雞傳染性支氣管炎病毒分離與鑒定

荊麗珍 馮強 李寶華

（1，山東省海陽市畜牧獸醫(yī)站 265100；2，煙臺丹富仕飼料有限公司 264000；3，山東省農(nóng)廣校海陽市分校 265100）

雞傳染性支氣管炎是屬于病毒感染而引發(fā)的急性和高度傳染性疾病[1]。因為本病是病毒性疾病,一旦爆發(fā)無特效治療藥物,易繼發(fā)其他疾病繼續(xù)突變新菌株,使免疫雞和未免疫雞都能檢測出傳染性支氣管炎病毒[2]。因此,加強對禽類疾病防控中傳染性支氣管炎病毒研究具有重要意義。本試驗經(jīng)過發(fā)病肉雞的組織分離檢查、組織碾磨液注射雞胚盲傳,血凝實驗和熒光PCR 檢測等辨別鑒定手段來確定養(yǎng)雞場的疑似傳染性支氣管炎毒株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

病料取自某大型養(yǎng)雞場,經(jīng)過駐場獸醫(yī)初步診斷疑似雞傳染性支氣管炎的病雞肺臟、氣管、腎臟。

1.1.2 雞胚,雞紅細(xì)胞

用于檢測病毒血細(xì)胞凝集活性。

1.1.3 主要試劑

雞傳染性支氣管炎病毒實時熒光定量PCR 檢測試劑盒、PetNAD 核酸萃取試劑盒。

1.1.4 主要儀器

高壓鍋,DYY-11131A 型電泳槽,微型離心機,電熱恒溫培養(yǎng)箱,PCR 基因擴增儀,微型漩渦混合儀,臺式高速冷凍離心機,生物安全柜。

1.2 方法

對送檢病雞的病料的采集和處理提純組織上清液用移液槍注入無菌離心管中備用。通過病毒的增殖與純化及病毒的RTPCR 檢測確定毒株性質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病雞剖檢結(jié)果分析

在洗消室對送檢病雞剖檢對傳支易感肺、腎、氣管等器官剪開看有無栓塞和花斑腎。剖檢結(jié)果：病雞腎臟極度腫大,顏色蒼白,呈花呈花斑樣,在氣管、支氣管內(nèi)有淡黃色黏液性滲出物,個別病雞有黃色干酪樣栓子,氣囊渾濁、腎臟極度腫脹、顏色蒼白,有尿酸鹽沉積呈花斑樣,符合IBV 的臨床特征。

2.2 病毒RT-PCR 檢測結(jié)果分析

病料核酸檢測結(jié)果曲線接近IBV 陽性對照曲線,病毒CT值接近陽性對照,其中4 號樣品CT 值小于陽性對照,毒力最強,其余檢測項目病毒均為陰性,確定該病是由傳染性支氣管炎病毒感染造成。

2.3 傳代雞胚尿囊液的血凝檢測結(jié)果分析

1%雞血紅細(xì)胞與收取每代雞胚尿囊液做血凝實驗,反應(yīng)均呈陰性,每代雞胚尿囊液均不能使雞外周血紅細(xì)胞發(fā)生凝集。這表明雞胚尿囊液中不含有其他能使雞外周血紅細(xì)胞凝集的病毒。

2.4 傳代雞胚尿囊液的熒光PCR 檢測結(jié)果分析

尿囊液PCR 檢測結(jié)果顯示IBV 陽性,其余能檢測到其他病毒均為陰性,診斷該病造成的感染由雞傳染性支氣管炎病毒所至[3]。

2.5 雞胚病變情況

病料除菌接種雞胚后,24h 內(nèi)無雞胚死亡。存活的雞胚病變情況表現(xiàn)為雞胚大腿及尾部有點狀出血,有的呈彌漫性出血；胎兒生長阻滯、蜷縮、皮膚出血點明顯等。對照胚無肉眼可見病變。有的雞胚羊膜增厚,緊貼雞胚,部分雞胚腎小管、輸尿管有白色尿酸鹽沉著,尿囊液中有白色的尿酸鹽結(jié)晶。卷曲胚胎是IBV 感染雞胚胎的特征性癥狀。確定其為傳染性支氣管炎病毒引起的感染[4]。

綜上所述：本試驗通過完整系統(tǒng)的檢測,從駐場獸醫(yī)的初步對病雞的飲食,生理狀況及病雞形態(tài)外觀的變化初步做出診斷,及時送至實驗室進一步檢查,到對病雞的實驗室診斷嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致,符合國際標(biāo)準(zhǔn)。創(chuàng)新的核酸提取方法不僅高效而且省錢,為養(yǎng)殖業(yè)的疫病檢查推廣提供了很好的借鑒方法,能有效加強疫病的機制更快更準(zhǔn)確地診斷出病原,消除疾病并降低檢查成本。

3 討論與小結(jié)

分離毒株的有雞傳染性支氣管炎病癥,如呼吸道癥狀和“斑點腎”。病毒稀釋液接種SPF 雞蛋胚體表現(xiàn)為長發(fā)育障礙、胚胎彌漫性出血和典型的卷曲胚胎[5]。對IBV 傳代雞胚尿囊液的血凝活性測定未檢出病毒的血凝活性。提示尿囊液中無陽性黏附和副粘病毒。通過收集到的雞胚尿囊液用熒光PCR 定量檢測除測到傳染性支氣管炎病毒外其他檢測項目均為陰性[6]。

根據(jù)臨床癥狀、病理變化及雞胚特點,本次分離出的禽傳染性支氣管炎病毒為雞傳染性支氣管炎病毒。