基于病毒組件的納米材料的自組裝合成、功能化及應(yīng)用

張文靜，李明，周維，張先恩，李峰

（1中國科學(xué)院武漢病毒研究所，生物安全大科學(xué)研究中心，病毒學(xué)國家重點實驗室，湖北武漢430071；2中國科學(xué)院生物物理研究所，生物大分子科教融合卓越中心，生物大分子國家重點實驗室，北京100101；3中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

生物體系中存在大量精巧的生物大分子組裝體納米機器，它們參與生命周期的各個過程，對生命過程的正常發(fā)生至關(guān)重要。研究這些天然納米機器的組裝與功能，促進人們對生物大分子組裝體的理解以及再設(shè)計、再合成、再利用。其中，病毒是一類典型的生物大分子組裝體，具有納米尺度的大小、精確的三維結(jié)構(gòu)，執(zhí)行明確的生物學(xué)功能，是通過分子自組裝合成納米材料的天然范例，吸引了越來越多不同領(lǐng)域的學(xué)者和開發(fā)者的注意。病毒學(xué)與納米技術(shù)的交叉，產(chǎn)生了病毒納米技術(shù)這一新興領(lǐng)域。圍繞基于病毒顆粒的納米材料，人們發(fā)展了基因工程、化學(xué)修飾、組裝、礦化等各種不同的功能化改造手段，進而應(yīng)用于生物遞送、免疫學(xué)、生物傳感、酶學(xué)、微電子學(xué)等各個領(lǐng)域。

1 病毒的結(jié)構(gòu)

病毒是最簡單的生命形式，普遍存在于不同等級的生物體中，按照其感染對象，可分為動物病毒、植物病毒、細菌病毒（又稱“噬菌體”）和真菌病毒。病毒的基本結(jié)構(gòu)由蛋白質(zhì)外殼（即衣殼）和封裝于其中的基因組核酸組成，包膜病毒衣殼外部還具有磷脂膜結(jié)構(gòu)。病毒衣殼按形態(tài)可分為球形、棒狀、絲狀、蝌蚪狀等（圖1）。球形病毒衣殼具有正二十面體對稱性，而棒狀及絲狀病毒衣殼具有螺旋對稱性，蝌蚪狀病毒具有復(fù)合對稱性，如T4噬菌體既有正二十面體對稱性的衣殼頭部，又有螺旋對稱性的尾鞘。正二十面體病毒衣殼的蛋白質(zhì)亞基數(shù)量和排布可以由三角剖分數(shù)（T）表示，T越大粒徑越大［1］。很多病毒的衣殼蛋白可以發(fā)生可逆自組裝，形成與病毒衣殼類似的結(jié)構(gòu)，即病毒樣顆粒（viruslike particle，VLP）。病毒粒子和VLP都可稱為病毒納米顆粒（virus-based nanoparticle，VNP），作為構(gòu)建復(fù)合納米結(jié)構(gòu)和材料的組件。

VNP具有特定的形狀和大小，人們可以根據(jù)目的選擇合適的VNP。例如，正二十面體衣殼有豐富的內(nèi)腔載物空間，適合作為各種分子或納米顆粒的容器；螺旋對稱的棒狀及絲狀衣殼則更適合用作一維納米支架或模板。有些VNP在特定條件下可發(fā)生形變，如煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）［2］、噬菌體P22［3］，這種環(huán)境響應(yīng)機制賦予VNP更多的材料學(xué)屬性和應(yīng)用潛力。目前，包膜型VNP通常以活病毒的形式在細胞中產(chǎn)生，包膜型VNP在細胞外的解聚再重構(gòu)尚未實現(xiàn)，一定程度上限制了包膜型VNP的修飾改造及應(yīng)用。無包膜的VNP既可以在細胞中完成組裝，也可以在細胞外組裝，結(jié)構(gòu)可操縱性更強，因而修飾改造策略及應(yīng)用研究更豐富，因此本文涉及的VNP主要為無包膜VNP。總體而言，VNP或其組分能夠在細胞工廠（宿主或重組表達系統(tǒng)）中大量高保真生產(chǎn)，因此它們是一類可規(guī)模化低成本生物合成的天然生物納米材料。

圖1 VNP舉例（STMV、CCMV、SV40、HPV、P22結(jié)構(gòu)模型從http：//viperdb.scripps.edu/獲得，M13結(jié)構(gòu)摘自文獻［9］，TMV結(jié)構(gòu)摘自文獻［10］）Fig.1 Schematic diagrams for virus-based nanoparticles(VNPs){The structure models of satellite tobacco mosaic virus(STMV),cowpea chlorotic mosaic virus(CCMV),simian virus 40(SV40),human papillomavirus(HPV),and P22 are obtained from http://viperdb.scripps.edu/.The models of M13 and TMV are reproduced from references[9]and[10],respectively}

自然界中來自不同物種的病毒，構(gòu)成了豐富的天然病毒資源庫，為發(fā)展病毒納米材料奠定了基礎(chǔ)。同時，受天然病毒衣殼組裝的啟發(fā)，近年來新興的計算機輔助自組裝蛋白納米材料（特別是籠形蛋白結(jié)構(gòu)）的理性設(shè)計，為發(fā)展病毒納米技術(shù)提供了全新的材料基礎(chǔ)和強大的改造能力［4-8］。

2 病毒納米顆粒（VNP）的功能化策略

2.1 基因工程

編碼病毒蛋白的核酸序列很容易獲取。根據(jù)VNP結(jié)構(gòu)信息進行理性結(jié)構(gòu)設(shè)計［11］，通過基因工程可以方便地將編碼目的蛋白或肽段的核酸序列整合到病毒蛋白基因中，從而將外源功能模塊引入VNP的特定位置（圖2）。VNP的內(nèi)腔、外表面以及亞基間的界面均可進行基因工程改造。外源基因引入位點常常位于VNP的氨基末端（N端）、羧基末端（C端）、柔性環(huán)結(jié)構(gòu)，這樣有利于保持VNP的組裝特性和外源肽段的正確折疊。

VNP的末端通常暴露在其蛋白主體骨架的外面，末端修飾可降低外源片段與病毒蛋白主體之間的相互影響。因此末端對基因工程改造的容納度高，是基因工程改造的首選位點。VNP純化制備的最常用方法之一是蛋白親和純化。大量研究在VNP末端融合親和純化標簽以實現(xiàn)親和純化。例如，在猴病毒40（simian virus 40，SV40）VP1的N端融合多聚組氨酸標簽（histidine tag，Histag）［12］，在人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）L1的N端融合谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）［13］，在口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）的N端融合小分子泛素樣修飾蛋白（small ubiquitinlike modifier，SUMO）［14］等，以實現(xiàn)相關(guān)VNP的純化。不同功能的肽段/蛋白也常常融合在VNP的末端以實現(xiàn)藥物篩選、遞送、治療等目的，如：在M13噬菌體的衣殼蛋白pⅧ的N端融合多肽，用于篩選得到對靶標具有高親和力的多肽藥物［15］；在噬菌體MS2 VNP的N端融合細胞穿膜肽［16］；在P22 VNP的N端融合線粒體凋亡調(diào)控肽［17］；SV40 VNP的N端融合動脈粥樣硬化治療肽［18］等。另外，VNP末端還可以引入功能肽段以促進或介導(dǎo)其他功能元件的裝載，如在乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen，HBc）的末端引入Histag以特異性包裝Ni-NTA（Ni2+-nitrilotriacetic acid）修飾的氧化鐵納米顆粒（iron oxide nanoparticle，IONP）［19］、引入親脂性多肽以實現(xiàn)包裝多柔比星（阿霉素，doxorubicin，DOX）［20］、引入RNA結(jié)合蛋白以實現(xiàn)RNA的包裝［21］。

圖2 通過基因工程、化學(xué)修飾、礦化和組裝等策略對VNP進行功能化改造Fig.2 Functionalization of VNPs through different strategies,including genetic engineering,chemical modification,mineralization,and assembly

VNP內(nèi)外表面的柔性環(huán)結(jié)構(gòu)也是插入外源片段的常用位點。不同的VNP、不同位置的環(huán)結(jié)構(gòu)對插入外源片段的兼容性不同。例如，SV40 VNP表面的BC環(huán)引入外源片段會破壞SV40 VNP的結(jié)構(gòu)，而HI環(huán)和DE環(huán)上各發(fā)現(xiàn)一個可供外源片段插入的位點［22］。不同VNP表面柔性環(huán)對插入片段大小及結(jié)構(gòu)的容納度不同，需要更詳細的探索，分子動力學(xué)模擬可以為此提供一定的參考。從整體上講，VNP表面柔性環(huán)結(jié)構(gòu)上可插入的外源片段涵蓋短肽到分子量大于VNP亞基的蛋白質(zhì)，如VNP可展示靶向整合素的RGD短肽［23］、靶向動脈粥樣硬化斑塊的短肽［18］、靶向人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）的親和配體［24-25］以及綠色熒光蛋白［26］等。

除了主要衣殼蛋白，次要衣殼蛋白或支架蛋白也可以用來融合外源多肽或蛋白。這些蛋白特異性的結(jié)合在主要衣殼蛋白上，對融合外源序列的容納度往往更高。例如，M13噬菌體的次要衣殼蛋白pⅢ可融合展示單域抗體［27］或單鏈抗體［28］，構(gòu)建抗體的噬菌體展示文庫；P22 VNP內(nèi)部的支架蛋白SP上融合酶分子（乙醇脫氫酶D［29］、外切葡聚糖酶CelB［30］、Cas9［31-32］等），形成了多種VNP包裝酶的納米反應(yīng)器；SV40次要衣殼蛋白VP2/VP3上融合熒光蛋白，形成了多種熒光成像方法［33-35］。人們可以通過對外源多肽序列的選擇和設(shè)計，使之成為裝載其他功能模塊（如無機納米顆粒）的錨定位點。

此外，對衣殼蛋白序列循環(huán)重排［36］和定向進化［37］，能夠大幅改變已有VNP的結(jié)構(gòu)特征，可以從大量的改造文庫中篩選獲得具有新的組裝特性［38］或者功能化位點［39］的VNP，為VNP的基因工程改造提供了新思路。

2.2 化學(xué)修飾

化學(xué)修飾可為VNP提供靈活多樣的功能化方案。根據(jù)VNP的精確結(jié)構(gòu)信息，能快速定位可用于修飾的氨基酸殘基位點［40］。這些氨基酸有半胱氨酸［41］、賴氨酸［42］、天冬氨酸［43］、谷氨酸［44］、組氨酸［19］以及一些人工引入的非天然氨基酸（如帶有疊氮基團的L-疊氮高蘇氨酸和對氨基苯丙氨酸）［45］等等。通常選擇暴露于VNP內(nèi)或外表面以及位于亞基間界面的氨基酸殘基進行生物綴合（bioconjugation），從而方便地把功能模塊修飾在VNP上，常用的VNP化學(xué)修飾試劑及應(yīng)用案例總結(jié)于表1。

2.3 礦化

生物礦化是在生物體特定的部位，在一定的物理化學(xué)條件和生物有機物質(zhì)的控制或影響下，將溶液中的離子轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔嗟V物的過程。骨骼、牙齒和器官結(jié)石等都是通過生物礦化形成。受此啟發(fā)，礦化也成為一種VNP功能化改造的方法［59］。VNP外表面和內(nèi)腔均可礦化（圖2）。一般策略是利用VNP上天然存在的無機物前體親和位點或外源引入的無機物親和肽/化合物與無機物前體發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)無機物結(jié)晶成核，進而通過種子生長，形成均一有序的納米顆粒。

表1 VNP的生物綴合功能化實例［43-44，46-58］Tab.1 Functionalization of VNPs via bioconjugation

研究者在VNP外表面引入誘導(dǎo)無機物礦化的肽，成功將磷酸鈣和硅沉積包裹到腸道病毒（enterovirus 71，EV71）［60-61］、口蹄疫病毒（footand-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）［62］和登革病毒（dengue virus，DENV）疫苗的表面形成類似于“雞蛋殼”的保護層，顯著提高了疫苗的穩(wěn)定性。Evans等［63］圍繞豇豆花葉病毒（cowpea mosaic virus，CPMV）VNP外表面礦化開展了一系列工作。他們利用CPMV VNP表面對金屬鈀（Pd）前體的親和性，在CPMV表面礦化形成Pd簇，以Pd簇作為后續(xù)礦化的成核位點，成功在CPMV表面生長了鈷（Co）、鎳（Ni）、鐵（Fe）、鉑（Pt）、Co-Pt和Ni-Fe等多種納米材料。他們還通過在CPMV VNP表面覆蓋一層陽離子聚合電解質(zhì)，吸引負電荷的金（Au）前體，礦化了Au殼［64］；通過在CPMV VNP外表面賴氨酸殘基上引入負電荷的琥珀酰胺酸鹽的方法吸引正電荷前體，礦化了Co及IONP［65］。

VNP的內(nèi)腔尺寸，能夠?qū)ΦV化產(chǎn)物的大小進行限制，有助于形成均一的納米顆粒。在VNP內(nèi)腔礦化的一個策略是在VNP內(nèi)腔引入短肽等無機物前體親和基序。應(yīng)用這種策略，人們實現(xiàn)了不同物理化學(xué)性質(zhì)的納米材料［如硫化銅（CuS）［55］、硫化鎘（CdS）［66］、二氧化鈦（TiO2）［67］、四氧化三鐵（Fe3O4）［68］、Au［69］、銀（Ag）［70］、Au@Ag［71］等］的礦化。另一種策略是通過溶液條件控制VNP的形變，實現(xiàn)前體物質(zhì)在內(nèi)腔的捕獲。例如，利用豇豆褪綠斑駁病毒（cowpea chlorotic mosaic virus，CCMV）VNP pH響應(yīng)的閘門機制，實現(xiàn)了前體物質(zhì)在VNP內(nèi)腔的捕獲聚集，獲得了IONP［72］、仲鎢酸鹽［73］和普魯士藍［74］納米顆粒等。此外，對VNP內(nèi)腔和外表面進行差異礦化能實現(xiàn)不同納米材料性質(zhì)的耦合［66］。

2.4 組裝

在一定條件下，VNP可實現(xiàn)解聚-組裝狀態(tài)的相互轉(zhuǎn)換，為VNP包裝外源功能模塊提供了可能性［75-76］。不同表面性質(zhì)、組成和大小的蛋白質(zhì)、核酸、藥物、無機納米材料都能被包裝進VNP［77-80］。模擬病毒包裝核酸的特性，賦予貨物負電荷、增加貨物與VNP內(nèi)表面的靜電相互作用，是VNP包裝貨物的常用策略之一。例如，表面帶負電荷的金納米顆粒（Au nanoparticle，AuNP）、量子點（quantum dot，QD）被高效包裝到雀麥草花葉病毒（brome mosaic virus，BMV）VNP中［81-82］。同時，賦予衣殼蛋白與貨物之間特異性親和作用是誘導(dǎo)VNP包裝貨物的另一策略。例如，將紅三葉草壞死花葉病毒（red clover necrotic mosaic virus，RCNMV）的組裝起始RNA序列修飾到納米顆粒表面，實現(xiàn)了RCNMV VNP包裝直徑3～15 nm的Au、四氧二鐵酸鈷（CoFe2O4）和硒化鉻（CdSe）納米顆粒［83-84］。除了病毒基因組包裝信號序列，病毒內(nèi)部蛋白、Ni-NTA與Histag、Spytag與Spycather、疏水相互作用等也被用來實現(xiàn)外源物質(zhì)的選擇性包裝［19-20，85-87］。VNP的解聚-組裝控制一般通過透析的方法，通過調(diào)節(jié)溶液的pH、鹽離子強度、鹽離子種類、氧化還原電勢等使解聚的衣殼蛋白發(fā)生再組裝，從而實現(xiàn)外源物質(zhì)的包裝。為了解決苛刻的解聚條件對貨物穩(wěn)定性和活性的損傷，本文作者團隊［88］報道了一種利用蛋白質(zhì)的表觀臨界組裝濃度控制VNP組裝包裝外源物質(zhì)的策略，大大擴展了VNP的載荷包裝范圍。

VNP外表面可以作為VNP與其他功能材料共組裝的界面。通過組裝可將功能材料密度可控地展示在VNP的外表面。例如，Li等通過調(diào)節(jié)SV40 VNP與AuNP之間的界面相互作用，成功構(gòu)建了一系列AuNP與VNP的共組裝體［89］。為了實現(xiàn)SV40 VNP表面納米顆粒數(shù)量的更精確控制，他們建立了VNP的單功能化策略［90］。同時，通過調(diào)控VNP與其他材料的界面相互作用，還可使VNP形成多層級組裝體。例如，利用CCMV與AuNP的靜電相互作用構(gòu)建三維二元超晶格［91］，通過生物素與鏈霉素的親和作用構(gòu)建功能性CCMV三維雜合共組裝體［92］，利用靜電驅(qū)動的層層組裝效應(yīng)驅(qū)動聚二甲基二烯丙基氯化銨與CPMV形成納米薄膜［93］以及TMV層層組裝形成超薄纖維膜等功能性材料［94］。

3 基于病毒組件的納米材料的應(yīng)用

3.1 生物醫(yī)學(xué)成像

利用VNP進行生物醫(yī)學(xué)成像，一方面是對疾病的定位和進展進行可視化診斷，旨在更早更靈敏的疾病檢測；另一方面是追蹤VNP納米診療平臺的細胞特異性攝取及活體行為（如活體分布、清除率、免疫原性等），對VNP納米診療平臺進評估和改進。VNP具有易于修飾、豐富的載物空間等特點，容易實現(xiàn)對信號分子的高密度裝載以及與靶向元件聯(lián)用，有利于高性能組織特異性成像，因而特別適合作為多功能成像探針。目前，VNP已用于光學(xué)成像、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）等成像領(lǐng)域。

近年來，研究者進行了大量VNP用于光學(xué)成像的研究。例如，在SV40 VNP內(nèi)腔蛋白VP2/VP3上利用基因工程引入熒光蛋白，實現(xiàn)了對SV40 VNP細胞攝取行為的追蹤［33-35］。在BMV［95］、CCMV［96］上實現(xiàn)熒光染料高密度無猝滅標記，大幅提高了熒光成像的效率。QD是一種典型的熒光納米探針，與熒光蛋白及熒光染料相比，具有亮度高、光穩(wěn)定性好等特性，有利于提高成像的靈敏度及信噪比［97-98］。自2008年以來，人們進行了若干病毒偶聯(lián)QD用于示蹤的研究，為揭示病毒的感染機制提供了有價值的信息［99-101］。然而，在病毒外表面標記QD會對病毒-宿主相互作用造成潛在人為干擾，因而這方面的研究一直存在爭議，而將QD包裝在VNP內(nèi)腔則能消除這種擔憂。2009年，Li等［102］首次報道在VNP內(nèi)腔包裝可見光QD進行熒光示蹤的研究，實現(xiàn)了對SV40 VNP細胞攝取行為的追蹤，模擬了SV40細胞侵染的早期步驟［圖3（a）］。2015年，進一步用VNP包裝NIR-Ⅱ熒光（1000～1700 nm）硫化銀（Ag2S）QD，實現(xiàn)了對SV40 VNP小鼠活體行為的實時動態(tài)追蹤［圖3（b）］［103］。更有意思的是，Cui和Wang等［85-86，104-105］通過在病毒內(nèi)腔的核酸或蛋白上標記QD，實現(xiàn)了活病毒包裝QD，并成功地追蹤了HIV-1的細胞侵染行為。熒光蛋白、有機熒光染料、QD等聯(lián)合使用，可實現(xiàn)多重標記，為了解病毒的脫殼機制、VNP解聚及貨物釋放提供更多頗有價值的直觀信息［34，104-108］。

VNP也可用以構(gòu)建MRI探針。2005年，Douglas等［109］將MRI T1造影劑釓（Gd）與CCMV上的金屬結(jié)合位點結(jié)合，使Gd-CCMV復(fù)合物的T1弛豫率比單獨的Gd提高了10倍。隨后，Kang等［110］利用P22 VNP高密度裝載Gd，首次實現(xiàn)小鼠活體血管成像。2011年，Dragnea等［111］利用BMV VNP包裝MRI T2加權(quán)成像造影劑IONP，利用MRI追蹤了BMV在本氏煙草葉片細胞間的長距離遷移。以VNP作為骨架，將MRI造影劑與靶向元件整合在一起，有利于實現(xiàn)靶向成像。例如，在棒狀噬菌體M13表面負載單分散磁性IONP，在M13末端引入SPARC糖蛋白靶向肽，實現(xiàn)了活體前列腺癌的特異性成像［112］。此外，也有來自不同機構(gòu)的研究者利用MS2、P22、TMV、HBc等VNP裝載Gd［110，113-117］、IONP［19］、錳（Mn）［118］、氙（Xe）［119-120］等造影劑，實現(xiàn)高信噪比MRI，顯示了VNP在增強MRI方面的重要價值和應(yīng)用潛力。

PET依賴于對放射性示蹤劑的檢測。Hooker等［41］在MS2 VNP內(nèi)腔標記PET探針［18F］氟苯甲醛，實現(xiàn)了MS2大鼠活體行為追蹤。Farkas等［121］在MS2內(nèi)腔標記PET探針放射性銅（64Cu），實現(xiàn)了MS2及PEG-MS2荷瘤小鼠活體行為追蹤，發(fā)現(xiàn)PEG修飾有利于減少MS2在脾中的富集，而MS2的腫瘤靶向一定程度上依賴于腫瘤微環(huán)境的高滲透長滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）效應(yīng)。VNP上同時引入腫瘤靶向元件和PET造影劑，有利于實現(xiàn)VNP對腫瘤的主被動靶向和特異性成像［122-123］。VNP與放射性示蹤劑優(yōu)勢互補，前者提供活體靶向性，后者作為PET成像探針，有靈敏度高、成像穿透深等優(yōu)點，整合二者有利于實現(xiàn)活體水平高靈敏靶向成像和無創(chuàng)診斷。

3.2 生物傳感

VNP具有高度規(guī)則有序的結(jié)構(gòu)，它們尺寸、形態(tài)各異，三維結(jié)構(gòu)能被精確表征到近原子分辨率，這使得人們能以近原子精準度對其進行操控以及化學(xué)特異性修飾，發(fā)展結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)高度可控的納米骨架［124］。例如，Bruckman等［125］通過生物綴合得到苯胺低聚物（oligo aniline，OANI）修飾的TMV VNP（OANI-TMV），OANI-TMV進一步相互連接形成薄層，在感知到揮發(fā)性有機物（尤其是甲醇、乙醇）時發(fā)生形態(tài)變化從而導(dǎo)致電導(dǎo)性發(fā)生變化而檢測出揮發(fā)性有機物。VNP具有易于改造的特點，修飾上不同配體便可成為不同的傳感器。2001年，Dultsev等［126］通過將麥芽糖結(jié)合蛋白融合表達于M13 VNP表面，再用吸附了麥芽糖的石英晶體微天平對其進行檢測，重組VNP與麥芽糖的特異性結(jié)合能通過電信號的變化檢測出來，該研究為高敏感度、低消耗的病毒檢測提供可能。2005年，Neufeld等［127］將報告酶（堿性磷酸酶）基因與M13噬菌體的基因融合表達于細菌中，該報告酶能與細菌周質(zhì)空間的對氨基苯基磷酸酯反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物對氨基苯酚擴散出細菌并被電極氧化，他們通過檢測電勢的變化來判斷酶是否表達，在具有合適的噬菌體和報告基因的情況下這樣的系統(tǒng)可用于任何細菌的快速檢測。

圖3 VNP用于生物醫(yī)學(xué)成像［18，102-103］Fig.3 VNPs for biomedical imaging［18，102-103］

3.3 核酸及藥物遞送

VNP一定程度上保留了跨細胞膜轉(zhuǎn)運的特性，被廣泛用于遞送核酸、多肽、小分子、功能納米材料等生物活性物質(zhì)到細胞或活體中［128］。前文對VNP遞送成像造影劑、抗原、酶分別進行了介紹，本節(jié)重點就VNP遞送核酸及藥物（多肽、小分子、功能納米材料）方面的工作進行介紹。

使用VNP遞送核酸的研究歷史已超過半個世紀，產(chǎn)出了大量工作。其中一個典型代表是腺病毒基因載體［129-131］。利用噬菌體、植物病毒等也可實現(xiàn)基因遞送，如在T7噬菌體上展示與病毒附著有關(guān)的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）包膜蛋白PreS1區(qū)，可使基因更有效地遞送至人肝癌細胞HepG2［132］。除了基因，VNP還可遞送mRNA［133-134］、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）［49，135-136］和基因編輯RNA-酶復(fù)合物［137-138］等，發(fā)揮防止RNA降解、跨細胞遞送、活體靶向的作用?；赩NP的核酸遞送，更詳細的介紹可參考Mah等的綜述［131，139］。

VNP可通過基因工程進行功能化，便于靶向肽與治療性多肽藥物的整合，易于生物合成，因此是生物活性肽的良好遞送平臺［140］。本團隊在P22衣殼蛋白上裝載細胞毒性肽及組織蛋白酶B識別序列，實現(xiàn)細胞毒性肽在乳腺腫瘤細胞MDAMB-231中的環(huán)境響應(yīng)性釋放及治療作用［17］。Sun等［18］在SV40 VNP上引入動脈粥樣硬化斑塊靶向肽及治療肽，并在內(nèi)腔包裝熒光QD，從而構(gòu)建集成像-靶向-治療于一體的VNP平臺，實現(xiàn)小鼠動脈粥樣硬化的診斷、靶向及治療［圖3（c）］。這些研究表明，VNP對不同多肽的裝載具有良好的兼容性，且易于與靶向、診斷等功能模塊集成形成多功能診療納米器件，具有重要臨床應(yīng)用潛力。

VNP還可用于遞送小分子藥物，與靶向元件聯(lián)用，可增加治療的特異性，減輕副作用。木槿褪綠環(huán)斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus，HCRSV）同時包裝聚丙烯酸和DOX以增加DOX的包封率，在VNP的外表面修飾葉酸以賦予VNP靶向腫瘤細胞的能力，大大增加了DOX的卵巢癌細胞攝取及細胞毒性［141］。TMV包裝菲鉑（phenanthriplatin）后，對小鼠三陰性乳腺癌腫瘤的治療作用相比于傳統(tǒng)抗癌藥順鉑（cisplatin）或未包裹的菲鉑均有明顯提升［142］。Benhar等［143］在噬菌體M13和fd表面連接抗金黃色葡萄球菌的抗體和氯霉素，實現(xiàn)了特異性抗菌作用。Young等［144］將CCMV共價修飾釕配合物作為光敏劑，通過二極管照射產(chǎn)生活性氧，通過特異性抗體靶向殺滅金黃色葡萄球菌。Shan等［23］通過基因工程在HBc上引入RGD靶向肽，再通過解聚-再組裝在RGD-HBc上加載吲哚菁綠（indocyanine green，ICG），從而實現(xiàn)U87MG腫瘤的靶向成像及光熱/光動力治療。

VNP內(nèi)腔外表面具有豐富的載物空間，可通過界面設(shè)計使VNP與納米材料共組裝，因而VNP可以遞送功能納米材料。通過VNP遞送納米材料，往往可以實現(xiàn)多功能整合。腺病毒表面修飾1.3 nm光熱轉(zhuǎn)換AuNP，使光熱治療和基因治療的聯(lián)合成為可能［145］。Zhang等［146］用HBc包裝四氧化三鐵（Fe3O4）納米顆粒，實現(xiàn)了對小鼠乳腺癌腫瘤的MRI及光熱治療。VNP的大小及形狀影響其活體中的運輸及清除行為，可根據(jù)應(yīng)用需求選擇合適的VNP［147］。生物活性物質(zhì)遞送是VNP的重要應(yīng)用領(lǐng)域，受限于篇幅，更多信息可參考文獻［1，45，79，148-150］。

3.4 疫苗與免疫調(diào)節(jié)劑

許多感染性疾病的病原是病毒。減毒活病毒、滅活病毒、VLP等可作為此類疾病的疫苗［151-153］。乙型肝炎及宮頸癌的疫苗就是基于病毒HBV及HPV的VLP［153］。利用化學(xué)/基因工程等修飾手段，VNP還可作為載體，用于呈遞其他病毒的抗原、癌癥抗原、免疫活性分子等，用于感染性疾病及癌癥的免疫治療［154-156］。VNP作為抗原載體，有利于提升抗原特異性中和抗體的滴度?；贖IV糖蛋白gp41的抗原表位連在AP205噬菌體上，可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的gp41特異性抗體［157］。抗原表位在載體上保持抗原的結(jié)構(gòu)特性，有利于產(chǎn)生更好的免疫保護效果［158］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的DS-Cav1三聚體疫苗結(jié)構(gòu)與人工設(shè)計的類VNP I53-50上的三聚體成分完美對接。每個I53-50納米球上可展示20個DS-Cav1三聚體，誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答比三聚體DS-Cav1高約10倍［圖4（a）］［159］。VNP表面多價高重復(fù)展示抗原有利于突破機體自身抗原免疫耐受。緊密連接蛋白18.2（claudin18.2，CLDN18.2）在多種腫瘤中高表達，在正常組織中的表達嚴格限制于胃黏膜中，是非常有潛力的腫瘤相關(guān)抗原。HBc表面展示CLDN18.2，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高度特異性自身抗體并抑制肺轉(zhuǎn)移瘤（CLDN18.2表達）的生長［160］。

VNP除遞送抗原肽，還可遞送編碼抗原或免疫活性分子的mRNA。MS2包裝前列腺酸磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP）-集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）mRNA，可誘導(dǎo)PAP特異性抗體及T細胞應(yīng)答，對小鼠前列腺腫瘤的生長具有抑制作用［133-134］。另外，某些VNP具有免疫調(diào)節(jié)劑的功能，可激活免疫系統(tǒng)，對和病毒無關(guān)的腫瘤具有治療作用。2016年，Steinmetz團隊［161］發(fā)現(xiàn)小鼠黑色素瘤、乳腺腫瘤、結(jié)腸腫瘤和卵巢腫瘤原位注射CPMV空殼，解除了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，使腫瘤的生長得到抑制甚至消除［圖4（b）］。隨后，研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯X病毒（potato X virus，PVX）［162］及木瓜花葉病毒（papaya mosaic virus，PapMV）［163］也表現(xiàn)出類似的免疫調(diào)節(jié)劑功能，具有抗腫瘤的效果。VNP裝載化療藥物、光熱治療及光動力治療活性物質(zhì)的能力，有利于發(fā)展免疫治療和其他療法聯(lián)合的抗腫瘤治療方案。

3.5 組織工程

圖4 VNP用作疫苗與免疫調(diào)節(jié)劑［159-161］Fig.4 VNPs as vaccines and immunomodulators［159-161］

在納米尺度上控制仿生基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和信號基序的裝載對于組織再生材料的功能設(shè)計非常重要。VNP具有良好的生物相容性，已被應(yīng)用于組織工程支架中，以指導(dǎo)細胞的生長、排列與分化。其中，棒狀或絲狀VNP可更好地模擬細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的形態(tài)，因而被用于開發(fā)ECM，參與組織工程。如M13表面高密度修飾細胞黏附基序RGD或IKVAV，定向組裝后形成液晶狀纖維支架，能夠控制神經(jīng)祖細胞的增殖、分化、生長方向［164］。神經(jīng)細胞在基于VNP的ECM上黏附、形態(tài)、增殖與分化，可通過調(diào)節(jié)VNP上修飾的細胞黏附基序、細胞因子等實現(xiàn)［165-166］。基于棒狀或絲狀VNP的ECM還被用于研究成骨分化。高密度展示RGD的M13填充入3D打印的生物陶瓷支架中，再植入間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）和骨缺損后，可誘導(dǎo)MSC的成骨分化和血管生成［167］。TMV摻入多孔硅藻酸鹽凝膠中，以實現(xiàn)多孔凝膠支架的功能化，通過調(diào)節(jié)VNP上修飾的生物信號分子類型，從而控制支架中細胞的黏附與成骨分化［168］?；赩NP的組織工程支架實現(xiàn)活體應(yīng)用，病毒的免疫原性及長期效應(yīng)需要探究。將TMV-RGD摻入型多孔硅藻酸鹽凝膠植入小鼠體內(nèi)，并沒表現(xiàn)出明顯毒性并且VNP可被降解。噬菌體填充支架表現(xiàn)出的生物相容性和可降解性，使其作為生物醫(yī)學(xué)支架材料更具可行性［169］。

3.6 納米反應(yīng)器

生物體系中存在大量的酶反應(yīng)微區(qū)（microcompartment），如羧酶體、乙醇胺利用微區(qū)、丙二醇利用操縱子等，這些微區(qū)把特定的酶促反應(yīng)限制在特定的區(qū)域中，實現(xiàn)分類管控，提高效率。受此啟發(fā)，VNP受限的內(nèi)腔可發(fā)展酶反應(yīng)器［170］。酶可通過基因工程、非共價相互作用（如核酸適配體、靜電相互作用）及共價相互作用（分選酶A介導(dǎo)）等方式包裝在VNP內(nèi)腔［78］。

VNP包裝酶的第一個優(yōu)勢是可對酶形成保護，增強對熱、pH、蛋白酶降解等條件變化的耐受性。肽酶E（peptidase E，PepE）包裝在Qβ內(nèi)腔，50℃30 min處理，仍保持100%活性，而游離PepE僅剩20%活性；Qβ包裝PepE用蛋白酶K處理20 h還剩80%活性，而游離PepE用蛋白酶K處理10 min僅剩20%活性［171］。P22包裝的磷酸三酯酶（phosphotriesterase）也具有更好的熱穩(wěn)定性和抗水解能力［172］。

VNP包裝酶的第二個優(yōu)勢是可實現(xiàn)對受限空間中酶促反應(yīng)特征的研究。通過解聚-再組裝可實現(xiàn)每個CCMV包裝一個辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），實現(xiàn)對單酶反應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)CCMV包裝的HRP與游離HRP的反應(yīng)特征不一樣，這是由于CCMV對底物的進入及產(chǎn)物運出的影響所致［173］。CCMV包裝的南極假單胞菌脂肪酶B（Pseudomonas antarcticalipase B，PalB）比游離酶有更高的活性，這可能是由于VNP內(nèi)腔極高酶濃度導(dǎo)致的，說明了小體積對于有效的多酶級聯(lián)催化的重要性［174］。P22內(nèi)腔支架蛋白上基因工程同時引入CelB、ATP依賴性半乳糖激酶（galactokinase，GALK）、ADP依賴性葡萄糖激酶（glucokinase，GLUK），實現(xiàn)3種酶包裝在P22內(nèi)腔。CelB催化形成的兩種產(chǎn)物恰好是GALK和GLUK兩種酶的底物，在P22內(nèi)腔形成代謝級聯(lián)反應(yīng)，GALK-GLUK-CelB-P22酶促轉(zhuǎn)化效率大于GLUK-CelB-P22或CelB-P22/GLUK-P22混 合 物（圖5）［175］。VNP包裝級聯(lián)酶，使一種酶的產(chǎn)物可以有效地作為下一種酶的底物，因而可提高反應(yīng)效率。

VNP包裝酶的第三個優(yōu)勢是可通過對VNP孔道的控制，實現(xiàn)對底物種類的篩選、對底物進入及產(chǎn)物輸出速度的控制，從而達到調(diào)控酶反應(yīng)的目的。如MS2通過解聚再組裝對帶有負電荷的堿性磷酸酶進行包裝，通過改變VNP外殼上孔道的電荷性質(zhì)能夠控制酶底物的進入從而影響反應(yīng)速度。在MS2孔道處引入負電荷抑制負電荷底物進入而抑制酶促反應(yīng)，引入正電荷促進負電荷底物進入而促進酶促反應(yīng)［176］。

VNP包裝酶還存在許多挑戰(zhàn)，如包裝效率、酶活、VNP孔道對有些底物太小對有些酶太大等問題。通過摸索包裝方式、控制包裝酶的個數(shù)等有望解決包裝效率及酶活問題。天然存在大量的VNP、通過進化修飾改造獲得大量工程化VNP，人工設(shè)計肽/蛋白質(zhì)組裝而成的類VNP，為酶促反應(yīng)提供了大量候選納米酶促反應(yīng)器，有望解決VNP孔道在酶促反應(yīng)中的問題。

圖5 基于VNP的酶納米反應(yīng)器［175］Fig.5 VNP-based nanoreactors for enzymatic reactions［175］

3.7 微電子元件

VNP蛋白骨架具有可編程、可控自組裝的特性，它們能夠作為模板對納米材料（金屬及其氧化物、半導(dǎo)體、石墨烯、碳納米管等）進行精準吸附，實現(xiàn)不同物理性質(zhì)的整合，形成精密微電子元件，可用于數(shù)據(jù)存儲器、電池電極等。

2006年Tseng等［177］在TMV表面修飾鉑納米顆粒（Pt nanoparticle，PtNP），并在聚乙烯醇基質(zhì)兩極之間形成一個三明治結(jié)構(gòu)，因此該納米材料能束縛住電子且具有雙穩(wěn)態(tài)特性，在關(guān)閉狀態(tài)具有低電導(dǎo)性，在打開狀態(tài)具有高電導(dǎo)性。類似地，修飾半導(dǎo)體QD的CPMV VNP也具有電學(xué)雙穩(wěn)態(tài)性［178］。一些早期工作將氧化還原活性物質(zhì)（如二茂鐵和紫羅堿）定位于CPMV骨架上，發(fā)現(xiàn)這種多價氧化還原活性納米顆粒具有多電子同時轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，說明位于CPMV骨架上的氧化還原單元之間是相互獨立且在反應(yīng)時不相互作用的［179-180］，這種材料可用作多電子儲存庫或者多電子轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)器。

病毒在微型電極材料的研發(fā)中也有獨特應(yīng)用價值。Nam等利用M13噬菌體作為模板生長氧化鈷（Co2O3）納米線，進而用作活性陽極材料，他們的工作表明病毒納米材料網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可用于生產(chǎn)具有全電化學(xué)功能和更大容量的電極材料［181-182］，當M13代替氧化錳（MnO）用作鋰-氧（Li-O）電池正極時展示出了更好的性能［183］。另外一個值得注意的以M13為模板的電極材料的例子是利用氧化銥作負極材料。Nam等［184］先將AuNP化學(xué)吸附于M13表面，然后再進行二氧化銥（IrO2）的礦化，IrO2-Au雜化納米線形成的多孔電極的電導(dǎo)性顯著增強。此外，M13形成的液態(tài)晶體還具有壓電效應(yīng)特質(zhì)。Lee等［185］在M13衣殼蛋白pVIII的N端引入谷氨酸殘基以與帶正電的C端產(chǎn)生更大的凈偶極矩，使該納米材料形成的薄膜的有效壓電系數(shù)得到顯著增強。

3.8 納米光子學(xué)

許多納米材料都具有可表征的光學(xué)性質(zhì)，當它們距離足夠近時，其光學(xué)性質(zhì)的相互作用可能產(chǎn)生新的性質(zhì)。2006年，Wang等［186］用蕪菁黃花葉病毒（turnip yellow mosaic virus，TYMV）VNP建立起一種用于時間分辨免疫熒光分析的原型結(jié)構(gòu)，采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，可發(fā)展基于多價修飾VNP的傳感器。2011年，Li等以SV40 VNP為骨架，構(gòu)建了一系列內(nèi)腔包裝QD、外表面展示AuNP的雜化組裝體（見2.4節(jié)），為定量研究AuNP和QD之間的光學(xué)相互作用現(xiàn)象提供了模型。實驗結(jié)果與理論預(yù)測一致表明AuNP對QD熒光具有強烈的累積猝滅效應(yīng)，而連接在VNP表面的AuNP之間僅存在微弱的表面等離子共振耦合效應(yīng)（圖6）［187］。而在另外一個實驗體系中，包裝在MS2 VNP內(nèi)腔的AuNP與修飾在VNP外表面的熒光染料之間呈現(xiàn)距離依賴性熒光增強效應(yīng)［188］。這些工作表明，得益于其精確可控的三維結(jié)構(gòu)，VNP在多功能納米材料的合成以及納米光子學(xué)基礎(chǔ)物理的探究中能夠發(fā)揮重要作用。

圖6 VNP用于納米光子學(xué)研究［187］Fig.6 VNPs for nanophotonics studies［187］

近年來，應(yīng)用于能源技術(shù)開發(fā)的仿生光合成系統(tǒng)引起了人們的極大興趣。與天然光合成系統(tǒng)類似，VNP能夠提供亞納米精度的發(fā)色團定位。棒狀VNP具有螺旋對稱性、周期性以及剛性，可作為構(gòu)建仿生光捕獲陣列的平臺。2007年，F(xiàn)rancis等［189］構(gòu)建了以TMV納米棒為模板的光捕獲體系。衣殼蛋白和不同的發(fā)色團連接后，它們共組裝形成了納米盤或者納米棒結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)出光轉(zhuǎn)移活性。在廣譜性光收集三發(fā)色團系統(tǒng)中，總效率超過90%。在雙發(fā)色團系統(tǒng)的皮秒時間分辨熒光實驗中，187 ps內(nèi)Oregon Green 488對Alexa Fluor 594的能量轉(zhuǎn)移效率為36%［190］。為了構(gòu)建幾何學(xué)上接近自然光合成系統(tǒng)的光捕獲結(jié)構(gòu)，Dedeo等［191］通過突變構(gòu)建了蛋白質(zhì)N端或者C端位于納米盤或棒中央的組裝體，為在內(nèi)孔修飾發(fā)色團提供了便利。發(fā)色團的朝向會影響光捕獲過程中能量的轉(zhuǎn)移，科學(xué)家通過引入一定數(shù)量的缺失突變來評估這種效應(yīng)，結(jié)果表明TMV納米棒狀系統(tǒng)相較于盤狀系統(tǒng)具有更高的光捕獲效率，原因在于供體到供體轉(zhuǎn)移途徑的延長［192］。這項工作為優(yōu)化人工光捕獲納米結(jié)構(gòu)提供了思路。此外，Majima等［193］以TMV為模板，以鋅（Zn）配位卟啉及自由堿基卟啉為供體和受體的實驗表明能量轉(zhuǎn)移效率還和骨架中基團的距離相關(guān)。

4 挑戰(zhàn)與展望

綜上所述，VNP已經(jīng)成為自組裝合成納米材料的重要組件。VNP的諸多特性（包括可控的自組裝、精確的三維結(jié)構(gòu)和空間可尋址性、高度均質(zhì)性、天然的生物相容性、易于基因工程/化學(xué)修飾、可規(guī)?；锖铣桑鹊龋?，使之成為廣受關(guān)注的基礎(chǔ)生物納米材料。本文詳細介紹了VNP的功能化策略及其在生物醫(yī)學(xué)成像、生物活性分子遞送、免疫調(diào)節(jié)劑與疫苗、組織工程、噬菌體展示、納米反應(yīng)器、生物傳感、微電子元件、納米光子學(xué)等各個領(lǐng)域的應(yīng)用。VNP在不同領(lǐng)域應(yīng)用的成熟度，差異很大，意味著病毒納米材料的發(fā)展還有很大空間，還有很多亟待解決的難題。VNP向臨床轉(zhuǎn)化的一個長期以來的挑戰(zhàn)是如何精準地調(diào)控VNP的免疫反應(yīng)及清除。VNP的免疫原性是把“雙刃劍”，在免疫治療時是有利的，而在活體成像和藥物遞送時卻是不利的。VNP表面PEG修飾、包被血清蛋白等“免疫隱身”策略，在一定程度上屏蔽了VNP的免疫原性，有利于實現(xiàn)VNP靶向遞送，但效果仍不甚理想。隨著成像手段及成像探針的發(fā)展，更準確深入地探索VNP的活體行為與命運，有助于指導(dǎo)VNP設(shè)計、推動相關(guān)技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化。VNP在組織工程、能源、納米反應(yīng)器、納米光子學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，對其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、動態(tài)控制、物質(zhì)交換控制等都有更高的要求。隨著對病毒結(jié)構(gòu)和組裝的更深入理解、自組裝蛋白質(zhì)材料理性設(shè)計技術(shù)的成熟以及高通量合成生物學(xué)手段的發(fā)展，人們對VNP的操控和制造能力有望獲得質(zhì)的提升，主要的應(yīng)用瓶頸將獲得突破，也將打開病毒納米材料廣泛應(yīng)用與轉(zhuǎn)化的新局面。