持熒光的相對穩(wěn)定，在稍高堿性環(huán)境下實(shí)現(xiàn)快速pH響應(yīng)。

配合物的pH響應(yīng)能力可能會被其他離子所干擾。溶液中存在的其他離子可能會與質(zhì)子發(fā)生競爭，進(jìn)而影響配合物的熒光響應(yīng)，其中高濃度的K+、Ca2+、Na+、Mg2+及一些過渡金屬離子影響更為明顯[40]。我們研究了配合物Ru-2在不同陽離子存在條件下的熒光強(qiáng)度(圖2D)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過渡金屬離子(Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+)及堿金屬與堿土金屬(K+、Na+、Mg2+、Ca2+)濃度為配合物濃度的1 000倍時(10 mmol·L-1)時，Ru-2的熒光強(qiáng)度均無明顯變化(熒光強(qiáng)度變化率在0.13%～5.61%)，表明這些金屬離子不影響Ru-2的熒光發(fā)射。上述結(jié)果表明Ru-2的熒光性質(zhì)不受其他金屬離子的干擾，只專一地對pH進(jìn)行響應(yīng)，具有較好穩(wěn)定性，使其具有在復(fù)雜環(huán)境中應(yīng)用的可能。

圖3 (A)配合物Ru-1和Ru-2在PBS中的紫外-可見光譜;(B)Ru-1在水溶液中的紫外-可見光譜隨時間變化圖,插圖為配合物在281 nm處吸光度對時間的擬合曲線;配合物Ru-1(C)與Ru-2(D)在PBS中滴加CT-DNA前后的紫外-可見光譜變化圖,插圖為cDNA/(εa-εf)對濃度的擬合曲線Fig.3 (A)UV-Vis absorbance spectra of complexes Ru-1 and Ru-2 in PBS;(B)Time-dependent UV absorption spectra of Ru-1 measured in H2O,inset:curve obtained by fitting the absorbance at 281 nm to time;UV spectra of Ru-1(C)or Ru-2(D)in the absence and presence of CT-DNA in PBS,inset:fitting curve of cDNA/(εa-εf)vs concentration

2.4 配合物的紫外-可見光譜及水解

配合物的紫外吸收光譜在PBS(5 mmol·L-1，pH=7.4，含 10 mmol·L-1NaCl)中測定。如圖 3A 所示，Ru-1的紫外光譜特征吸收峰在300和315 nm處，且在275 nm處出現(xiàn)肩峰。300 nm的特征峰是由于電子從Cl的π軌道躍遷到配體的π*軌道導(dǎo)致，即配體至配體電荷發(fā)生躍遷(LLCT)。Ru-2的紫外光譜特征吸收峰在287和455 nm處，且在325 nm處出現(xiàn)肩峰。455 nm處的吸收峰歸因于金屬中心Ru原子上4d軌道的電子躍遷至配體的π*軌道導(dǎo)致，即金屬到配體的電荷躍遷(MLCT)[38,41]。

配合物的水解會影響其藥理性質(zhì)，包括細(xì)胞攝取、與DNA結(jié)合、代謝以及毒性等[42]。芳基金屬配合物與生物分子反應(yīng)的潛在重要激活機(jī)制是水解，而水解是通過協(xié)調(diào)的配體交換機(jī)制發(fā)生的[43]，因此研究配合物的水解可以通過紫外-可見光譜協(xié)助探究配合物與細(xì)胞內(nèi)生物分子的結(jié)合。Ru-1在5%(體積分?jǐn)?shù))的DMSO水溶液中的水解如圖3B所示，在0～24 h之內(nèi)，其最大吸收峰316 nm處的吸光度增加很少(從1.023增加至1.036)；但在259 nm處發(fā)生了增加(從0.609增加至0.626)；在281 nm處發(fā)生了較大減弱(從0.716減少至0.673)，說明Ru-1在水溶液發(fā)生了部分內(nèi)界配位離子Cl-的離去。按照281 nm處的吸光度與時間的擬合曲線，結(jié)合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，計(jì)算出配合物Ru-1的水解速率常數(shù)和半衰期(t1/2)分別為0.63 h-1和1.10 h，與已報(bào)道的βcarboline生物堿芳基釕配合物[(η6-benzene)Ru(L3)Cl](PF6)相比[44]，后者具有極快的水解速率(t1/2=5.1 min)，表明配合物Ru-1在298 K的水溶液環(huán)境中具有較好的穩(wěn)定性，水解速率較慢。同時，無內(nèi)界配位陰離子的Ru-2在相同條件下其紫外-可見吸收光譜如圖S10所示，Ru-2在0～24 h之內(nèi)未發(fā)生明顯的變化，并未出現(xiàn)水解過程中常見的等電子點(diǎn)，只在該體系中存在豐度的相對升高。說明Ru-2在水溶液中具有更高的穩(wěn)定性，不會發(fā)生芳基金屬配合物類似的水解行為。

2.5 配合物與CT-DNA作用

紫外-可見光譜是研究配合物和DNA相互作用中常見且便捷的測試方法，其原理在于若配合物插入DNA的堿基對，其π*軌道可以與DNA的π軌道耦合，從而減少π-π*躍遷能量；另一方面，耦合的p*軌道部分地被電子填充，降低了電子躍遷幾率，這些相互作用會導(dǎo)致明顯的減色效應(yīng)或紅移[45]，即紫外光譜吸收峰會出現(xiàn)減弱的現(xiàn)象，其強(qiáng)弱可以表示配合物與DNA相互作用的強(qiáng)度。如圖3C和3D所示，通過紫外-可見光譜可以觀察到Ru-1在310～325 nm處有較強(qiáng)吸收，最強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)315 nm。Ru-2在287、321、422及457 nm處均有較強(qiáng)吸收，最強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)287 nm。2個配合物的紫外吸收強(qiáng)度在其濃度為35 μmol·L-1時出現(xiàn)了12.2%和8.3%的減色效應(yīng)，表明二者都與CT-DNA出現(xiàn)了一定程度的相互作用。通過Benesi-Hildebrand方程可以計(jì)算配合物與CT-DNA的結(jié)合常數(shù)Kb：

cDNA/(εa-εf)=cDNA/(εb-εf)+1/[Kb(εb-εf)][46]

其中cDNA是DNA的濃度，表觀吸收系數(shù)εa數(shù)值上對應(yīng)于A/(bccomplex)，εb和εf分別表示結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的配合物的消光系數(shù)。利用上述公式計(jì)算得配合物Ru-1和Ru-2與CT-DNA的結(jié)合常數(shù)Kb分別為：1.210×104和1.233×103L·mol-1，說明Ru-1與DNA的結(jié)合能力較Ru-2強(qiáng)，造成這種現(xiàn)象的原因可能是Ru-1含有可離去的Cl-，可以在水中進(jìn)行緩慢水解，其結(jié)合常數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道在同一數(shù)量級([(η6-p-cym)Ru(L1)Cl]PF6：7.8×103L·mol-1；[(η6-p-cym)Ru(L2)Cl]PF6：1.86×104L·mol-1)[47-48]。

配合物對DNA粘度影響中樣品溶液的相對粘度結(jié)合以下公式計(jì)算：

η=(t-t0)/t0[49]

圖4 在(25±0.1)℃下DNA在PBS體系中相對粘度隨EB、配合物Ru-1和Ru-2加入的變化Fig.4 Effect of addition of EB,Ru-1 and Ru-2 on relative viscosity of CT-DNA in PBS at(25±0.1)℃

其中t0為緩沖體系流經(jīng)毛細(xì)管所需時間，t為樣品DNA溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時間，η0為無配合物時DNA的相對粘度。以(η/η0)1/3對配合物與DNA的比例r作圖，可得圖4。溴化乙錠(EB)作為一種DNA插入劑，其與DNA發(fā)生相互作用時，會使其雙螺旋鏈增長，顯著增加DNA溶液的粘度[50]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA溶液體系的(η/η0)1/3隨配合物的加入而逐漸增大(Ru-1：1.092 8；Ru-2：1.053 6)，即DNA粘度出現(xiàn)不同程度的增加，2種配合物插入DNA的能力為Ru-1強(qiáng)于Ru-2，與上述紫外結(jié)果相符。這也證明2種配合物與DNA都以嵌入方式作用。

圖5 在PBS中向BSA滴加Ru-1(A)或Ru-2(B)前后的熒光變化，插圖為BSA熒光強(qiáng)度變化對配合物濃度的擬合曲線;(C、E)Ru-1、Ru-2與BSA結(jié)合的I0/I vs ccomplex關(guān)系圖，對應(yīng)Ksv和Kq;(D、F)Ru-1、Ru-2的lg(I0/I-1)vs lg ccomplex關(guān)系圖,對應(yīng)結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Fig.5 Fluorescence spectra of BSA in the absence and presence of Ru-1(A)or Ru-2(B)in PBS,inset:fitting curve of BSA fluorescence intensity change to complex concentration;(C,E)Stern-Volmer plots of I0/I against the concentration of complexes for Ksvand Kq;(D,F)Plots of lg(I0/I-1)vs lg ccomplexfor the interaction data with BSA

2.6 配合物與BSA的相互作用

研究表明，分子-蛋白質(zhì)相互作用可能對于分子的運(yùn)輸、釋放、生物分布或者藥物的毒性來說至關(guān)重要[16]，而血清白蛋白可作為金屬離子和配合物的運(yùn)輸物質(zhì)，其與配合物之間相互作用會影響配合物的生物反應(yīng)活性。研究配合物與蛋白的相互作用有助于我們理解配合物在生物體內(nèi)的作用機(jī)理。血清白蛋白(SA)是血漿中的主要蛋白質(zhì)之一，牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)構(gòu)類似于人血清白蛋白(HSA)，其中的色氨酸(Trp)與絡(luò)氨酸(Tyr)使其具有熒光[51]，蛋白質(zhì)變性或與底物結(jié)合都使其發(fā)生熒光淬滅。我們以BSA為模型，研究了2種配合物與白蛋白的結(jié)合作用。靜態(tài)淬滅機(jī)制通常是由猝滅劑(配合物)和熒光團(tuán)之間的基態(tài)結(jié)合物形成引起的，因此會引起熒光團(tuán)發(fā)射光譜的變化；而在動態(tài)淬滅機(jī)制中，猝滅劑和熒光團(tuán)在激發(fā)態(tài)下相互接觸，因此在BSA的發(fā)射光譜中沒有明顯的強(qiáng)度變化[52]。當(dāng)配合物與BSA的內(nèi)源性熒光基(Trp-212，Trp-134)結(jié)合時，會使處于疏水腔的Trp-212暴露于親水環(huán)境中，造成熒光淬滅。如圖5所示，隨著Ru-1的加入，BSA在335 nm處的熒光明顯降低(下降比率為31.6%)，并且熒光降低程度與配合物濃度在 0～20 μmol·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)較佳的線性關(guān)系，表明Ru-1與BSA可以發(fā)生明顯的結(jié)合作用。Ru-2的滴加使得BSA存在與Ru-1結(jié)合類似的變化趨勢，在330 nm處熒光強(qiáng)度下降了51.8%。證明2種配合物都可與BSA結(jié)合，并且2種情況下吸收峰都發(fā)生了一定的紅移(Δλ分別為7和11 nm)，這可歸因于極性溶劑H2O的影響[35]。

通過Stern-Volmer方程可對配合物的作用類型進(jìn)行判斷：

I0/I=1+Ksv=1+Kqτ0[52]

式中：I與I0分別表示淬滅劑(配合物)存在與不存在時溶液的熒光強(qiáng)度；Ksv為Stern-Volmer淬滅常數(shù)；Kq為雙分子熒光淬滅常數(shù)；τ0為不含淬滅劑時物質(zhì)的熒光壽命。以I0/I對ccomplex作圖，可求得配合物Ru-1、Ru-2與BSA的Stern-Volmer淬滅常數(shù)Ksv(表1)分別為2.33×104、5.40×104L·mol-1；雙分子熒光淬滅常數(shù) Kq分別為 2.33×1012、5.40×1012L·mol-1·s-1。碰撞過程導(dǎo)致動態(tài)猝滅，而蛋白與猝滅劑之間形成復(fù)合物會導(dǎo)致靜態(tài)猝滅，上述淬滅常數(shù)均大于猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2.00×1012L·mol-1·s-1[53]，所以其淬滅方式均為靜態(tài)淬滅。在靜態(tài)淬滅中，假設(shè)血清白蛋白上的獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為n，根據(jù)Scatchard方程即可計(jì)算配合物與血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)Kb與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n：

lg(I0/I-1)=lgKa+nlg ccomplex[35]

將lg(I0/I-1)對lg ccomplex作圖可得圖5D和5F，根據(jù)截距和斜率分別可以求得配合物與BSA的結(jié)合常數(shù) Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù) n(表 1)，配合物 Ru-1、Ru-2 的結(jié)合常數(shù)Ka分別為1.94×104、2.45×104，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為1.08、1.25。2種配合物與BSA的結(jié)合常數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道在同一數(shù)量級(104)[54]，屬于中等強(qiáng)度，也表明配合物造成BSA熒光靜態(tài)淬滅的原因是配合物與BSA的結(jié)合造成其發(fā)光基團(tuán)Trp-212疏水環(huán)境的改變，進(jìn)而導(dǎo)致BSA二級結(jié)構(gòu)的改變，使其熒光猝滅。

表1 配合物與BSA的Stern-Volmer熒光猝滅數(shù)據(jù)Table 1 Stern-Volmer fluorescence quenching data of BSA with complexes

2.7 配合物的單線態(tài)氧產(chǎn)率

將配合物與DPBF的CH3OH/H2O(1∶4，V/V)溶液用450 nm照射以研究Ru-2的單線態(tài)氧生成能力。標(biāo)準(zhǔn)物[Ru(bpy)3]2+在甲醇中的量子產(chǎn)率為0.81[55]。DPBF紫外吸收強(qiáng)度變化如圖6所示，在添加Ru-2并照射后，DPBF在411 nm處的吸光度迅速由1.11下降至0.36，說明在此過程中，Ru-2在溶液中產(chǎn)生了活性氧類似物種，使其捕捉劑DPBF被大量消耗。通過以下公式即可計(jì)算Ru-2的單線態(tài)氧產(chǎn)率：

Φ=Φs(k/ks)(Fs/F)[56]

式中：下標(biāo)s代表標(biāo)準(zhǔn)物[Ru(bpy)3]2+；k為(A0-At)/A0對照射時間作圖所得直線的斜率；A0為DPBF未照射時在411 nm處的吸光度，At為DPBF在依次照射后于411 nm處的吸光度；F為校正系數(shù)，數(shù)值上為1-10-OD(OD是溶液在照射波長下的吸光度)。如圖6D所示，將1-At/A0對照射時間t作圖，通過標(biāo)準(zhǔn)物與Ru-2相應(yīng)的直線斜率即可計(jì)算出甲醇中的單線態(tài)氧產(chǎn)率Φ為0.70，這與文獻(xiàn)報(bào)道的環(huán)金屬釕光敏配合物[Ru(bpy)(dppn)(CH3CN)2](PF6)2的水平相當(dāng)(Φ=0.72)[57]，表明Ru-2在體外產(chǎn)生1O2的能力較強(qiáng)，可能成為新型高效的金屬光敏劑。且從圖6B可知，Ru-2與BSA按濃度比為1∶1混合孵育后依然使DPBF的吸光度大大降低，且程度與不結(jié)合時相近(由1.10降至0.40)，即Ru-2的單線態(tài)氧產(chǎn)率未出現(xiàn)明顯下降(Φ=0.68)，證明Ru-2具有穩(wěn)定的單線態(tài)氧類物質(zhì)生成能力。同時，我們也測定了芳基金屬配合物Ru-1的單線態(tài)氧生成情況(圖S10)，相同條件下芳基金屬配合物Ru-1與DPBF共混后經(jīng)過照射，DPBF在411 nm處的吸光度僅有少許下降(從0.98降至0.88)，與Ru-2相比幾乎可以忽略，這表明Ru-1在相同條件下無法具有環(huán)金屬配合物產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力。這是由于Ru-1的“琴凳型”結(jié)構(gòu)使其不具有環(huán)金屬配合物的平面共軛結(jié)構(gòu)，不能吸收光而使電子從激發(fā)態(tài)產(chǎn)生躍遷從而發(fā)生系間竄越，不能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，因此導(dǎo)致配合物Ru-1無法生成單線態(tài)氧。

圖6 DPBF在CH3OH/H2O(1∶4,V/V)中與Ru-2(A)、Ru-2+BSA(1∶1,c/c)(B)和標(biāo)準(zhǔn)物[Ru(bpy)3]2+(C)共混后在450 nm光照條件下的紫外-可見光譜變化;(D)標(biāo)準(zhǔn)物[Ru(bpy)3]2+、Ru-2和Ru-2+BSA(1∶1,c/c)分別與DPBF共混后在411 nm下的隨光照時間延長的紫外吸收變化強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)Fig.6 UV-Vis spectra of the mixture of Ru-2(A),Ru-2+BSA(1∶1,c/c)(B)and[Ru(bpy)3]2+(C)and DPBF upon irradiation in CH3OH/H2O(1∶4,V/V);(D)1O2production via changes in the absorbance by DPBF at 411 nm vs irradiation time in the presence of Ru-2,Ru-2+BSA(1∶1,c/c)and[Ru(bpy)3]2+

2.8 配合物Ru-2的細(xì)胞成像

上述結(jié)果顯示，Ru-2具有優(yōu)秀的pH響應(yīng)且不受其他離子干擾，在此我們希望將其用于細(xì)胞成像以實(shí)現(xiàn)配合物的細(xì)胞內(nèi)造影，我們通過激光共聚焦成像對其進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)熒光觀察。如圖7所示，將Ru-2(25 μmol·L-1)與人非小細(xì)胞肺癌(A549)細(xì)胞共孵育9 h后，細(xì)胞內(nèi)幾乎未觀察到配合物的熒光，表明Ru-2在高濃度、長時間孵育下依然無法被細(xì)胞大量攝取，這可能是由于Ru-2良好的親水性(lg PO/W=-1.036 3)導(dǎo)致其難以穿過細(xì)胞的磷脂雙分子層，從而造成極低的配合物攝取量，也影響了Ru-2在細(xì)胞內(nèi)的可視化。

圖7 配合物Ru-2與A549細(xì)胞于37℃孵育9 h后的共聚焦顯微鏡圖Fig.7 Confocal microscopy images of A549 cells treated by Ru-2 for 9 h at 37℃

3 結(jié) 論

我們在修飾反式阿魏酸的基礎(chǔ)上合成、表征了2種新型釕配合物并研究了其熒光性質(zhì)及其與DNA/蛋白的相互作用。配合物均具有很好的親水性。環(huán)金屬配合物Ru-2發(fā)射波長達(dá)到近紅外的631 nm，不但具有良好的熒光性能，可實(shí)現(xiàn)對pH值在8～10之間的實(shí)時響應(yīng)，還具有較高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率(Φ=0.70)，有望成為一類高效的光敏劑。2種配合物都以中等強(qiáng)度與CT-DNA發(fā)生嵌入作用，但Ru-1作用更強(qiáng)；配合物均與BSA以中等強(qiáng)度結(jié)合但僅有一個結(jié)合位點(diǎn)，并使其熒光發(fā)生靜態(tài)淬滅。但配合物由于較強(qiáng)的親水性，無法進(jìn)入細(xì)胞，使Ru-2在細(xì)胞內(nèi)熒光成像無法實(shí)現(xiàn)。上述結(jié)果有助于理解配合物親水性與細(xì)胞攝取的關(guān)系，對開發(fā)能順利進(jìn)入細(xì)胞并保持熒光性質(zhì)的配合物有一定的指導(dǎo)意義。

Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn