清血解毒合劑的高效液相色譜指紋圖譜研究*

熊鑫，黃傳奇，程璐

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

清血解毒合劑(制劑批準(zhǔn)文號：鄂藥制字Z20180184)是武漢市第一醫(yī)院的自制制劑，具有涼血解毒的功效，用于流火丹毒、急性皮炎、皮疹。本方由地黃、野菊花、牡丹皮、黃芩、當(dāng)歸、甘草、赤芍、連翹、茯苓等9味中藥組成，日常以黃芩苷和芍藥苷為對照品的薄層鑒別作為質(zhì)量檢驗的方法，但中藥化學(xué)成分復(fù)雜，還受產(chǎn)地、加工、儲藏、制備工藝等的影響，對于復(fù)方制劑而言單一的方法難以全面反映其質(zhì)量，需要結(jié)合相應(yīng)的指紋圖譜研究。中藥指紋圖譜研究是目前國內(nèi)外普遍采用的中藥質(zhì)量監(jiān)督和管理模式，且很多復(fù)方制劑都有系統(tǒng)的研究以反映其質(zhì)量的穩(wěn)定性[1-7]。筆者在本實驗擬建立清血解毒合劑的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜研究方法，旨在為全面提高和完善清血解毒合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(Waters2489紫外檢測器，四元泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱)，BP211D電子天平(德國賽多利斯公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 沒食子酸(批號：110831-201605，含量：90.8%)、原兒茶醛(批號：110810-201608，含量：99.4%)、兒茶素(批號：110877-201604，含量：99.2%)、咖啡酸(批號：110885-200102)、芍藥苷(批號：110736-201842，含量：97.4%)、甘草苷(批號：111610-200604)和黃芩苷(批號：110715-201720，含量：93.5%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純(美國TEDIA公司)，磷酸為分析純(天津市白世化工有限公司)，純化水自制；清血解毒合劑自制(批號：18122701，19010301，19011501，19012201，19021501，19021801，19030801，19042401，19042601，19050701)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 伊利特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，2%→6%A；10～15 min，6%→10%A；15～30 min，10%→20%A；30～45 min，20%→22%A；45～55 min，22%A；55～65 min，22%→25%A；65～85 min，25%→40%A；85～86 min，40%→2%A；86～90 min，2%A)[8-18]，柱溫30 ℃，檢測波長230 nm，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。

2.2對照品溶液制備 精密稱取減壓干燥至恒重的沒食子酸、原兒茶醛、兒茶素、咖啡酸、芍藥苷、甘草苷和黃芩苷對照品適量至25 mL量瓶中，加80%甲醇溶解定容，搖勻，分別制成對照品溶液。再精密吸取各對照品溶液適量至同一量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得混合對照品(濃度分別為沒食子酸102.5 μg·mL-1、原兒茶醛118.7 μg·mL-1、兒茶素105.3 μg·mL-1、咖啡酸117.7 μg·mL-1和芍藥苷112.5 μg·mL-1、甘草苷135.5 μg·mL-1、黃芩苷151.4 μg·mL-1)。

2.3供試品溶液制備 精密移取本品5 mL至25 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，以孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度實驗 將清血解毒合劑(批號：18122701)按“2.3”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，測定6次，記錄共有峰保留時間和峰面積，以26號黃芩苷為參照峰，測得樣品的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3.00%，說明儀器的精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性實驗 將清血解毒合劑(批號：18122701)按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別于0，2，4，8，16，24 h內(nèi)進(jìn)樣，記錄共有峰保留時間和峰面積，以26號黃芩苷為參照峰，測得樣品的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<5.00%，說明供試品室溫下的穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復(fù)性實驗 取相同批號(批號：18122701)的清血解毒合劑，按“2.3”項制備方法，同時平行制備樣品6份，并按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，記錄共有峰保留時間和峰面積，以26號黃芩苷為參照峰，測得樣品的各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均<5.00%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.5指紋圖譜的建立及分析

2.5.1指紋圖譜的建立 取10批清血解毒合劑，按“2.3”項方法制備樣品，按“2.1”項色譜條件分別進(jìn)行測定，并記錄共有峰保留時間和峰面積。將10批供試品的HPLC圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2010版)軟件，選擇S1為參照圖譜，中位數(shù)法，時間寬度為0.5，進(jìn)行匹配，隨即建立清血解毒合劑的指紋圖譜，并生成對照色譜圖R，見圖1。

圖1 10批清血解毒合劑HPLC指紋圖譜及對照圖譜

2.5.2共有峰的確定及參照峰的選擇 根據(jù)10批清血解毒合劑的保留時間和峰面積計算，以及對照圖譜R的參考，選取36個峰形好，保留時間和峰面積穩(wěn)定的峰為清血解毒合劑的共有特征峰，且其中26號色譜峰黃芩苷分離度好，峰面積穩(wěn)定，峰型好，故選黃芩苷為本制劑HPLC指紋圖譜的參照峰，見圖2。

圖2 共有峰HPLC色譜圖

2.5.3色譜峰的指認(rèn) 根據(jù)分析清血解毒合劑單味藥的成分，對比已知對照品，確定了指紋圖譜中7個峰的成分，分別為沒食子酸、原兒茶醛、兒茶素、咖啡酸、芍藥苷、甘草苷和黃芩苷，見圖3。

1.沒食子酸；2.原兒茶醛；3.兒茶素；4.咖啡酸；5.芍藥苷；6.甘草苷；7.黃芩苷。

2.5.3相似度評價 對10批清血解毒合劑采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2010版)軟件進(jìn)行指紋圖譜分析，得到的10批樣品和對照指紋圖譜的相似度，見表1，且以26號黃芩苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表2，3。

3 討論

3.1波長的選擇 本制劑中共9味中藥，根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)藥材項下含量測定的內(nèi)容和部分文獻(xiàn)參考分析總結(jié)，并結(jié)合全波長掃描的結(jié)果，選取270，250，230，220 nm作為樣品的預(yù)測波長，綜合觀察分析，在波長230 nm處，樣品的色譜峰豐富，分離度好，基線平穩(wěn)且能有多個已知對照品能與樣品色譜圖中的峰對應(yīng)上，作為指紋圖譜分析，有多個特征峰及指認(rèn)峰，能較好地展現(xiàn)樣品的HPLC峰形，故選擇230 nm作為清血解毒合劑指紋圖譜的檢測波長。

表1 10批清血解毒合劑指紋圖譜相似度結(jié)果

表2 10批清血解毒合劑共有峰的相對保留時間

續(xù)表2 10批清血解毒合劑共有峰的相對保留時間

表3 10批清血解毒合劑共有峰的相對峰面積

續(xù)表3 10批清血解毒合劑共有峰的相對峰面積

3.2流動相的選擇 本實驗按參考文獻(xiàn)的流動相選擇甲醇-0.1%或0.05%磷酸溶液、甲醇-水、乙腈-0.1%或0.05%磷酸溶液系統(tǒng)來對清血解毒合劑的樣品進(jìn)行流動相的選擇，結(jié)果顯示，在乙腈-0.05%磷酸溶液的梯度下，色譜峰分離度良好，無前延或者拖尾等現(xiàn)象，故選擇此流動相并調(diào)整梯度到樣品色譜峰峰型和分離度最佳。

3.3特征峰及參照峰的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)選取常見已知對照品在波長230 nm處與本制劑色譜峰進(jìn)行比對，標(biāo)出沒食子酸、原兒茶醛、兒茶素、咖啡酸、芍藥苷、甘草苷和黃芩苷這7個指認(rèn)峰，且黃芩苷在230 nm處峰型好，保留時間穩(wěn)定，峰面積大，特征性強，故選取黃芩苷為參照峰。在本制劑的色譜峰中，標(biāo)出的36個特征峰，均以黃芩苷為參照峰計算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果良好。在共有色譜峰中，29～32這4個色譜峰在共有峰中分離度不佳，但在單獨的10批色譜峰中，這四個峰分離度、相對保留時間和相對峰面積均良好。觀察整個色譜峰，30～40 min這一段分離度不夠好，考慮降低有機相比例或減慢流速，但效果不佳，還延長整個色譜峰的出峰時間，故選擇緩慢增加有機相，在最佳的流動相比例下完成色譜圖。

本實驗中，10批清血解毒合劑的指紋圖譜的相似度均在0.833～0.987，大部分相對峰面積和相對保留時間均在合理的范圍內(nèi)，表明清血解毒合劑各批次間無明顯的差異，飲片質(zhì)量穩(wěn)定、制備工藝純熟，且本實驗建立的指紋圖譜方法簡單、可靠，操作重復(fù)性強，可用于清血解毒合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢驗。