紫外誘變富集培養(yǎng)獲得那西肽高產(chǎn)菌株試驗

張善飛 王振華 梁景樂

（山東勝利生物工程有限公司 272000）

那西肽是活躍鏈霉菌（Streptomyces actuosus）產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,與硫鏈絲菌素(Thiostrepton)、鹽屋霉素(Siomycin)及硫肽霉素(Thiopeptin) 等抗生素結(jié)構(gòu)相似,均屬于含硫多肽類抗生素[1]。紫外線（UV）是一種最常用的物理誘變因素。紫外線輻射能引起DNA 鏈的斷裂、DNA 分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)等,但最主要的是使雙鏈之間或同一條鏈上兩個相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體,阻礙正常配對,從而引起突變[2]。富集培養(yǎng)亦稱增殖培養(yǎng)、加富培養(yǎng),是指利用不同微生物間生命活動特點(diǎn)的不同,人為地提供一些特定的環(huán)境條件,使其按照預(yù)定的方向生長[3]。通過前人的研究發(fā)現(xiàn),那西肽的骨架是由各種氨基酸構(gòu)成的,并且現(xiàn)在也基本摸清了那西肽的合成途徑[4],因此,通過氨基酸富集來提高那西肽的生產(chǎn)水平很有必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

那西肽產(chǎn)生菌：活躍鏈霉菌Streptomyces actuosus SL2020012,保存于勝利生物菌種中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

基本斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g,硝酸鉀1g,磷酸氫二鉀0.5g,硫酸鎂0.5g,氯化鈉0.5g,硫酸亞鐵0.01g,瓊脂20g,pH7.5,加水至1000ml,分裝完畢后121℃,滅菌20min,平鋪待用。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g,玉米漿20g,氯化鈉1g,硫酸銨5g,pH7.0,定容1L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉50g,葡萄糖20g,黃豆粉10g,硫酸銨5g,輕質(zhì)碳酸鈣3g,pH7.2,定容1L。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

用生理鹽水30ml 加入斜面試管,輕輕刮下孢子,移入裝有20ml0.05%Tween80 溶液和玻璃珠（15 個）的150ml 三角瓶中,振蕩15min 后,用過濾裝置（無菌濾紙+漏斗+50ml 三角瓶）收集濾液。

1.2.2 紫外誘變

提前30min 打開紫外燈,將5ml 孢子懸液置于滅過菌的4.5ml 的培養(yǎng)皿中,放置在磁力攪拌器上,開啟磁力攪拌器,打開皿蓋,邊照射邊攪拌,并計時,照射時間分別為0、30、60、90、120s,計算致死率。

1.2.3 氨基酸富集培養(yǎng)

將紫外誘變處理后的單孢子溶液涂布于各種0.1%氨基酸（色氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸）的斜面培養(yǎng)基上,28℃,培養(yǎng)168h,篩選高產(chǎn)變株。

1.2.4 高產(chǎn)菌株驗證

將篩選好的高產(chǎn)菌株,斜面培養(yǎng)成熟后,接種子瓶,轉(zhuǎn)發(fā)酵瓶,28℃培養(yǎng)168h,測定那西肽含量,那西肽含量利用HPLC 進(jìn)行檢測[5]。

2 結(jié)果

2.1 紫外線照射時間對出發(fā)菌株致死率的影響

由表1 可知,活躍鏈霉菌經(jīng)過紫外線照射,致死率隨著UV 照射時間的增加而提高。在0～110s 的UV 照射下,菌株的致死率為0%～100%。其中UV 誘變處理90s 時,平板上的存活的單菌落為61 個,與對照組（115 個菌落）相比,90s 時的致死率與以往前人所得的結(jié)論致死率在70%～85%的一致,所以該菌株最適的處理時間為90s。

表1 UV 照射時間對出發(fā)菌株致死率的影響

2.2 氨基酸富集培養(yǎng)后單菌情況

將誘變處理的孢子液涂布于含有氨基酸的平板,情況如表2。由表2 可知,3 種氨基酸對活躍鏈霉素的數(shù)量基本沒有太大影響,但對單菌大小影響較大。半胱氨酸單菌大小較對照提高10%。

表2 UV 誘變的氨基酸富集培養(yǎng)情況

2.3 高產(chǎn)菌株驗證情況

表3 高產(chǎn)菌株驗證情況

由表3 可知,對于效價半胱氨酸效果最好,提高24%。色氨酸提高10%,而蘇氨酸卻降低6%。

3 討論

本試驗利用紫外誘變和氨基酸富集培養(yǎng)能有效篩選出那西肽高產(chǎn)菌株。主要原因可能為那西肽的結(jié)構(gòu)是由氨基酸組成,另外,合成途徑中半胱氨酸是轉(zhuǎn)化為噻唑環(huán)的前體,而噻唑環(huán)是那西肽的重要組成部分。綜上,紫外誘變富集培養(yǎng)是獲得那西肽高產(chǎn)菌株的有效方法。