干細(xì)胞白血病基因藥物對(duì)糖尿病膀胱病豚鼠膀胱Cajal間質(zhì)細(xì)胞表面c-kit蛋白表達(dá)的影響*

李朋，徐浩，申茂磊，趙國(guó)立，錢(qián)彪，王勤章

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆石河子 832000；2.解放軍69235部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，新疆奎屯 833200)

糖尿病是一種以胰島素分泌障礙和生物效應(yīng)受損為特征的代謝障礙性疾病，其具體病因至今仍不完全明確。據(jù)調(diào)查中國(guó)成年人糖尿病患病率約為11.6%，且呈逐年升高的趨勢(shì)[1-2]。糖尿病膀胱病(diabetic cystopathy，DCP)是一種常見(jiàn)的糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，在糖尿病人群中的發(fā)病率20%～80%[3]，主要臨床表現(xiàn)為膀胱敏感性下降、膀胱收縮功能障礙、最大膀胱容量增加、殘余尿量增多等，可伴尿急、尿失禁及反復(fù)尿路感染[4-5]，嚴(yán)重影響患者的工作和生活，越來(lái)越引起人們的重視。DCP的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的、多因素的和時(shí)間依賴(lài)的過(guò)程[6]，其中肌源性、神經(jīng)源性和尿路上皮變化是DCP形成的主要原因[7-8]。豚鼠膀胱內(nèi)有一種形態(tài)結(jié)構(gòu)類(lèi)似于胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)，被稱(chēng)為膀胱ICCs[9-10]。多項(xiàng)研究表明，膀胱ICCs可能是影響膀胱逼尿肌收縮活動(dòng)的起搏器。前期研究證明高糖環(huán)境下膀胱ICCs膜上酪氨酸蛋白激酶(c-kit)受體表達(dá)降低，可導(dǎo)致ICCs數(shù)量減少和功能受損[11-12]。本研究通過(guò)以慢病毒為載體構(gòu)建含干細(xì)胞白血病(stem cell leukemia，SCL)基因藥物的重組慢病毒，實(shí)現(xiàn)將SCL基因藥物成功導(dǎo)入豚鼠DCP膀胱，通過(guò)觀察SCL基因藥物導(dǎo)入后ICCs表面c-kit受體的表達(dá)，初步研究SCL基因藥物對(duì)豚鼠DCP膀胱ICCs的影響，旨在為臨床DCP的治療開(kāi)辟一條新思路。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 普通級(jí)荷蘭種健康雄性豚鼠60只，4～6個(gè)月齡，體質(zhì)量200～300 g，普通環(huán)境飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制18～25 ℃，日溫差 ≤4 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，工作照度≥200 lx，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2018-0003，本研究全部?jī)?nèi)容已經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2藥品與試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Solarbio公司，批號(hào)：615K0327)，SCL基因重組慢病毒載體藥物(上海吉?jiǎng)P恩公司)，熒光標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BA1031)，鼠單抗c-kit(Santa公司，批號(hào)：sc-365504)，羊抗小鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BA1051)，Western blotting試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司，批號(hào)：L00205C-1)。

1.3儀器與設(shè)備 RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，TCSSP5激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，GX51光學(xué)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，DYCZ-24DN垂直電泳槽(北京六一儀器廠)，DYCZ-40電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)。

1.4模型制備 60只健康雄性豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，按照200 mg·kg-1單次腹腔注射1% STZ溶液(將STZ溶于0.1 mol·L-1、pH值4.4新鮮枸櫞酸緩沖液配成)。常規(guī)飼養(yǎng)6周后剪耳法檢測(cè)隨機(jī)血糖，以連續(xù)4周隨機(jī)血糖≥16.7 mmol·L-1為標(biāo)準(zhǔn)篩選出糖尿病豚鼠。誘導(dǎo)成功動(dòng)物模型繼續(xù)飼養(yǎng)2周后，>88.89%糖尿病豚鼠出現(xiàn)失代償期糖尿病膀胱病癥狀，即認(rèn)為豚鼠DCP模型建立成功[13]。

1.5動(dòng)物分組及給藥 將造模成功27只DCP豚鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組各9只。實(shí)驗(yàn)前禁食禁水6 h，腹腔注射100 mg·mL-1水合氯醛200 mg·kg-1行麻醉，麻醉后將豚鼠四肢固定于操作臺(tái)上，充分暴露陰莖，消毒后鋪一次性洞巾，插入自制導(dǎo)尿管，排空膀胱及輸尿管尿液。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尿道灌注的SCL基因重組慢病毒藥物(MOI為2×107U)0.2 mL；陽(yáng)性對(duì)照組灌注不含SCL基因的慢病毒+磷酸鹽緩沖液(PBS)0.2 mL；空白對(duì)照組灌注PBS 0.2 mL。灌注后結(jié)扎尿管，使灌注液于膀胱中保存2 h。2 h后將豚鼠放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6培養(yǎng)ICCs 分別于灌注結(jié)束后第7，14，28 天，每次每組麻醉處死豚鼠3只，剖腹后迅速剪取膀胱，排盡殘余尿液，置于冰上PBS(含0.01 mol·L-1雙抗)培養(yǎng)皿中浸泡10 min；用PBS沖洗3次后，置于0.01 mol·L-1的PBS溶液中將其剪成碎塊1 mm3；將剪碎的膀胱放入10 mL離心管中用胰蛋白酶消融15～30 min，加入膠原酶V后繼續(xù)消融40 min；觀察膀胱組織不再是團(tuán)塊狀后加入等劑量胎牛血清(FBS)終止消融；1000 r·min-1離心2 min后濾過(guò)收取濾液，繼續(xù)以1500 r·min-1離心5 min；離心后緩慢倒去上層懸液，留取下層白色團(tuán)液，再加入新鮮DMEM，吹打單細(xì)胞懸液，并接種于共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿中；在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。更換培養(yǎng)基，將未貼壁的平滑肌細(xì)胞吸出，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至72 h后即可得到ICCs。

1.7ICCs鑒定 在6孔培養(yǎng)板各孔中放置無(wú)菌消毒的載玻片，用移液器將ICC懸液滴至載玻片中間位置，加入培養(yǎng)基1 mL，接種8 h，再加入培養(yǎng)基1 mL培養(yǎng)48 h后，取出細(xì)胞爬片，稀釋一抗和二抗(熒光素標(biāo)記)，使工作濃度達(dá)1：100；1%PBS漂洗3次，每次15 min；室溫條件下用100%丙酮溶液固定15 min，風(fēng)干后用PBS漂洗3次；采用0.03%過(guò)氧化氫(H2O2)溶液處理內(nèi)源性過(guò)氧化物酶； PBS溶液漂洗3次；孵化30 min；緩慢吸取孵化液，與經(jīng)過(guò)稀釋的一抗融合，濕盒內(nèi)室溫孵育2 h后置于-4 ℃冰箱繼續(xù)孵育48 h；PBS溶液漂洗3次；室溫下與二抗(熒光羊抗小鼠抗體)避光孵育60 min； PBS溶液漂洗3次；滴加50%甘油溶液于細(xì)胞爬片，用蓋玻片封閉，吸去滲出的甘油，風(fēng)干后在激光共聚焦顯微鏡下觀察ICCs數(shù)量及分布特點(diǎn)。

1.8Western blotting檢測(cè)c-kit蛋白的表達(dá) 倒掉培養(yǎng)液，干燥培養(yǎng)瓶，每瓶細(xì)胞加入于4 ℃預(yù)冷的PBS液(0.01 mol·L-1，pH值7.2～7.3)3 mL。洗滌細(xì)胞并棄去洗液。重復(fù)2次以洗去培養(yǎng)液。棄凈PBS后把培養(yǎng)瓶置于冰上。加PMSF后搖勻置于冰上。加含PMSF的裂解液后于冰上裂解30 min，裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后移至1.5 mL離心管中。4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min，將離心上清液轉(zhuǎn)移到0.5 mL的離心管中，置于-20 ℃環(huán)境下保存。蛋白含量測(cè)定，電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，凝膠圖像分析。

2 結(jié)果

2.1成功建立豚鼠DCP模型 60只豚鼠經(jīng)單次腹腔注射STZ，飼養(yǎng)過(guò)程中死亡3只。常規(guī)飼養(yǎng)6周后以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol·L-1為標(biāo)準(zhǔn)共篩選出52只糖尿病豚鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)2周后，行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)豚鼠膀胱殘余尿量，以殘余尿量>10%膀胱容量為豚鼠DCP診斷標(biāo)準(zhǔn)，最終成功建立48個(gè)DCP豚鼠模型。

2.2ICCs形態(tài)觀察 體外分離的膀胱組織采用酶消融法培養(yǎng)72 h后，倒置顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)良好ICCs，細(xì)胞呈梭型，胞核大，兩端發(fā)出軸絲2～4 條，鏡下可見(jiàn)單聚體與二聚體兩種形態(tài)的ICCs(圖1)，本研究以二聚體ICCs作為研究對(duì)象。

A 單倍體；B 二倍體

2.3免疫熒光 激光掃描共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)標(biāo)記的c-kit蛋白呈現(xiàn)綠色熒光，主要表達(dá)在ICCs細(xì)胞膜上。實(shí)驗(yàn)組ICCs細(xì)胞熒光強(qiáng)度較其他兩組明顯增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

2.4c-kit蛋白表達(dá)結(jié)果 在7，14，28 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組c-kit蛋白表達(dá)較陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組較空白對(duì)照組c-kit蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。14 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組c-kit表達(dá)較7 d時(shí)明顯升高(P<0.05)，隨后在28 d時(shí)稍有下降(P<0.05)。其他兩組在3個(gè)時(shí)間段c-kit表達(dá)組間組內(nèi)對(duì)比均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

3 討論

通過(guò)單次腹腔注射足量STZ的方式損傷豚鼠胰島β細(xì)胞，使胰島素合成和分泌減少，形成糖代謝紊亂，參照文獻(xiàn)[14]中方法篩選出所需DCP豚鼠模型。通過(guò)構(gòu)建重組慢病毒將SCL基因藥物轉(zhuǎn)染入DCP膀胱，于轉(zhuǎn)染后第7，14和28天取膀胱組織用于培養(yǎng)ICCs細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)單倍體ICCs和二聚體ICCs兩種細(xì)胞形態(tài)，二聚體ICCs特有的二聚體結(jié)構(gòu)是高興奮性鈣波形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，與自律性較低的單倍體相比，二聚體ICCs更易在膀胱組織中發(fā)揮起搏及興奮傳遞作用[15]，且二聚體ICCs能特異性表達(dá)c-kit，可能是激發(fā)逼尿肌興奮活動(dòng)的始動(dòng)者，起著起搏作用[16]，因此在本研究中以二聚體ICCs作為研究對(duì)象。

A.實(shí)驗(yàn)組；B.陽(yáng)性對(duì)照組；C.空白對(duì)照組。

①與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.05。

c-kit蛋白是ICCs細(xì)胞膜表面的特異性標(biāo)志，是原癌基因c-kit所編碼的跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，位于人染色體4q12-13處[17]。c-kit受體和細(xì)胞外環(huán)境中的干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)結(jié)合后SCF/c-kit信號(hào)通路被激活[18]，通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)Ras、Raf、絲裂原活化的蛋白激酶和磷脂酰?、蠹っ傅刃盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將信號(hào)傳入胞核，從而調(diào)控多種基因的表達(dá)，對(duì)ICCs的發(fā)育、分化及表型維持具有重要意義[19]。前期研究表明導(dǎo)致DCP形成的一個(gè)主要原因是高糖環(huán)境下ICCs不斷萎縮或數(shù)量減少，細(xì)胞表面c-kit蛋白和mRNA表達(dá)下降，造成SCF/c-kit信號(hào)通路傳輸功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致膀胱敏感性下降、排尿階段逼尿肌收縮性減弱、膀胱容量升高、膀胱殘余尿量變多等[20-21]。SCL基因是c-kit上游重要的調(diào)控基因，可作用于c-kit基因的啟動(dòng)子，極強(qiáng)地促進(jìn)c-kit的表達(dá)，并使其對(duì)SCF反應(yīng)性恢復(fù)正常，有助受損的SCF/c-kit信號(hào)通路恢復(fù)[22-23]。據(jù)此推測(cè)：以慢病毒為載體，構(gòu)建SCL基因重組慢病毒藥物，以轉(zhuǎn)染的方式將SCL基因經(jīng)尿道導(dǎo)入豚鼠DCP膀胱中，SCL基因藥物使DCP膀胱受損ICCs表面c-kit的表達(dá)升高，同時(shí)SCF/c-kit信號(hào)通路被修復(fù)，最終可使ICCs細(xì)胞功能得到恢復(fù)。

在本實(shí)驗(yàn)中，SCL基因藥物經(jīng)重組慢病毒轉(zhuǎn)染入實(shí)驗(yàn)組豚鼠DCP膀胱，分別于轉(zhuǎn)染后第7，14，28天，在激光共聚焦顯微鏡下觀察3組ICCs細(xì)胞c-kit受體的表達(dá)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組ICCs熒光強(qiáng)度較其他兩組明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組ICCs熒光強(qiáng)度對(duì)比無(wú)明顯差異。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示第14天時(shí)SCL重組慢病毒藥物轉(zhuǎn)染效果較好，實(shí)驗(yàn)組c-kit表達(dá)與其他兩組相比明顯增高，陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組c-kit表達(dá)對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們之前的推測(cè)基本一致。

綜上所述，SCL基因藥物導(dǎo)入豚鼠DCP膀胱中，能夠上調(diào)受損ICCs細(xì)胞c-kit受體的表達(dá)，進(jìn)而使SCF/c-kit信號(hào)通路得到修復(fù)，有利于ICCs細(xì)胞起搏功能的恢復(fù)，也為臨床DCP的治療提供一個(gè)新思路。