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    DJ-1 mRNA在主動(dòng)脈夾層患者中的表達(dá)及其臨床意義

    2020-10-11 13:04:46陳越魏翔蔣丁勝劉立剛
    中國(guó)心血管雜志 2020年4期
    關(guān)鍵詞:主動(dòng)脈弓同濟(jì)平滑肌

    陳越 魏翔 蔣丁勝 劉立剛

    430030 武漢,華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心臟大血管外科

    主動(dòng)脈夾層是一種心胸外科的常見(jiàn)急癥,因其發(fā)病急、進(jìn)展快、死亡率高,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。最新統(tǒng)計(jì)顯示,主動(dòng)脈夾層發(fā)生率為6人/10萬(wàn)人/年,全因致死率為2.78/10萬(wàn)人[1]。特別是對(duì)于Stanford A型主動(dòng)脈夾層,手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高[2],患者及家屬常需承受巨大的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。主動(dòng)脈夾層發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及多個(gè)病理生理學(xué)過(guò)程,包括平滑肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等,但其具體分子機(jī)制尚未完全闡明。DJ-1基因,編碼PARK7蛋白,是一種廣泛存在于全身的絲裂原依賴(lài)性癌蛋白,在進(jìn)化中高度保守,屬于DJ-1/ThiJ/PfpI蛋白超家族[3]。目前,諸多研究證實(shí)DJ-1在神經(jīng)系統(tǒng)疾病,特別是帕金森病[4]中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能,但心血管領(lǐng)域知之甚少。因此,本文對(duì)DJ-1在主動(dòng)脈夾層中的表達(dá)及作用進(jìn)行探究。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料

    主動(dòng)脈夾層主動(dòng)脈壁取自13例Stanford A型主動(dòng)脈夾層患者進(jìn)行血管置換手術(shù)來(lái)源標(biāo)本,所有患者均完成CT血管造影(CTA)并在此基礎(chǔ)上完成三維重建,分別于升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈處測(cè)量并記錄主動(dòng)脈直徑。正常主動(dòng)脈壁標(biāo)本從11例擴(kuò)張型心肌病或冠心病患者進(jìn)行心臟移植時(shí)獲得。標(biāo)本切除后部分速凍于液氮并保存于-80℃冰箱,部分保存于4%多聚甲醛溶液后經(jīng)石蠟包埋保存。以上所有手術(shù)均在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院完成,所有患者均已告知其標(biāo)本用途并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 蘇木精-伊紅(HE)染色

    蠟塊切片后先于65℃烤片1 h,后依次經(jīng)二甲苯、100%、95%和70%乙醇水合,再經(jīng)蘇木精(5 min)、1%鹽酸乙醇(1 s)、Scott液(1 min)和伊紅(1 min)染色,最后經(jīng)70%、95%、100%乙醇和二甲苯脫水封片,顯微鏡(Olympus公司,日本)下觀察并比較主動(dòng)脈夾層與正常主動(dòng)脈壁標(biāo)本的基本病理改變。

    1.3 彈性纖維(EVG)染色

    蠟塊切片烤片并經(jīng)水合后,依次經(jīng)高錳酸鉀(5 min)、草酸(5 min)、95%乙醇(5 s)后,在Elastin染液中過(guò)夜孵育后再次95%乙醇(5 s)分化鏡檢,流水沖洗后經(jīng)Van Gieson染液(1 min)、95%乙醇(5 s),最后脫水封片,鏡下觀察主動(dòng)脈壁中彈性纖維(紅色區(qū)域)斷裂情況及中膜的完整性,分析中層破壞程度。

    1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)

    取主動(dòng)脈夾層和正常主動(dòng)脈壁組織,利用TRIzol試劑(Invitrogen),通過(guò)酚氯仿抽提法提取組織中的RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme)逆轉(zhuǎn)為cDNA。以18S為內(nèi)參,采用RT-PCR儀器(Bio-Rad公司,美國(guó))分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因,根據(jù)Ct值計(jì)算各組織中相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行比較分析。PCR反應(yīng)體系為10 μl,采用兩步法,95℃ 5 min后40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)為95℃ 5 s和60℃ 30 s。DJ-1引物序列:正向5’-GCTCTGTTGGCTCATGAAATAG-3’,反向5’- CAGAGTAGGTGTAATGACCTCC-3’;18S引物序列:正向5’- CTCAACACGGGAAACCTCAC-3’,反向5’- CGCTCCACCAACTAAGAACG-3’。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    主動(dòng)脈夾層患者與無(wú)主動(dòng)脈夾層患者的臨床基本資料如表1所示,兩組各項(xiàng)資料比較均無(wú)顯著差異(均為P>0.05)。CTA三維重建顯示,主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈經(jīng)內(nèi)膜破口撕裂,出現(xiàn)巨大假腔,導(dǎo)致各重要器官供血不足(圖1)。HE染色顯示,正常主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完整,平滑肌細(xì)胞排列有序(圖2);而主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈壁中平滑肌細(xì)胞部分出現(xiàn)凋亡,排列混亂,同時(shí)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞廣泛浸潤(rùn),提示局部炎癥反應(yīng)較重(圖2)。此外,EVG染色可見(jiàn),正常主動(dòng)脈中層具有排列緊密的彈性纖維,未見(jiàn)斷裂;相比于正常組織,夾層的主動(dòng)脈壁中膜彈性纖維顯著減少,排列紊亂,且大量彈性纖維斷裂導(dǎo)致間隙變大(圖2),這與主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈壁張力和彈性減弱的臨床表現(xiàn)一致。

    表1 主動(dòng)脈夾層組與無(wú)主動(dòng)脈夾層組患者的臨床資料比較

    FL:假腔;TL:真腔。A:主動(dòng)脈弓:在主動(dòng)脈弓平面可見(jiàn)夾層所造成的主動(dòng)脈假腔巨大且壓迫真腔,影響血液供應(yīng);B:升主動(dòng)脈和胸主動(dòng)脈:主動(dòng)脈夾層的假腔起源于升主動(dòng)脈,沿主動(dòng)脈弓一直撕裂主動(dòng)脈壁至胸主動(dòng)脈;C:三維重建正位:可見(jiàn)主動(dòng)脈夾層破口起源于升主動(dòng)脈,經(jīng)主動(dòng)脈弓延伸至胸主動(dòng)脈;D:三維重建背位:從背側(cè)可見(jiàn)主動(dòng)脈夾層的假腔包裹真腔,導(dǎo)致血管受壓,血供不足

    HE染色顯示,主動(dòng)脈夾層患者的血管壁較正常主動(dòng)脈壁細(xì)胞排列紊亂,部分平滑肌細(xì)胞凋亡;EVG染色顯示,正常的血管壁彈性纖維排列緊密,而主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈壁彈性纖維降解斷裂,排列無(wú)序

    RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),DJ-1 mRNA水平在主動(dòng)脈夾層樣本中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖3),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.000±0.788 比 0.314±0.381,t=2.64,P=0.02)。由此可見(jiàn),主動(dòng)脈夾層中,DJ-1在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中呈現(xiàn)減弱趨勢(shì),最終可能導(dǎo)致蛋白水平的降低,推測(cè)其表達(dá)水平的降低促進(jìn)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步將DJ-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平與主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈各部位直徑作相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)DJ-1的表達(dá)與患者的升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈直徑均無(wú)顯著相關(guān)性(r2=0.014,P=0.71;r2=0.002,P=0.90;r2=0.001,P=0.95和r2=0.000,P=0.97)。綜上所述,DJ-1可能參與主動(dòng)脈夾層的病理生理過(guò)程。

    圖3 DJ-1 mRNA在主動(dòng)脈夾層(n=13)和正常主動(dòng)脈壁(n=11)中的表達(dá)

    3 討論

    主動(dòng)脈夾層的形成是一個(gè)多重機(jī)制參與的過(guò)程[5],如炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)降解和平滑肌細(xì)胞凋亡等。其中,氧化應(yīng)激可致主動(dòng)脈壁中層退化,導(dǎo)致管腔變薄,在主動(dòng)脈夾層的形成中具有重要作用。研究表明,在主動(dòng)脈夾層患者樣本中,超氧化物歧化酶的表達(dá)較正常組低50%,而脂質(zhì)過(guò)氧化物卻顯著升高[6],提示氧化應(yīng)激的增強(qiáng)是夾層發(fā)生的重要誘因。缺氧所導(dǎo)致的缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)和E26轉(zhuǎn)錄因子-1(E26 transformation specific-1,Ets-1)上調(diào)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2和MMP-9表達(dá)增加,最終加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及動(dòng)脈瘤的形成[7]。由此可見(jiàn),氧化應(yīng)激相關(guān)調(diào)控蛋白在夾層的病理生理過(guò)程中具有重要作用。隨著研究深入,DJ-1在多種組織和器官的功能逐漸被闡明,均提示該分子在氧化應(yīng)激中發(fā)揮調(diào)控作用。在小鼠Neuroa神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),DJ-1下調(diào)可增強(qiáng)由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8],提示其保護(hù)作用。在機(jī)制上,DJ-1通過(guò)調(diào)節(jié)硫氧還蛋白/凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(thioredoxin/ASK1)復(fù)合體抑制過(guò)氧化氫所致的氧化應(yīng)激。此外,DJ-1可抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激中的關(guān)鍵分子核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 like 2,Nrf2)的泛素化和降解,并通過(guò)促進(jìn)入核,增強(qiáng)其與硫氧還蛋白1(thioredoxin-1,Trx1)啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件ARE的結(jié)合,發(fā)揮其抗氧化功能[9]。本研究顯示,DJ-1在主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈壁中的mRNA表達(dá)水平顯著低于正常組,提示DJ-1的下調(diào)可能減弱了機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力,進(jìn)而導(dǎo)致彈性纖維的斷裂,最終發(fā)生主動(dòng)脈夾層。

    血管平滑肌細(xì)胞作為主動(dòng)脈中層的重要組成成分,在維持血管張力和彈性中具有關(guān)鍵作用。血管平滑肌細(xì)胞的增殖減少和凋亡增加也是主動(dòng)脈夾層的重要發(fā)病因素。研究顯示,Cu(Ⅱ)ATSM(一種缺氧敏感的正電子發(fā)射斷層顯像劑)通過(guò)激活Nrf2/DJ-1信號(hào)通路介導(dǎo)其在冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中的保護(hù)作用[10]。此研究證實(shí)DJ-1在平滑肌細(xì)胞上的抗氧化應(yīng)激作用,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果,進(jìn)一步提示該分子有可能對(duì)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用。不過(guò),DJ-1的表達(dá)量與主動(dòng)脈直徑無(wú)顯著相關(guān)性,提示其可能不參與主動(dòng)脈的病理變化過(guò)程,但與夾層的發(fā)生密切相關(guān)。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探究DJ-1在主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈壁中的表達(dá),提示其在主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用,為進(jìn)一步闡明主動(dòng)脈夾層的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。但對(duì)于DJ-1的調(diào)控機(jī)制,是否通過(guò)抗氧化應(yīng)激功能發(fā)揮其保護(hù)功能,還有待進(jìn)一步探討。隨著研究深入,DJ-1可能成為預(yù)防和治療主動(dòng)脈夾層的有效干預(yù)靶點(diǎn)。

    利益沖突:無(wú)

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