金屬抗菌機(jī)理的研究進(jìn)展

孫曉萱，高建新，李 杭，李運(yùn)剛

(華北理工大學(xué) 冶金與能源學(xué)院，河北 唐山 063210)

0 引 言

現(xiàn)代生活中，人們不得不時(shí)刻面臨著微生物的困擾，盡管人們可以通過(guò)微生物的有益性進(jìn)行釀造、細(xì)菌發(fā)電等，但是其有害性更是時(shí)刻威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明：1995年由于細(xì)菌感染造成的死亡人數(shù)為1 700萬(wàn)人，2003年的SARS病毒、2004年在日本、韓國(guó)出現(xiàn)的禽流感、在歐洲出現(xiàn)的“瘋牛病”[1-2]以及2020年在湖北武漢剛剛爆發(fā)的新型冠狀病毒給全球帶來(lái)了恐慌，也帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)面影響。抑制和消滅有害細(xì)菌成為了重要的研究課題，具有廣闊的應(yīng)用前景和指導(dǎo)意義?？咕牧鲜蔷邆錃⑺阑蛞种朴泻?xì)菌能力的功能材料，它是受加入抗菌劑的影響?？咕鷦┛煞譃闊o(wú)機(jī)抗菌劑、有機(jī)抗菌劑和天然抗菌劑三種類型。由于有機(jī)抗菌劑具有耐熱性差、毒性大以及易產(chǎn)生耐藥性等問題，一直得不到人們的重視。天然抗菌劑因來(lái)源有限也得不到廣泛的應(yīng)用。無(wú)機(jī)抗菌劑主要是金屬類抗菌劑，由于金屬抗菌具有廣譜抗菌且抗菌性能優(yōu)良、不產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)而受到人們的青睞，并成為目前研究的主要方向?？咕讳P鋼就是指在不銹鋼材料當(dāng)中添加抗菌金屬元素并進(jìn)行一定的工藝處理，使其具備抗菌的能力。它具有良好的耐磨、耐蝕、抗菌及力學(xué)性能，可以應(yīng)用于食品餐具，醫(yī)療器械等各行各業(yè)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前醫(yī)學(xué)的研究方向?yàn)榘邢蛐匝芯?，即研究材料為目的性服?wù)，只有更好的了解金屬的抗菌機(jī)理，我們才能正確的選擇抗菌材料。

1 國(guó)內(nèi)外抗菌金屬的研究進(jìn)展

金屬離子對(duì)細(xì)菌具有良好的抑制和殺滅效果，并且有些金屬離子對(duì)人體不會(huì)有其他的危害性。普遍認(rèn)為金屬離子抗菌性的優(yōu)良排序：Ag+>Co2+≥Ni2+≥Al3+≥Zn2+≥Cu3+=Fe3+>Mn2+≥Sn2+≥Ba2+≥Mg2+≥Ca2+[3-4]。從生物學(xué)性能角度分析，有些金屬生物性能良好，對(duì)人體有很好的兼容性，人體對(duì)這些元素形成的合金并不排斥，對(duì)身體亦無(wú)害處，但其并不具備抗菌的能力，比如鈷基金，鈦基金，這些金屬都是用于替代人體骨骼的金屬元素，在醫(yī)療器具層面有較廣泛的應(yīng)用，目前有團(tuán)隊(duì)在研制含有抗菌元素的鈷基金和鈦基金，并準(zhǔn)備在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行實(shí)踐實(shí)驗(yàn)[5-6]。還有一些金屬雖然抗菌能力較強(qiáng)，但毒性較大比如汞。汞有較大的毒性，雖然能夠殺死細(xì)菌，但對(duì)人體的傷害也比較大，并不適合用于生活中。

抗菌金屬的使用已有悠久的歷史，在很早之前人們已經(jīng)懂得使用金屬制作的器具更加安全，比如使用銅制作的器皿，用銀制作筷子等等。20世紀(jì)90年代，日本首次研制出具有抗菌性的鐵素體、奧氏體和馬氏體系的抗菌不銹鋼。它是在傳統(tǒng)鋼的基礎(chǔ)上添加了0.5%～1.0% Cu，再經(jīng)特殊熱處理，使Cu離子溶出并均勻分布在不銹鋼內(nèi)部及表面，其抗菌效果顯著。隨后，日本川崎公司研發(fā)了向不銹鋼中添加銀的方法，成功生產(chǎn)了含銀抗菌不銹鋼，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有優(yōu)良的抗菌效果。其化學(xué)成分如表1所示[7-8]。

表1 日本川崎含銀抗菌不銹鋼的化學(xué)成分

雖然我國(guó)對(duì)抗菌金屬的研究起步較晚，但在抗菌不銹鋼的研發(fā)應(yīng)用上發(fā)展迅猛，近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，在金屬抗菌領(lǐng)域也取得了重大的突破。

中國(guó)科學(xué)院金屬研究所采用真空感應(yīng)爐成功冶煉含銅抗菌不銹鋼，以0Cr18Ni9和0Cr17不銹鋼為基體，分別添加3.8%和1.8%的銅，采用覆膜法評(píng)估了抗菌不銹鋼的殺菌能力，研究結(jié)果表明，抗菌不銹鋼對(duì)革蘭氏陰性菌的殺滅作用會(huì)更大，其殺菌率在99.9%以上[9]。

向紅亮[10]等對(duì)含Ag的抗菌雙相不銹鋼進(jìn)行了研究，通過(guò)添加純Ag和Cu-Ag合金的方法，采用中頻感應(yīng)爐進(jìn)行熔煉制備，對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌率達(dá)到99%以上。抗菌不銹鋼的化學(xué)成分如表2所示。

表2 抗菌雙相不銹鋼的化學(xué)成分

隨著研究的不斷深入，抗菌不銹鋼逐漸應(yīng)用到各行各業(yè)當(dāng)中。由于不同的抗菌材料對(duì)細(xì)菌的抗菌性能和抑菌范圍都不同，因此，想要開發(fā)出有針對(duì)性的、高效的抗菌材料，對(duì)金屬抗菌機(jī)理的研究十分重要。

2 金屬元素抗菌材料的抗菌機(jī)理

每一種抗菌金屬元素都有其特殊的抗菌機(jī)理，有的甚至同時(shí)兼有多種抗菌機(jī)理，在不同的環(huán)境影響下，選擇相應(yīng)的方式來(lái)抑菌。本文綜述了離子型、降解型、替代型以及氧化型幾種常見的金屬抗菌機(jī)理，對(duì)此方向的發(fā)展做了鋪墊。

2.1 離子型抗菌

離子型抗菌是目前研究較多，并且應(yīng)用比較廣泛的一類抗菌形式， 它可以通過(guò)正負(fù)電荷相互吸引與細(xì)菌緊密接觸，也可以通過(guò)離子溶出進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)等多種方式進(jìn)行殺菌，銅和銀是應(yīng)用較為廣泛的抗菌金屬，屬于典型的離子型抗菌。

2.1.1 銅的抗菌機(jī)理

陳四紅[11]等在鐵素體和奧氏體不銹鋼中分別加入了1.8%～2.0%和3.0%～3.6%Cu，抗菌處理后制成40mm的板材進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示出優(yōu)異的抗菌性能，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率均在99.0%以上。并根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)銅的抗菌機(jī)理做了幾種假設(shè)[12-18]：

(1)利用電場(chǎng)吸附的作用進(jìn)行殺菌。含銅抗菌不銹鋼在冶煉過(guò)程中通過(guò)抗菌熱處理，使Cu離子均勻分布在不銹鋼內(nèi)部及表面，當(dāng)與細(xì)菌接觸時(shí)，帶正電荷的銅離子與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜在異性電荷相互吸引的作用下緊緊吸附在一起，使細(xì)菌的活動(dòng)受到了約束，呼吸受到了阻礙，生存環(huán)境也發(fā)生了改變，阻礙了細(xì)菌的生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致死亡。

(2)直接殺菌。與細(xì)菌接觸時(shí)，銅離子穿透細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)菌蛋白質(zhì)的巰基發(fā)生反應(yīng)，從而使得細(xì)菌的蛋白質(zhì)凝固，酶失去活性，DNA合成受到約束，進(jìn)而使其喪失增殖能力，此外，蛋白質(zhì)凝固還影響細(xì)菌內(nèi)部物質(zhì)傳輸和電子傳輸，最終起到殺菌的作用。

(3)破壞酶系統(tǒng)殺菌。銅離子與細(xì)菌接觸時(shí)還可以破壞細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部酶運(yùn)輸系統(tǒng)，使得細(xì)菌固有成分喪失活性進(jìn)一步引起功能紊亂，導(dǎo)致菌體繁殖能力下降或新陳代謝受到阻礙，從而造成細(xì)菌的死亡。

(4)催化作用殺菌。不銹鋼表面的銅離子可以起到催化作用，它能夠吸收周圍環(huán)境中的能量并與氧反應(yīng)生成·OH和O2-，·OH和O2-可以讓細(xì)菌的增殖能力下降，進(jìn)而達(dá)到抑菌的效果。

雖然含銅抗菌不銹鋼具有較高的殺菌率，但在制備過(guò)程中，需要經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的抗菌熱處理，待析出足夠的富Cu相時(shí)才會(huì)顯示出抗菌的特性。銅離子溶出機(jī)理如圖1所示。

圖1 抗菌不銹鋼銅離子析出機(jī)理Fig 1 Copper ion precipitation mechanism of antibacterial stainless steel

2.1.2 銀的抗菌機(jī)理

與銅相比，銀的抗菌性要高出許多，添加少量的銀就可以大大提高不銹鋼的抗菌性能，并且加入銀對(duì)不銹鋼的加工性能和力學(xué)性能基本沒有影響。軒陽(yáng)[19]對(duì)含銀不銹鋼中富銀相的析出行為進(jìn)行了研究，在304奧氏體不銹鋼中添加了0.27%Ag，經(jīng)抗菌熱處理后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡和X射線衍射儀對(duì)其進(jìn)行了觀察，結(jié)果得到了優(yōu)異的抗菌效果。銀離子抗菌劑作用機(jī)理有以下幾個(gè)方面[20-22]：

(1)阻礙細(xì)胞壁的合成。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁重要組分，銀離子對(duì)細(xì)胞壁的合成有阻礙作用，主要抑制多糖鏈與四肽之間的連接，從而使細(xì)胞壁喪失了完整性，滲透壓的保護(hù)作用減退，最終由于菌體損傷而死亡。

(2)對(duì)細(xì)胞膜造成損傷。細(xì)胞膜是細(xì)菌細(xì)胞生命活動(dòng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，起著重要作用。因此，若細(xì)胞膜受到損傷、破裂，將直接導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。

(3)對(duì)蛋白質(zhì)的合成有著抑制作用。干擾DNA的正常生物合成過(guò)程，使合成的核酸失去功能。

目前，含銀抗菌材料仍存在一些問題，由于銀的晶格結(jié)構(gòu)與金屬相差較大，不管采用何種方式添加都很難將其固溶到基體中，進(jìn)而導(dǎo)致晶界偏析，分布不均[23]。

2.2 降解型抗菌

隨著研究的不斷深入，純鎂及鎂合金也逐步走入了研究者的視線，Robinson[24]等證實(shí)了鎂對(duì)細(xì)菌存在殺滅作用，并且認(rèn)為其抗菌環(huán)境似乎為堿性。此外，中國(guó)科學(xué)院金屬研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)鎂基金屬的殺菌作用作了進(jìn)一步的研究，證實(shí)了鎂基金屬的殺菌不同于銅銀和鋅，它不是依靠離子的作用，鎂基金屬殺菌是因?yàn)樵谌梭w或環(huán)境中進(jìn)行自身降解，降解過(guò)程中影響了整個(gè)環(huán)境，使得環(huán)境堿度大幅提升，即PH值大幅增大，影響細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境，從而達(dá)到殺菌的作用[25-26]。

可降解鎂因其良好的抗菌性能，已逐漸應(yīng)用到外科手術(shù)中，但由于降解速度過(guò)快可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌感染，并且對(duì)生物相容性有不利影響，限制了其在臨床上的發(fā)展[27]。

2.3 替代型抗菌

所謂替代型抗菌是基于金屬離子結(jié)構(gòu)的相似性，細(xì)菌對(duì)抗菌元素和自身必需的營(yíng)養(yǎng)元素發(fā)生混淆，致使抗菌元素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)替代了營(yíng)養(yǎng)元素，損傷了蛋白質(zhì)和酶，改變了細(xì)菌的生存環(huán)境，從而顯示出殺菌的效果。

2.3.1 鎵的抗菌機(jī)理

呂毅華[28]等在研究金屬抗菌時(shí)認(rèn)為金屬鎵也具有抗菌性，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較好的抗菌效果。其中大腸桿菌更容易被鎵元素?fù)p傷，可能是因?yàn)楦锾m氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁較厚，鎵離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的通道受阻，抗菌效果稍差。并且鎵離子已通過(guò)FDA認(rèn)證，具有安全性，可應(yīng)用于臨床。

馬超[29]對(duì)鎵離子的抗菌機(jī)理進(jìn)行了研究，采用硝酸鎵為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將銅綠假單胞菌與鐵離子、鎵離子置于培養(yǎng)皿中，檢測(cè)菌體中鐵離子含量的變化，發(fā)現(xiàn)隨著鎵離子濃度的增大，菌體中鐵離子含量越來(lái)越少，證實(shí)了鎵的抗菌機(jī)理：鐵元素能給細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)，也是參與代謝關(guān)鍵酶的重要組成部分，鐵能加劇病原菌的感染狀況。細(xì)菌若離開了鐵元素的支持，其生長(zhǎng)繁殖將會(huì)受到阻礙。由于鎵離子和鐵離子的離子半徑極為相似，使生物體不能準(zhǔn)確的判斷出鎵和鐵，外源性的鎵進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)代替鐵參與必要的蛋白質(zhì)和酶而干擾鐵代謝，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞造成多種不利影響，從而起到殺菌的作用。

鎵可用于臨床，但值得注意的是，長(zhǎng)時(shí)間使用鎵會(huì)影響宿主的免疫系統(tǒng)。并且鎵在發(fā)揮抗菌作用時(shí)，對(duì)周圍的環(huán)境要求很高，培養(yǎng)基成分、鐵含量和PH等都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3.2 鈰的抗菌機(jī)理

敬和民[30]等在00Cr18Ni9不銹鋼的基礎(chǔ)上添加了0～5%鈰元素，采用真空感應(yīng)爐煉制了含鈰抗菌不銹鋼，并對(duì)鈰的添加量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明在不銹鋼中添加0.11%含量的鈰便可取得優(yōu)異的抗菌性能，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率達(dá)到了98.9%。此外內(nèi)蒙古科技大學(xué)也在做此研究，均證實(shí)了金屬鈰的抗菌性能，并對(duì)抗菌機(jī)理進(jìn)行了探討，認(rèn)為鈰在離子狀態(tài)下，與細(xì)菌結(jié)合，替代細(xì)菌里的鈣，從而破壞了細(xì)菌的結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到殺死細(xì)菌的目的[31-33]。

含鈰抗菌不銹鋼在制備時(shí)不用經(jīng)過(guò)時(shí)效處理就可以獲得良好的抗菌性能，工藝手段較為簡(jiǎn)便。但稀土鈰在低濃度時(shí)反而會(huì)刺激細(xì)菌的生長(zhǎng)，濃度過(guò)高時(shí)可能會(huì)損壞不銹鋼的其他性能，在用量上值得深入研究。

2.4 氧化型抗菌

有些金屬本身不具備抗菌性能或是抗菌能力稍差，但其金屬氧化物在特定的環(huán)境下卻擁有較強(qiáng)的抗菌能力，比如氧化鋅、氧化鈦等，在光照的條件下會(huì)發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，從而達(dá)到殺菌的目的。

2.4.1 氧化鈦的抗菌機(jī)理

遲廣俊[34]對(duì)氧化鈦的抗菌機(jī)理做了研究，用電沉積的方法，以SUS304不銹鋼為基體，制備了Ni/TiO2抗菌復(fù)合鍍層，通過(guò)添加不同含量的TiO2做出了對(duì)比試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論有無(wú)光照，SUS304不銹鋼均無(wú)抗菌能力，Ni鍍層在光照前后也沒有明顯的抗菌行為，而Ni/TiO2在光照后顯示出極高的抗菌率，尤其是當(dāng)TiO2含量達(dá)到21.98%時(shí)，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率均大于95%?；究梢源_認(rèn)氧化鈦是利用光催化機(jī)理進(jìn)行殺菌的。氧化鈦被一定能量的光子激發(fā)時(shí)分別產(chǎn)生電子(e-)和空穴(h+)。電子(e-)與空氣中的氧原子反應(yīng)生成超氧離子自由基(-O2-)，空穴(h+)與水分子經(jīng)過(guò)離子反應(yīng)之后生成羥基自由基(-OH)。自由基能夠與構(gòu)成為生物機(jī)體的有機(jī)物發(fā)生反應(yīng)將其直接氧化成CO2,H2O等無(wú)機(jī)物，改變有機(jī)物的原有狀態(tài)和性質(zhì)，從而阻礙了微生物細(xì)胞的繁殖，抑制了細(xì)菌的滋生，起到了抗菌和殺菌的作用[35]。

綜上所述，氧化鈦抗菌具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但也有不足之處，主要就是在無(wú)光的條件下無(wú)法發(fā)揮其抗菌作用，并且在弱光環(huán)境中，抗菌能力較差。二氧化鈦電子、空穴的產(chǎn)生如圖2所示。

圖2 光照條件下二氧化鈦電子、空穴的產(chǎn)生Fig 2 Generation of titanium dioxide electrons and holes under illumination conditions

2.4.2 氧化鋅的抗菌機(jī)理

段惺[36]在對(duì)氧化鋅的抗菌性能進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，稱取0.1 g氧化鋅粉末制成10 mm的圓形試樣放在培養(yǎng)皿中，滴入108 cfu/mL菌懸液，在有無(wú)光照兩種環(huán)境中進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，在無(wú)光條件下，氧化鋅對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為2.87，光照條件下為5.20，氧化鋅光照條件下的抗菌性能明顯比無(wú)光照時(shí)要好。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為氧化鋅的抗菌機(jī)理主要是由于氧化鋅在受光子激發(fā)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生許多強(qiáng)氧化物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)與細(xì)菌發(fā)生一系列氧化還原反應(yīng)，殺死細(xì)菌。

此外，關(guān)于氧化鋅是否存在有毒性的問題，還沒有統(tǒng)一的論證，有待進(jìn)一步的研究，解決安全性的問題，氧化鋅將有更好的發(fā)展前景[37]。

3 金屬抗菌材料存在的問題

(1)目前大部分實(shí)驗(yàn)都集中在單一金屬進(jìn)行抗菌的研究，其抗菌能力還有待提高。改進(jìn)方法：同時(shí)添加多種抗菌金屬元素。張寒霜[20]研究了同時(shí)添加銅和銀的不銹鋼的抗菌性能，結(jié)果表明，銅作為載體協(xié)助銀穿過(guò)鈍化膜，二者配合可顯著提高抗菌率，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率均在99%以上。

(2)金屬離子(如銅、銀等)在發(fā)揮抗菌作用時(shí)析出速度過(guò)快，會(huì)大大縮短抗菌材料的使用壽命，控制析出速度尤為重要，緩釋技術(shù)作為一種新興技術(shù)可有效解決這個(gè)問題。俞波[38]對(duì)抗菌沸石的制備進(jìn)行了研究，以13X沸石作為載體，分別載入銅、銀、鋅3種金屬離子，將沸石置于水中浸泡，直到第40次換水時(shí)，Ag+、Cu2+、Zn2+濃度仍然保持在0.01～0.08 ppm之間，證實(shí)了抗菌沸石可長(zhǎng)時(shí)間緩慢釋放金屬離子，達(dá)到長(zhǎng)期抗菌的效果。

(3)金屬離子化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生變色、抗菌性能變差等問題，比如銀。改進(jìn)方法：控制載體微孔尺寸或使用可與金屬離子形成穩(wěn)定螯合物的材料可以使銀離子更加穩(wěn)定而減少變色的機(jī)會(huì)[39]。

(4)隨著人們思想水平的提高，環(huán)境保護(hù)受到很大的重視，金屬抗菌劑的使用殘留對(duì)環(huán)境的影響不容小覷。

隨著研究的不斷深入，金屬離子抗菌劑在應(yīng)用中出現(xiàn)的這些問題定會(huì)得到改善，從而不斷提高人們的生活質(zhì)量和衛(wèi)生水平。

4 結(jié) 語(yǔ)

對(duì)于抗菌金屬材料的發(fā)展，一方面是向普適性的廣泛抗菌經(jīng)濟(jì)型材料的發(fā)展，另一方面，從醫(yī)學(xué)的思考角度，是進(jìn)行“多靶點(diǎn)毒素”的研究，對(duì)病毒非常具有針對(duì)性，作為醫(yī)用材料的抗菌產(chǎn)品，精準(zhǔn)型有針對(duì)性的特殊材料的研究也將是抗菌材料的相對(duì)重要的發(fā)展方向。由于抗菌材料的研究時(shí)間尚短，還沒有在此方向上進(jìn)行研究，本篇論文對(duì)抗菌材料機(jī)理進(jìn)行了總結(jié)。

目前，離子型抗菌是應(yīng)用最為廣泛的抗菌形式，相比容易造成細(xì)菌感染的降解型抗菌和有局限性的氧化型抗菌，有著更好的發(fā)展前景。銅、銀屬于典型的離子型抗菌，并有著多種抗菌方式，但具體是哪種抗菌方式占據(jù)主導(dǎo)位置還需進(jìn)一步的研究。此外，一些稀土元素通過(guò)替代相似結(jié)構(gòu)的金屬元素也展現(xiàn)了良好的抗菌性能，但在發(fā)揮其抗菌作用的同時(shí)，是否會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染以及是否讓細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等一系列的問題還尚未解決。隨著研究的不斷深入，可以預(yù)見，有更多的抗菌元素將被挖掘出來(lái)。降低材料成本，提高抗菌性能，擴(kuò)大材料的應(yīng)用范圍等一系列的問題是今后需要努力研究的課題。