合成生物學(xué)在含氟化合物生產(chǎn)中的應(yīng)用

王高麗，金雪芮，羅云孜，2

（1天津大學(xué)化工學(xué)院，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，天津300072；2天津大學(xué)化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300072）

含鹵素有機(jī)化合物的種類豐富，在醫(yī)藥、化工以及材料等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用［1］。氟元素在地殼中的含量位于第13位，是含量最高的鹵素。但由于氟元素電負(fù)性極強(qiáng)，極易失去電子形成氟負(fù)離子，從而難以形成有機(jī)化合物，因此天然含氟化合物的含量很少。1986年從非洲一種二瓣草屬植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了含氟產(chǎn)物，為具有毒性的單取代氟乙酸，這是已報(bào)道的最早發(fā)現(xiàn)的天然氟化物［2］。由于氟原子極強(qiáng)的電負(fù)性，C—F鍵高度極化不易斷裂，通過在一些藥物分子上引入氟原子，能夠改善其藥物化學(xué)性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)其藥物構(gòu)型的改變，提高其藥物代謝穩(wěn)定性以及與目標(biāo)蛋白的親和力等［3］，故有機(jī)氟化物在醫(yī)藥方面有重要的應(yīng)用潛力。例如天然灰黃霉素是一種真菌代謝物，具有抗真菌的作用，利用親氟試劑引入氟原子，不同的氟取代產(chǎn)物展現(xiàn)出了不同的活性，甚至有部分取代物展現(xiàn)出抗癌活性。依澤替米貝是一種含氟降血脂藥，能夠抑制膽固醇的吸收。藥物分子上兩個(gè)氟原子的取代分別阻斷了兩個(gè)代謝不穩(wěn)定位點(diǎn)，防止苯環(huán)氧化成苯酚以及甲氧基脫烷，提高了藥物的代謝穩(wěn)定性［4］。目前常用的有機(jī)氟化物的合成方法為化學(xué)法，以重金屬及重金屬氧化物為催化劑，在無水極性介質(zhì)中進(jìn)行氟化反應(yīng)，反應(yīng)條件較為苛刻，能耗高，且重金屬催化劑對(duì)環(huán)境有一定的危害［5］，同時(shí)由于氟原子極強(qiáng)的電負(fù)性，反應(yīng)的選擇性往往難以控制，產(chǎn)物的收率也往往較低。因此發(fā)展有高選擇性的綠色生物氟化反應(yīng)具有重要意義。

合成生物學(xué)是依照化學(xué)、生物、物理學(xué)家等所闡述的規(guī)則，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行定向設(shè)計(jì)，從而構(gòu)建出符合人們要求的生物合成系統(tǒng)［6］。合成生物學(xué)技術(shù)涵蓋了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)工程、代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)等一系列學(xué)科的研究方法。隨著合成工具、分析工具、模型構(gòu)建工具的發(fā)展，合成生物學(xué)在重要化合物生物合成系統(tǒng)的構(gòu)建和優(yōu)化等方面有了很大的進(jìn)展［7-12］，主要體現(xiàn)如下。①利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)通過理性設(shè)計(jì)與定向進(jìn)化對(duì)酶進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造，使其高效催化指定的反應(yīng)［13-15］。例如P450單氧化酶能夠催化1，8-桉樹酚羥基化轉(zhuǎn)化為2-β-羥基-1，8-桉樹酚，通過定向進(jìn)化對(duì)P450單氧化酶進(jìn)行改造，產(chǎn)生的突變體的酶活提高到原來的3.8倍［16］；又如Baker等［17］通過計(jì)算機(jī)算法設(shè)計(jì)蛋白，實(shí)現(xiàn)了對(duì)超大分子量雙組分的二十面體蛋白的精確設(shè)計(jì)和組裝；通過分析宏基因組數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白相互作用的預(yù)測，為人工定向設(shè)計(jì)改造蛋白提供了新思路［18-20］。②通過設(shè)計(jì)優(yōu)化天然產(chǎn)物生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成［21-23］。例如通過改變細(xì)胞內(nèi)初級(jí)代謝積累的三酰甘油的碳流向，提高了鏈霉菌中多種聚酮化合物的產(chǎn)量［24］。③利用合成生物學(xué)策略，挖掘并激活沉默基因簇［25-27］。例如通過“即插即用”的合成生物學(xué)策略，激活了鏈霉菌中能夠合成一種大環(huán)內(nèi)酰胺的基因簇，并得到了具有不同結(jié)構(gòu)的新型大環(huán)內(nèi)酰胺化合物［28］。

天然含氟化合物的含量很少，目前僅在幾種微生物中發(fā)現(xiàn)了一類能夠催化形成C—F鍵的氟化酶［29-32］。這些酶具有高度相似性。氟化酶的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了合成生物學(xué)在生物合成氟化物方面的研究。目前已有相關(guān)研究將合成生物學(xué)策略應(yīng)用到氟化物的生物合成中，并取得了一定的成效。例如通過對(duì)基因組進(jìn)行分析，挖掘出微生物基因組中潛在的氟化酶合成基因［29］，再利用蛋白質(zhì)工程對(duì)現(xiàn)有氟化酶進(jìn)行改造，提高了氟化酶的催化效率和穩(wěn)定性［30］。利用合成生物學(xué)模塊化的思維，構(gòu)建含氟模塊并將其引入到鏈霉菌中聚酮類天然產(chǎn)物的生物合成途徑中，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜有機(jī)氟化物的合成［31］。另外，通過改變宿主菌代謝途徑中的碳流向來提高氟化物的生物合成產(chǎn)量，也是未來合成生物學(xué)應(yīng)用于含氟化合物生產(chǎn)的研究方向之一。本文圍繞氟化酶討論了對(duì)天然氟化酶的改造措施以及改造后的酶在含氟化合物合成中的應(yīng)用，也介紹了通過引入含氟模塊實(shí)現(xiàn)含氟化合物生物合成系統(tǒng)構(gòu)建的策略（圖1）。

1 氟化酶的研究與應(yīng)用

目前天然氟化酶的來源很少，且存在穩(wěn)定性低、催化效率不高等問題。下面對(duì)目前已知的不同來源的氟化酶進(jìn)行了總結(jié)，并介紹了一些能夠有效提高氟化酶的穩(wěn)定性和催化效率的優(yōu)化策略。

圖1 氟化酶及生物合成系統(tǒng)在生產(chǎn)含氟化合物中的應(yīng)用Fig.1 Applications of fluorinase and biosynthesis systems in the production of fluorinated compounds

1.1 從微生物中挖掘天然氟化酶

微生物是生物合成重要化合物的“細(xì)胞工廠”。多種酶促反應(yīng)組成的復(fù)雜代謝通路網(wǎng)絡(luò)作為“細(xì)胞工廠”的“生產(chǎn)線”，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的合成。酶在生物合成中起著關(guān)鍵作用。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)工程等學(xué)科的發(fā)展，人們對(duì)于酶的本質(zhì)和功能有了更深入的了解。天然氟化物在自然界中的含量很少，目前僅在幾種放線菌中發(fā)現(xiàn)了天然氟化物的存在，進(jìn)一步研究表明這幾種放線菌中均含有相似度極高的一類氟化酶，能夠催化無機(jī)氟離子與S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）反應(yīng)，生成5'-氟-5'-脫氧腺苷（5'-FDA）（圖2）。下面對(duì)目前研究已發(fā)現(xiàn)的氟化酶及其催化機(jī)理進(jìn)行簡單的歸納。

圖2 天然氟化酶催化的氟化反應(yīng)[31,33]Fig.2 Fluorination reaction catalyzed by natural fluorinase[31,33]

Streptomyces cattleya最初用于生物合成抗生素沙納霉素。發(fā)酵過程中，當(dāng)反應(yīng)底物中含有氟（無機(jī)氟或有機(jī)氟）時(shí)，則生成了一種新的含氟化合物，為沙納霉素的類似物，后被鑒定為4-氟蘇氨酸（4-FT）的立體異構(gòu)體。在同樣的培養(yǎng)條件下，從該菌株的發(fā)酵液中又發(fā)現(xiàn)了氟乙酸［33］，體現(xiàn)出其合成含氟天然產(chǎn)物的潛力，這也是第一次發(fā)現(xiàn)能夠合成天然氟化物的微生物。2012年，O'Hagan等［34-36］在S.cattleyaDSM46488中確定了氟乙酸和4-氟蘇氨酸的體內(nèi)生物解析，鑒定了生成這兩種氟化物每一步代謝反應(yīng)所需的酶。氟化物生物合成途徑第一步是通過氟化酶（FlA）引入氟原子，這一步在整個(gè)合成途徑中起關(guān)鍵作用。在這一步反應(yīng)中，氟化酶催化氟離子對(duì)SAM發(fā)生親核進(jìn)攻，生成5'-FDA。繼而腺苷磷酸化酶（PNP）催化親核磷酸進(jìn)攻，脫去5'-FDA的腺苷堿基，生成5-氟-5-脫氧-D-核糖-1-磷酸（5-FDRA），下一步酶催化開環(huán)異構(gòu)反應(yīng)將5-FDRA轉(zhuǎn)化為5-氟-5-脫氧-核酮糖-1-磷酸（5-FDRulP），再經(jīng)酶催化醛縮反應(yīng)的逆反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氟乙醛。合成氟乙酸和4-FT的生物途徑中都具有以上4步酶促反應(yīng)，從第5步酶促反應(yīng)開始出現(xiàn)分支。氟乙醛在乙醛脫氫酶的作用下生成氟乙酸，在乙醛轉(zhuǎn)醛酶作用下轉(zhuǎn)化為4-FT（圖3）。研究同時(shí)在體外將氟化酶與氟離子和SAM混合，并在反應(yīng)體系中檢測到5'-FDA的生成，驗(yàn)證了氟化酶催化C—F鍵形成的能力［35］。

通過全基因組分析，從鏈霉菌Streptomycessp.MA37［36］、諾卡菌Nocardia brasiliensis［29］、放線菌Actinoplanessp.N902-109［37-38］、海洋微生物Streptomyces xinghaiensisNRRL B24674［38-39］以及最新發(fā)現(xiàn)的嗜鹽放線菌Actinopolyspora mzabensis［40-41］的基因組中分別發(fā)現(xiàn)了與flA基因高度相似的氟化酶基因，相似度分別為87%、81%、80%、84%以及79%，分別編碼氟化酶FlA1、FlA2、FlA3、FlA4以及Am-FlA。這幾種氟化酶的氨基酸序列表明，它們都含有一個(gè)由21個(gè)氨基酸組成的特征殘基環(huán)［42］。將這幾種氟化酶分離純化，在體外與氟離子和SAM混合反應(yīng)后，結(jié)果表明這幾種氟化酶都具有催化氟離子與SAM結(jié)合生成5'-FDA的能力，但反應(yīng)速率與反應(yīng)進(jìn)程有所不同（表1），表明這幾種酶的活性具有差異性［36-41］。結(jié)果表明，來自鏈霉菌Streptomycessp.MA37的氟化酶FlA1的活性最高。

1.2 天然氟化酶的優(yōu)化改造

目前已從微生物中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)具有高度相似性天然氟化酶，均能催化SAM和氟離子轉(zhuǎn)化為5'-FDA。但由于天然氟化酶活性較低且底物專一性強(qiáng)，還未得到廣泛應(yīng)用。近年來研究人員采取了酶工程的策略對(duì)氟化酶進(jìn)行優(yōu)化，通過定向進(jìn)化與理性設(shè)計(jì)提高了氟化酶的穩(wěn)定性和活性，并擴(kuò)大了氟化酶的底物范圍，使其可應(yīng)用于非天然底物。

圖3 S.cattleya中從5'-FDA到氟乙酸和4-氟蘇氨酸的生物合成途徑[30,36]Fig.3 Biosynthetic pathways for the production of fluoroacetate and 4-fluorthreonine from 5'-FDA in S.cattleya[30,36]

表1 不同來源的氟化酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)匯總Tab.1 The summary for the kinetic parameters of fluorinase from different sources

1.2.1 定向進(jìn)化

定向進(jìn)化是一種酶工程的常用策略，涉及到基因突變、表達(dá)和篩選等過程。實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，需要對(duì)該過程不斷地循環(huán)操作，才能得到優(yōu)化的結(jié)果［43］。在這幾種氟化酶中，來自Streptomycessp.MA37的氟化酶FlA1對(duì)SAM的催化效率最高。因此將FlA1作為研究的對(duì)象。研究表明，在一定條件下，氟化酶可以催化SAM的類似物發(fā)生反應(yīng)。在L-甲硫氨酸存在的條件下，5'-ClDA可以在氟化酶的作用下，脫去氯離子，生成SAM，SAM再與氟離子作用生成5'-FDA（圖4）。5'-ClDA易于合成且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，因此被選為研究氟化酶定向進(jìn)化的底物。通過構(gòu)建飽和突變庫，從文庫中進(jìn)行高通量篩選，獲得突變體fah2081和fah2114，可明顯提高5'-FDA的產(chǎn)量。在L-甲硫氨酸的存在下，兩種突變體催化得到的5'-FDA的產(chǎn)量分別比FlA1催化得到的5'-FDA產(chǎn)量高2.4倍和2.7倍，動(dòng)力學(xué)研究表明，突變體主要通過提高第一步反應(yīng)的kcat值來提高5'-FDA的產(chǎn)量。進(jìn)一步探究其他實(shí)驗(yàn)條件對(duì)反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于所有氟化酶，在用L-硒代甲硫氨酸代替L-甲硫氨酸之后，5'-FDA的產(chǎn)量會(huì)提高2倍左右［30］。

為了將氟化酶應(yīng)用于更多的底物中，研究者們還探究了氟化酶FlA1對(duì)底物特異性的分子決定因素。以5'-ClDA類似物作為反應(yīng)底物，對(duì)FlA1的活性位點(diǎn)進(jìn)行突變。用不同的取代基在5'-ClDA的C-2與C-6位置處發(fā)生取代，可得到一系列5'-ClDA的類似物，氟化酶對(duì)這些類似物的催化效果不同。例如以在C-2位置上發(fā)生氨基取代的類似物作為底物，氟化物產(chǎn)率可以提高。氟化酶FlA1在F213和A279殘基上的修飾，可以提高對(duì)于幾種不同底物的催化活性［44］。

1.2.2 底物特異性優(yōu)化

之前的研究已經(jīng)確定氟化酶在L-甲硫氨酸和氟離子的存在下，可以催化5'-氯-5'-脫氧腺苷（5'-ClDA）經(jīng)中間產(chǎn)物SAM生成5'-FDA，因此研究者們考慮是否其他鹵代脫氧腺苷類似物也可以作為氟化酶催化的底物。研究發(fā)現(xiàn)5'-ClDA、5'-溴-5'-脫氧腺苷（5'-BrDA）和5'-碘-5'-脫氧腺苷（5'-IDA）都可以作為氟化酶的作用底物，而且存在兩種生成5'-FDA的方式：當(dāng)只有氟離子存在而無L-甲硫氨酸時(shí)，鹵代脫氧腺苷直接一步反應(yīng)生成5'-FDA；當(dāng)氟離子和L-甲硫氨酸都存在時(shí)，經(jīng)中間體SAM生成5'-FDA。如果只存在L-甲硫氨酸而無氟離子時(shí)，鹵代脫氧腺苷會(huì)脫去鹵離子生成SAM，不會(huì)進(jìn)行第二步反應(yīng)［45］。比較兩種情況下不同鹵代物的反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率：直接轉(zhuǎn)化時(shí)，5'-BrDA的反應(yīng)速率遠(yuǎn)大于5'-ClDA和5'-IDA，轉(zhuǎn)化率為35%，而后兩者的轉(zhuǎn)化率僅為5%和8%。當(dāng)L-甲硫氨酸和氟離子共同存在時(shí)，5'-ClDA的轉(zhuǎn)化效率最高，5'-BrDA的初始反應(yīng)速率略微加快，而5'-IDA的轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)速率沒有發(fā)生變化。進(jìn)一步驗(yàn)證，當(dāng)只有L-甲硫氨酸存在而無氟離子時(shí)，比較三者轉(zhuǎn)化為SAM的效率，氯化合物最優(yōu)，溴化合物其次，碘化合物幾乎不轉(zhuǎn)化［46］。以上結(jié)果表明兩步反應(yīng)可以有效提高5'-ClDA的轉(zhuǎn)化效率，略微提高5'-BrDA的轉(zhuǎn)化效率，對(duì)5'-IDA的轉(zhuǎn)化效率幾乎無影響。

圖4 氟化酶催化5'-ClDA轉(zhuǎn)化為5'-FDA的兩步反應(yīng)Fig.4 The two-step reaction from 5'-ClDA to 5'-FDA catalyzed by fluorinase

通過酶工程與潛在底物挖掘等方法可擴(kuò)大氟化酶的底物范圍。Sergeev等［47］研究了在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，氟化酶催化與SAM類似的非天然底物生成氟化物的反應(yīng)，這些非天然底物C-5帶有不同的離去基團(tuán)，其中甲硫氨酸樣離去基團(tuán)可以擴(kuò)大酶的底物特異性，相對(duì)更容易合成氟化物并對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾。雖然使用新底物放射性合成［18F］FDA的產(chǎn)量依然低于天然SAM底物，但對(duì)設(shè)計(jì)更適合用作氟化酶催化的底物提供了指導(dǎo)。Zhao等［48］證實(shí)氟化酶催化非天然底物5'-氯-5'-脫氧腺苷（5'-ClDA）生成5'-氟-5'-脫氧腺苷（5'-FDA）的限速步驟在于5'-ClDA到SAM的轉(zhuǎn)化，從而通過引入氯化酶ClA1和ClA2提高該步反應(yīng)的催化效率。由此開發(fā)了一種氯-氟聯(lián)用酶系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)5'-ClDA的高效轉(zhuǎn)化，為氟化酶催化非天然底物提供了新思路。

1.2.3 添加自組裝肽標(biāo)記

可溶性酶溶解在水溶液中能夠?qū)λ芤后w系中的反應(yīng)起到有效的催化作用，但這樣的酶穩(wěn)定性不足，不易保存。為了解決這個(gè)問題，一些研究將設(shè)計(jì)好的多肽標(biāo)簽與酶蛋白融合，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，使其不溶于水，易于保存［49］。從微生物中發(fā)現(xiàn)的天然氟化酶穩(wěn)定性不足是限制其應(yīng)用的一個(gè)因素，因此對(duì)氟化酶添加自組裝肽（SAP）標(biāo)記可改善其性能。自組裝肽是一種有特定序列的多聚肽的集合，可以自發(fā)地組裝形成有序的納米結(jié)構(gòu)。將不同的SAP標(biāo)記添加到FlA的C端，構(gòu)建出三種SAP標(biāo)記的氟化酶聚集體（FLA-ELK16、FLA-L6KD和FLA-18A），三者均不溶于水。標(biāo)記后的三種氟化酶均能催化SAM生成5'-FDA。其中FLA-ELK16對(duì)反應(yīng)的催化效率比FLA低，而FLAL6KD和FLA-18A的催化活性相比于FLA有了明顯的提高。三種SAP標(biāo)記的氟化酶能夠自發(fā)地在水溶液中形成不同大小的納米顆粒，酶熱穩(wěn)定性以及可再生性均有了一定的提高［50］。

1.3 氟化酶的應(yīng)用

1.3.1 氟化酶催化合成含氟活性物質(zhì)

有機(jī)氟化物在現(xiàn)代醫(yī)藥市場及生物活性物質(zhì)的開發(fā)中具有重要的意義［51］。2011年至2016年1月31日，美國FDA共批準(zhǔn)新藥188個(gè)，其中含氟藥物42個(gè)，占比達(dá)到了22.34%。含氟藥物的治療領(lǐng)域主要為抗腫瘤、抗感染、心血管系統(tǒng)疾病以及呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，具有十分廣闊的市場前景［52］。目前上市的含氟藥物生產(chǎn)方式主要為化學(xué)合成，其中氟原子一般是以單個(gè)氟原子取代、二氟甲基取代或三氟甲基取代的形式存在［53］。采取有機(jī)化學(xué)方法合成含氟藥物的主要瓶頸在于難以實(shí)現(xiàn)氟原子或三氟甲基基團(tuán)的選擇性引入，產(chǎn)品的收率、純度一般不高，產(chǎn)品分離純化困難，且目前許多含氟試劑較貴，生產(chǎn)成本高［54］。例如輝瑞公司研發(fā)的新分子實(shí)體藥物克唑替尼（商品名Xalkori），是首個(gè)對(duì)間變性淋巴瘤進(jìn)行靶向治療的藥物，其作用于間變性淋巴瘤激酶（ALK），其合成難點(diǎn)主要在于手性中間體（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇的不對(duì)稱合成［55］；還有適用于晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者一線治療藥物馬來酸阿法替尼，其合成條件一般較為極端，且分離純化困難［56］。氟化酶的發(fā)現(xiàn)為含氟化合物的合成提供了新的思路，氟化酶催化氟化物合成的方法可作為傳統(tǒng)化學(xué)合成有機(jī)氟化物方法的重要補(bǔ)充，研究潛力深遠(yuǎn)。

當(dāng)前已知的含氟天然產(chǎn)物較為稀少，大多由鏈霉菌產(chǎn)生。4-氟-L-蘇氨酸是可對(duì)抗多種細(xì)菌的抗生素劑，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種天然的含氟氨基酸，其與氟乙酸都是鏈霉菌Streptomyces cattleya生物合成途徑中產(chǎn)生的含氟天然產(chǎn)物［57-58］。核殺菌素是一種強(qiáng)效的含氟抗生素，是土壤鏈霉菌Streptomyces calvus產(chǎn)生的含氟天然產(chǎn)物，但其生物合成途徑一直未被闡明。直到2015年，Zechel等［59］首次報(bào)告了一種與S.calvusATCC13382互補(bǔ)的bldA編碼的Leu-tRNAUUA分子，可恢復(fù)S.calvus中核殺菌素的生成。核殺菌素生物合成基因的鑒定，有助于相關(guān)氟化酶的功能研究。

1.3.2 氟化酶催化形成18F—C鍵在正電子成像技術(shù)的應(yīng)用

正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（positron emission computed tomography，PET）技術(shù)，是核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域比較先進(jìn)的臨床檢查影像技術(shù)。該技術(shù)通過用半衰期短的放射性核素18F等標(biāo)記代謝必需的糖類、蛋白質(zhì)、脂肪酸等物質(zhì)來反映生命體的代謝活動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)臨床診斷［60］。18F對(duì)放射性藥物（小分子有機(jī)化合物、肽、配體和蛋白質(zhì)等）的標(biāo)記具有最理想的半衰期，將18F引入藥物分子可使其具有獨(dú)特且多樣的化學(xué)特性［61］。利用氟化酶催化18F—C鍵形成，實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)底物的放射性標(biāo)記，是氟化酶應(yīng)用較為廣泛的一個(gè)方面。

氟化酶催化形成18F—C鍵可用于放射性標(biāo)記肽的研究。O'Hagan等［62］設(shè)計(jì)了一種與癌癥相關(guān)的單體環(huán)肽（cRGD）的兩步放射標(biāo)記方案：首先，氟化酶催化轉(zhuǎn)鹵反應(yīng)生成［18F］-5'-fluoro-5'-deoxy-2-ethynyladenosine（［18F］FDEA）；隨后，［18F］FDEA與cRGD肽發(fā)生反應(yīng)，形成有效的放射性標(biāo)記［63］。相同的轉(zhuǎn)鹵反應(yīng)原理還被用于生成另一種［18F］RGD肽，該類肽與癌細(xì)胞相關(guān)的αvβ3整合素具有很高的親和力。他們還通過底物適應(yīng)性研究等擴(kuò)大了氟化酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)鹵反應(yīng)的底物范圍，對(duì)該策略進(jìn)行了擴(kuò)展［64］。

氟化酶催化形成18F—C鍵可用于開發(fā)新的PET成像工具。O'Hagan等［65］利用一種催化轉(zhuǎn)鹵反應(yīng)的氟化酶（5'-氟-5'-脫氧腺苷合成酶）放射性合成18F標(biāo)記的類似物，產(chǎn)生了新的A2A腺苷受體激動(dòng)劑，得到了一個(gè)有價(jià)值的、用于分析和診斷各種心肌和神經(jīng)退行性疾病的PET成像工具。通過放射性合成［18F］FDA-PEG-biotin，開發(fā)了兩種氟化酶介導(dǎo)的抗體預(yù)靶向工具［66］；通過放射性合成［18F］FDA-PEG-GUL，將其與表達(dá)癌細(xì)胞的前列腺特異性膜抗原（PSMA）特異性結(jié)合，開發(fā)了新的PSMA診斷工具［67］。

1.3.3 氟化酶的異源表達(dá)

自然界中天然氟化物的量遠(yuǎn)少于其他天然鹵化物，目前已經(jīng)有許多生物化學(xué)的方法應(yīng)用于天然氯化物、溴化物和碘化物的生物合成。但目前發(fā)現(xiàn)的氟化酶僅能催化一種反應(yīng)，即將SAM和氟離子轉(zhuǎn)化為5'-FDA。若想實(shí)現(xiàn)多種復(fù)雜氟化物的生成，在現(xiàn)有其他豐富鹵化物的基礎(chǔ)上，通過引入氟化酶基因，將產(chǎn)物中其他鹵素原子替換為氟原子，從而實(shí)現(xiàn)多種氟化物的生成。

Salinispora tropica是一種海洋微生物，能夠合成具有抗癌活性的salinosporamide A。合成該抗生素的過程中涉及到一步氯化反應(yīng)。將S.cattleya中的氟化酶基因flA利用同源重組的方式替換掉S.tropica基因組中的氯化酶基因salL。在海水配制的培養(yǎng)基上進(jìn)行突變菌株的培養(yǎng)，反應(yīng)底物中的無機(jī)氟離子由氟化鉀（KF）提供，生長對(duì)數(shù)期過后再添加KF，經(jīng)一段時(shí)間發(fā)酵培養(yǎng)后，檢測到有明顯的fluorosalinosporamide A的生成［68］。這種策略通過對(duì)已存在的非氟鹵化物的生物合成途徑進(jìn)行基因工程改造，將化合物中的鹵原子替換為氟原子，擴(kuò)大了生物合成氟化物種類的范圍。雖然目前利用這種策略來合成氟化物的報(bào)道不多，但這種策略是以成熟且豐富的鹵化物生物合成途徑為基礎(chǔ)，具有廣闊的研究前景。

2 氟化物生物合成系統(tǒng)的構(gòu)建

基因、啟動(dòng)子和終止子等生物元件是合成生物學(xué)中的“模塊”［69］。將含氟模塊引入生物合成途徑是將合成生物學(xué)的思路引入有機(jī)氟化物的合成中，是含氟化合物生產(chǎn)的新思路。利用這種思路，可將氟原子的特性轉(zhuǎn)移到具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物中（如聚酮類、異戊二烯類、固醇類、生物堿類、類花生酸類物質(zhì)、白細(xì)胞三烯類等），從而改善這些天然產(chǎn)物的功能［31］。

2.1 氟化聚酮類化合物生物合成系統(tǒng)的構(gòu)建

聚酮合成酶（PKS）是在細(xì)菌體內(nèi)構(gòu)建復(fù)雜天然產(chǎn)物的組裝線，在PKS多酶系統(tǒng)中，一個(gè)獨(dú)立折疊的結(jié)構(gòu)域可行使一個(gè)酶的活性，這些結(jié)構(gòu)域再被分成不同的工作單元，即模塊，每個(gè)模塊為組裝鏈引入一個(gè)結(jié)構(gòu)單元，然后按順序?qū)⒈恍揎椀闹虚g體交給下一個(gè)模塊［70］。將含氟模塊引入聚酮合成酶系統(tǒng)，可將氟原子引入天然產(chǎn)物的支架中，生成氟化聚酮，是復(fù)雜有機(jī)氟化物合成的重要補(bǔ)充策略。

研究人員以小分子的氟乙酸為原料構(gòu)建含氟模塊，再將此含氟模塊納入聚酮生物合成系統(tǒng)中，成功將氟原子引入到聚酮骨架中［71］。研究人員分別以氟乙酸、氟丙二酸為原料，用兩步法和一步法在體外成功合成了含氟延伸模塊——氟化丙二酰輔酶A，然后將氟化丙二酰輔酶A單體用于聚酮鏈延伸反應(yīng)［圖5（a）］［72］。其中，兩步法分別為復(fù)合乙酸激酶（AckA）-磷酸乙酰酶（Pta）和乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）催化，一步法為丙二酰-CoA合成酶（MatB）催化。隨后，他們構(gòu)建了體外氟化聚酮合成系統(tǒng)［圖5（b）］。在前期，他們將NphT7與PhaB兩種酶耦合，以乙酰輔酶A作為起始單元、氟化丙二酰輔酶A作為延伸單元，構(gòu)建了簡單PKS系統(tǒng)，與丙二酰輔酶A作為延伸單元的不含氟系統(tǒng)相比，催化效率降低了5倍。之后，他們將這種策略應(yīng)用于更復(fù)雜的合成紅霉素前體的6-脫氧尿苷酸B合成酶（DEBS）PKS系統(tǒng)。以DEBS系統(tǒng)的第6個(gè)模塊DEBSMod6+TE為研究對(duì)象，以天然N-乙酰半胱胺硫酯（NDK-SNAC）為底物，形成2-氟-2-去甲基三酮內(nèi)酯（F-TKL）。研究者們進(jìn)一步研究該系統(tǒng)合成含氟化合物的選擇性，他們用一個(gè)由DEBSMod2和DEBSMod3+TE組成的微型PKS系統(tǒng)研究了氟原子的位點(diǎn)選擇性引入，設(shè)計(jì)了從底物NDK-SNAC開始的的兩個(gè)鏈延伸反應(yīng)，通過對(duì)DEBS中的酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行失活突變，證實(shí)了含氟延伸單體摻入的區(qū)域選擇性。最后，他們?cè)贓.coliBAP1體內(nèi)過表達(dá)DEBSMod6+TE和MatB，在氟丙二酸、CoA、ATP存在下，以NDK-SNAC為底物，氟化丙二酰CoA為延伸模塊，合成了產(chǎn)物F-TKL，成功實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞內(nèi)的聚酮骨架中選擇性地引入氟［31］［圖5（c）］。

圖5 氟化聚酮類化合物生物合成系統(tǒng)的構(gòu)建Fig.5 Construction of fluorinated polyketide biosynthesis systems

Chang等［73］為深入了解酶的活性位點(diǎn)和代謝途徑可如何被進(jìn)一步改造以選擇性生成含氟化合物，研究了能夠生物合成有機(jī)氟化物的土壤鏈霉菌Streptomyces cattleya，并構(gòu)建了用于生產(chǎn)含氟聚酮的酶系統(tǒng)和細(xì)胞途徑。這項(xiàng)研究為設(shè)計(jì)工程化的有機(jī)氟化酶、通路和宿主提供了模板。他們還設(shè)計(jì)了一種用于有機(jī)氟代謝的微生物宿主，使其能夠生產(chǎn)氟化二酮基2-氟-3-羥基丁酸鹽，該產(chǎn)物的收率可達(dá)到理論收率的約50%。這種小分子氟化物可以作為一種單體，利用聚合酶在體內(nèi)生產(chǎn)氟代聚羥基烷酸酯（PHA）生物塑料，引入的含氟單體量高達(dá)15%［74］。

除此之外，Chang等［75］還發(fā)現(xiàn)AT結(jié)構(gòu)域的失活可消除對(duì)氟化聚酮類化合物生物合成系統(tǒng)中含氟擴(kuò)展單元的選擇性，并啟動(dòng)獨(dú)立于ACP的C—C鍵形成模式?；诖怂麄儗?duì)DEBS模塊的反式AT互補(bǔ)進(jìn)行了詳細(xì)的研究，與天然甲基丙二酸單酰輔酶A擴(kuò)展單元相比，以含氟單體為擴(kuò)展單元形成C—C鍵的產(chǎn)率為43%。他們進(jìn)一步構(gòu)建了一種雙模塊mini-PKS系統(tǒng)，用兩個(gè)順序的AT0模塊與DszAT互補(bǔ)，以插入兩個(gè)含氟擴(kuò)展單元，證明單氟和雙氟產(chǎn)物可以由雙模塊系統(tǒng)以1：1的DEBS模塊比例合成，DszAT互補(bǔ)使產(chǎn)量增加了約93倍。該研究通過將一個(gè)氟化單體與酶共價(jià)結(jié)合來完成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)周期，在工程聚酮合成酶系統(tǒng)中選擇性地引入氟，通過提高氟化擴(kuò)增單元的產(chǎn)量生產(chǎn)多氟化聚酮，提出了利用化學(xué)酶法合成和靶向生產(chǎn)復(fù)雜含氟結(jié)構(gòu)的新策略。

2.2 其他含氟生物合成系統(tǒng)

除了利用含氟模塊將氟引入聚酮合成酶系統(tǒng)中得到含氟化合物的方法，研究人員也在開發(fā)其他新穎的方法得到有價(jià)值的含氟有機(jī)物。Oberlies等［76］利用木霉Trichoderma arundinaceum的生物合成機(jī)制，采用前體導(dǎo)向的生物合成方法，將氟原子選擇性插入肽類天然產(chǎn)物骨架中。他們選擇Pheol20作為前體，將菌株MSX70741在含有鄰氟苯丙氨酸和間氟苯丙氨酸的培養(yǎng)基中發(fā)酵，在野生型菌株體內(nèi)合成了兩種新的含氟阿來米星F50衍生物。Chang等［77］研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型HpcH醛縮酶家族可有效地催化氟丙酮酸引入不同的具有高度立體選擇性的醛中，經(jīng)過一系列立體化學(xué)和理論計(jì)算分析，他們將醛縮酶用于具有高立體純度的新型氟酸（酯）衍生物的化學(xué)-酶合成方法中。通過摻入氟丙酮酸模塊所獲得的化合物可以作為多功能底物，利用酶和化學(xué)手段進(jìn)行下游加工，從而得到一系列新化合物，成為合成糖類、氨基酸及其他有價(jià)值的手性氟化類似物的前體。Arnold等［78］使用定向進(jìn)化的方法設(shè)計(jì)了細(xì)胞色素P450酶，使其能夠高效、高對(duì)映選擇性地催化C—H氟烷基化反應(yīng)。通過對(duì)含α-氨基C（sp3）—H鍵底物的直接氟烷基化，在底物結(jié)構(gòu)中不對(duì)稱地引入了三氟乙基或五氟丙基。該反應(yīng)總催化轉(zhuǎn)化活性高達(dá)4070TTN，對(duì)映體過量（ee）高達(dá)99%。

3 結(jié)語與展望

氟在藥物設(shè)計(jì)及生物活性物質(zhì)的開發(fā)中具有重要的意義，將氟引入化合物分子可以有效地影響化合物的分子構(gòu)象、pKA、內(nèi)在效力、膜通透性、代謝途徑和藥代動(dòng)力學(xué)特性等［79］。通過化學(xué)手段合成含氟化合物的條件通常較為苛刻，且合成復(fù)雜結(jié)構(gòu)困難，難以實(shí)現(xiàn)選擇性氟化，因此，利用合成生物學(xué)手段合成含氟化合物是含氟化合物生產(chǎn)的新方向。

含氟化合物生物合成策略主要有兩種：一是利用氟化酶催化C—F鍵形成得到含氟有機(jī)物；二是利用含氟構(gòu)建模塊將氟引入復(fù)雜天然產(chǎn)物的骨架中。至今，野生型氟化酶發(fā)現(xiàn)的種類極少，因此發(fā)掘新型氟化酶以及通過定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)的方法對(duì)現(xiàn)有天然氟化酶進(jìn)行改造，是氟化酶研究的重要方向；在構(gòu)建含氟系統(tǒng)方面，將含氟構(gòu)建塊創(chuàng)造性引入復(fù)雜天然產(chǎn)物生物合成路徑（如聚酮、長鏈肽類等），并控制其插入的特異性及可能產(chǎn)生的毒性，是將氟引入有價(jià)值天然產(chǎn)物值得關(guān)注的手段。