白楊素對高脂飲食誘導的家兔動脈粥樣硬化干預作用研究*

楊波，胡有志，張峰，肖金鳳，胡勇

(湖北省中醫(yī)院心內(nèi)科，湖北中醫(yī)藥大學，武漢 430061)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)誘導的心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是造成人類死亡的重要原因。據(jù)《中國心血管病報告2017》數(shù)據(jù)顯示，我國目前CVD患者約為2.9億例，同時，我國每年死于CVD約350萬例，占總死亡原因41%，居各種疾病之首[1]。目前認為AS是一種脂質沉積于血管壁的慢性炎癥疾病[2]，在AS病理過程中，除了血管局部的炎癥反應和脂質沉積外，氧化應激也在AS發(fā)生、發(fā)展過程中起到至關重要的作用。

白楊素是一種從紫藏科植物木蝴蝶中提取的天然黃酮類化合物，具有抗癌、抗氧化應激、抑制炎癥反應和降低血糖等廣泛的藥理學作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著減輕過氧化氫(H2O2)誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化應激損傷，抑制細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管間粘附分子-1(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)基因表達，上調(diào)細胞一氧化氮(nitric oxide，NO)合成[3]。筆者在本實驗擬通過高脂飲食誘導的家兔AS模型觀察和分析白楊素在整體水平下對AS的干預作用及機制，為充分挖掘白楊素藥理學作用提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年健康雄性日本大耳白兔24只，普通級，體質量(2.8±0.2)kg，購于湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，合格證編號：42000600004459，月齡3～6個月，單獨飼養(yǎng)于兔籠內(nèi)，環(huán)境溫度20～24 ℃，相對濕度30%～50%，每日12 h明暗周期照明，適應性喂養(yǎng)1周后，開始實驗。

1.2主要試劑及儀器 白楊素，貨號：YB-0284，純度≥90%(上海遠慕生物科技有限公司)，總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒(南京建成生物工程研究所)，總超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)、二喹啉甲酸(bicin-choninic acid，BCA)蛋白濃度及蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(江蘇碧云天生物技術有限公司)，RIPA裂解液(江蘇碧云天生物技術有限公司)，Von Kossa染色試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)，油紅O及二氫乙啡啶(dihydroethidium，DHE，Sigma-Aldrich公司)。

1.3儀器 H1650離心機(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)，Allegra 64R低溫高速離心機(美國Beckman Coulter公司)，1510酶標儀(美國Thermo Fisher公司)，BX41多功能顯微鏡(日本Olympus公司)，RM2235石蠟切片機(德國Leica公司)，CM1860冰凍切片機(德國Leica公司)，BGZ-70電熱鼓風干燥箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)。

1.4分組與給藥 利用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件將24只家兔隨機分成3組：正常對照組、模型對照組和白楊素組，每組8只。正常對照組給予普通飼料，模型對照組和白楊素組給予高脂飼料(含豬油5%和膽固醇1%)。4周后，白楊素組除給予高脂飼料外，每天灌胃給予白楊素25 mg·kg-1，白楊素采用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)混懸助溶。正常對照組和模型對照組則灌胃給予等體積0.5%CMC-Na混懸液，每天1次，共8周。實驗過程中，每周稱定體質量1次，按體質量變化調(diào)整給藥量。

1.5血脂水平測定 實驗結束前一天，禁食12 h，耳緣靜脈取血，離心(3500×g，10 min)分離血清，血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平測定嚴格按照試劑盒說明書步驟執(zhí)行。

1.6病理學觀察 水合氯醛過量麻醉處死家兔，分離主動脈，4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋，切片厚度6 μm，HE和Von Kossa染色步驟嚴格按染色試劑盒說明書執(zhí)行。部分主動脈經(jīng)OCT包埋，冰凍切片機切片，厚度8 μm，進行油紅O染色。上述切片在多功能顯微鏡下進行病理學檢查。

1.7主動脈超氧陰離子(superoxide anion，O2·-)水平測定 主動脈O2·-水平測定通過DHE熒光染色半定量法測定，冰凍切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min，DHE(10 μmol)室溫避光染色10 min后，PBS清洗切片3次，每次5 min，抗熒光淬滅封片劑封片，多功能顯微鏡拍照，Image J軟件(1.8.0)計算熒光強度。

1.8主動脈MDA濃度及SOD活性測定 RIPA裂解液冰浴勻漿主動脈，勻漿液在4 ℃條件下離心(12 000×g，5 min)，取上清液待測，MDA濃度及SOD活性測定嚴格按照試劑盒說明進行。此外，用BCA試劑盒測定上清液中蛋白濃度，用于校正MDA濃度及SOD活性。

2 結果

2.1白楊素顯著改善AS家兔血清脂質紊亂 與正常對照組比較，模型對照組家兔血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與模型對照組比較，白楊素組血清TC、TG和LDL-C水平顯著降低(P<0.05)，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)(圖1)。

2.2白楊素顯著減輕AS家兔主動脈組織病理學變化 HE染色顯示：正常對照組家兔主動脈壁的各層結構正常，內(nèi)膜光滑，中膜彈力纖維在正常狀態(tài)。模型對照組可見明顯內(nèi)皮部分細胞脫落，內(nèi)中膜呈明顯增厚現(xiàn)象，且凸向管腔內(nèi)。此外，可見大量的平滑肌細胞移行至內(nèi)膜下形成纖維帽，內(nèi)膜下的泡沫細胞及沉積的脂質形成了脂質核心，部分可見鈣化。外膜上可見有炎性細胞聚集于此。白楊素組中內(nèi)膜尚光滑，中膜增厚，泡沫細胞明顯減少，未見脂質核心形成(圖2)。

油紅O 染色顯示：正常對照組家兔主動脈壁脂質沉積不明顯。模型對照組可見明顯主動脈壁脂質沉積現(xiàn)象，尤其在內(nèi)膜層。白楊素組主動脈壁脂質沉積明顯減少(圖2)。

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

Von Kossa染色顯示：正常對照組小鼠主動脈結構染色均勻，呈淡紅色，未見黑色顆粒狀沉淀。模型對照組主動脈內(nèi)膜下可見大量的黑色結節(jié)狀沉淀，說明存在大量鈣化灶。而白楊素組中主動脈內(nèi)膜下僅見散在的黑色結節(jié)，說明存在輕微的動脈鈣化灶(圖2)。2.3白楊素顯著降低AS家兔主動脈O2·-水平 DHE染色半定量分析發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型對照組主動脈O2·-水平明顯升高(P<0.05)；與模型對照組比較，白楊素組家兔主動脈O2·-水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

2.4白楊素顯著抑制AS家兔主動脈氧化應激 與正常對照組比較，模型對照組家兔主動脈MDA濃度顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型對照組比較，白楊素組家兔主動脈MDA濃度顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)，見圖4。

3 討論

AS發(fā)病機制復雜，涉及多種風險因素和遞質，循環(huán)膽固醇水平異常至今仍被認為是AS重要的病理誘因之一，尤其是LDL和HDL[4]。目前認為，升高的血清TG和LDL及降低的HDL具有顯著的促AS作用[5]。在促AS飲食喂養(yǎng)的白化Wistar大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著降低AS模型大鼠血清TC、TG和LDL-C，升高HDL-C，并顯著減輕胸主動脈中膜層損傷和外膜層厚度[6]。筆者在本研究發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著降低AS家兔血清TC、TG和LDL-C水平，升高HDL-C，減輕AS家兔主動脈組織病理學變化。

圖2 3組家兔主動脈組織病理學變化(×100)

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

氧化應激同樣也參與AS發(fā)生發(fā)展。氧化應激能夠導致活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)異常增多和抗氧化系統(tǒng)失衡。增多的ROS能夠誘導血管內(nèi)皮細胞功能紊亂，平滑肌細胞增殖和巨噬細胞募集及炎癥因子釋放等一系列脂質斑塊形成的病理事件[7]。O2·-是ROS主要組成物質之一，其降解主要由SOD先催化為過氧化氫，隨后通過谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和過氧化氫酶(catalase，CAT)分解為二氧化碳和水[8]。MDA主要由ROS降解多不飽和脂肪酸產(chǎn)生，其能造成細胞線粒體DNA損傷并加速AS發(fā)展[9]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶誘導血管環(huán)O2·-水平[10]。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著提升高膽固醇血癥Wistar大鼠血清和肝臟SOD活性，降低肝臟MDA水平[6，11]。本文發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著降低AS家兔主動脈O2·-和MDA水平，升高主動脈SOD活性，抑制血管局部氧化應激。

本研究也存在部分不足之處：①初步闡明了白楊素可通過抑制血管氧化應激起到抗AS作用，白楊素通過何種機制發(fā)揮其抗氧化應激作用尚需進一步研究；②基于動物實驗的“3R”原則，本研究中未設置陽性對照組，在下一步闡明白楊素抗AS作用機制的研究中，將設置陽性對照組進一步研究探討。

本實驗發(fā)現(xiàn)白楊素能顯著改善AS家兔血清脂質異常，減輕主動脈組織病理學變化，降低主動脈O2·-水平，抑制主動脈氧化應激。上述發(fā)現(xiàn)表明，白楊素對高脂飲食誘導的AS具有顯著的干預作用，調(diào)節(jié)血脂和抑制主動脈氧化應激可能是其抗AS作用機制之一。