人工多細(xì)胞體系設(shè)計(jì)與構(gòu)建研究進(jìn)展

錢秀娟，陳琳，章文明，2，周杰，2，董維亮，2，信豐學(xué)，2，姜岷，2

（1南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京211816；2南京工業(yè)大學(xué)江蘇先進(jìn)生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心（SICAM），江蘇 南京211816）

通過傳統(tǒng)代謝工程手段提高單菌發(fā)酵性能，為大宗和高附加值化學(xué)品的高效生物合成提供了廣闊前景［1］。然而，在構(gòu)建工程菌株過程中，外源基因受到的排他性和基因沉默途徑的存在以及發(fā)酵過程需要的嚴(yán)格培養(yǎng)條件等因素，制約了生物制造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［2-3］。在自然環(huán)境中，99%以上的微生物無法通過傳統(tǒng)的技術(shù)進(jìn)行分離培養(yǎng)；天然微生物菌群通過在不同細(xì)胞間進(jìn)行勞動(dòng)分工，可完成復(fù)雜工作，且對(duì)復(fù)雜環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)性和穩(wěn)定性［4］。人類利用微生物混菌體系進(jìn)行生物發(fā)酵已經(jīng)有幾千年的歷史，如傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中奶酪和醬油的生產(chǎn)是由混合菌群發(fā)酵完成［5］。混菌體系具有的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)也正促使合成生物學(xué)的發(fā)展從基本模塊和元件的單菌底盤設(shè)計(jì)逐步走向從頭設(shè)計(jì)和構(gòu)建人工混菌體系［6］。近年來，研究人員已在微生物混菌體系的應(yīng)用潛力開發(fā)、菌群細(xì)胞的勞動(dòng)分工設(shè)計(jì)、細(xì)胞間信息互作機(jī)制解析以及微生物群落系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)模型開發(fā)等方面開展了大量的研究工作［7-21］（圖1）。

通過解析天然混菌體系的互作機(jī)制，指導(dǎo)理性設(shè)計(jì)與構(gòu)建系統(tǒng)魯棒和穩(wěn)定的人工混菌體系為合成生物學(xué)的網(wǎng)絡(luò)化與多功能化研究開辟了新的研究方向。在基因表達(dá)方面，復(fù)雜混菌體系為單細(xì)胞創(chuàng)造了獨(dú)特的生長(zhǎng)微環(huán)境，可能會(huì)激活常規(guī)單菌培養(yǎng)條件下的“沉默”基因簇，合成新的化學(xué)物質(zhì)，這為新藥的研究開發(fā)提供了廣闊資源［22］。此外，人體內(nèi)的微生物群落行為是影響人類健康的一個(gè)重要因素，人體內(nèi)數(shù)以萬億計(jì)的微生物伴隨著人類共同進(jìn)化，與人體共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜、和諧并具個(gè)體特性的共生系統(tǒng)，以適應(yīng)不斷變化的宿主生理［23］。在代謝路徑方面，多細(xì)胞體系采用“勞動(dòng)分工”的方法，減輕了單菌底盤的代謝負(fù)擔(dān)，適于完成更復(fù)雜的工作［24-25］。通過菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控可以實(shí)現(xiàn)代謝路徑的模塊化組裝和優(yōu)化；而在單菌底盤內(nèi)，代謝路徑的優(yōu)化需要通過一系列關(guān)于啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子和載體等復(fù)雜的基因編輯才能完成［9］。在系統(tǒng)魯棒性方面，多細(xì)胞體系集合了不同性狀、不同功能的細(xì)胞，細(xì)胞間的作用關(guān)系維持著動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)環(huán)境波動(dòng)具有更強(qiáng)適應(yīng)性和穩(wěn)定性，可在復(fù)雜環(huán)境下完成復(fù)雜功能［26］。目前，人工多細(xì)胞體系已在醫(yī)療、食品、化工、能源、環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，并且取得了一定的進(jìn)展。

目前，人工多細(xì)胞體系的研究還處于起步階段，在設(shè)計(jì)與構(gòu)建人工多細(xì)胞體系、提升現(xiàn)有多細(xì)胞體系的穩(wěn)定性和可控性等方面仍存在巨大挑戰(zhàn)。本文綜述了近年來人工多細(xì)胞體系在人體健康監(jiān)測(cè)、高附加值化合物合成、木質(zhì)纖維素的一體化生物加工以及環(huán)境生物修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用，重點(diǎn)介紹了人工多細(xì)胞體系的構(gòu)建策略與瓶頸、提升人工多細(xì)胞體系穩(wěn)定性和可控性等方面，為人工多細(xì)胞體系的構(gòu)建及應(yīng)用提供全面深入的剖析與指導(dǎo)。

1 混菌體系在新藥研發(fā)及人體健康監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用

圖1 多細(xì)胞體系研究進(jìn)展重要標(biāo)志成果時(shí)間軸Fig.1 A brief timeline for some key milestones in microbial consortia development

1929年，亞歷山大·弗萊明（Alexander Fleming）在Penicillium和Staphylococcus的混菌體系中發(fā)現(xiàn)了青霉素的存在，這被認(rèn)為是20世紀(jì)最有影響力的科學(xué)突破之一［12］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新型化合物在多細(xì)胞培養(yǎng)體系中被分離和鑒定。例如，共培養(yǎng)Fusarium tricinctum和F.begonia合成了對(duì)Escherichia coli、Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa具有抗菌性的抗生素物質(zhì)Subenniatins A and B［27］。共培養(yǎng)Streptomyces clavuligerus和S.aureusN315可以產(chǎn)生全霉素類抗生素物質(zhì)，而單培養(yǎng)這兩株菌都無法獲得此抗生素［28］。基因組測(cè)序技術(shù)以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，揭示真菌系統(tǒng)中超過90%次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的基因簇在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下處于“沉默”狀態(tài)［29］。例如Amyco-latopsis中的沉默糖肽簇［30］。有研究表明一些“沉默”基因簇的激活需要其他微生物分泌的一些激活因子的刺激［31］。表1總結(jié)了過去10年通過微生物混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的新型化合物，這些新物質(zhì)中大多都表現(xiàn)出抗菌特性，且只能通過混合培養(yǎng)獲得。近年來，抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥性致病菌株的數(shù)量在不斷增加，開發(fā)更多新型的抗生素刻不容緩［37］。多細(xì)胞體系的特性顯示了其在抗生素合成方面的潛力。

除了抗生素等新型物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，多細(xì)胞體系在臨床研究中也發(fā)揮著重要的作用。人體系內(nèi)的微生物與體細(xì)胞一樣豐富，且含有的基因要比人類基因組更加龐大復(fù)雜［38-39］。除了遺傳和環(huán)境因素外，人體微生物群體行為也是影響人類健康的另一個(gè)重要因素［22］。例如，腸道菌群已在個(gè)性化醫(yī)療中扮演重要角色，對(duì)于腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)展和動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要［40］。探究人體微生物間及微生物與人體組織間的作用機(jī)制是人體微生物組學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)，也是人體健康管理的重要方向。

2 “勞動(dòng)分工”實(shí)現(xiàn)復(fù)雜代謝路徑天然產(chǎn)物的合成

合成生物學(xué)和代謝工程在構(gòu)建和優(yōu)化模型微生物，如E.coli和Saccharomyces cerevisiae的代謝途徑以合成高附加值化學(xué)物方面取得了巨大進(jìn)展。而人工合成網(wǎng)絡(luò)規(guī)模和復(fù)雜程度的不斷增加，使得利用單菌兼容這些功能成為難題。例如，利用葡萄糖從頭合成紫杉醇需要35～51步。通過基因編輯獲得的E.coli工程菌株最高只能合成1.02 g/L紫杉二烯（紫杉醇的前體）［41］，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。多細(xì)胞體系的研究為這類復(fù)雜代謝路徑物質(zhì)的合成提供了新的借鑒和方法。通過理性設(shè)計(jì)與構(gòu)建人工多細(xì)胞培養(yǎng)體系，將代謝路徑分配組裝到多個(gè)獨(dú)立細(xì)胞，可減輕單菌的代謝負(fù)擔(dān)。并且，通過設(shè)計(jì)與優(yōu)化單個(gè)底盤細(xì)胞的代謝能力，可以實(shí)現(xiàn)各模塊的最佳組合［7］。

根據(jù)多細(xì)胞體系中的微生物組成，可將其分為原核與原核、真核與真核和原核與真核三類組合方式。在原核與原核多細(xì)胞體系中，E.coli是最常用的底盤細(xì)菌。例如，Zhang等［42］設(shè)計(jì)了一種新型E.coli-E.coli共培養(yǎng)體系，生產(chǎn)順，順黏康酸和4-羥基苯甲酸，這兩種化合物都是生產(chǎn)己二酸、對(duì)苯二甲酸、肉豆酸和香草醇等高值化合物的重要平臺(tái)中間體［43-44］。在這一研究中，第一株E.coli利用葡萄糖合成中間體3-脫氫莽草酸，該中間體隨后被第二株E.coli吸收轉(zhuǎn)化為順，順黏康酸或4-羥基苯甲酸。為了消除這兩個(gè)菌株之間的碳源競(jìng)爭(zhēng)，在第一個(gè)菌株中去除了磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，在第二個(gè)菌株中刪除了催化D-木糖和D-木果糖相互轉(zhuǎn)化的木糖異構(gòu)酶基因xylA。由此構(gòu)建的人工多細(xì)胞體系可以同時(shí)利用葡萄糖和木糖。該策略的應(yīng)用成功克服了代謝中間產(chǎn)物積累及底物利用效率低的難題。這一策略還被用于構(gòu)建利用葡萄糖和甘油混合物合成生物聚酰胺所需的原料尸胺［45］，以及利用葡萄糖和木糖混合物合成糖苷等人工多細(xì)胞體系中［46］。此外，Zhang等［47］通過將上游和下游途徑融合到兩個(gè)獨(dú)立的E.coli中，構(gòu)建了一個(gè)以甘油為唯一碳源的微生物菌群系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了兩種菌株的生長(zhǎng)和順，順黏康酸的產(chǎn)生。同樣，通過混合培養(yǎng)4-乙烯基酚或4-乙烯基兒茶酚合成基因工程菌與氰基-3-O-葡萄糖苷生產(chǎn)菌株，實(shí)現(xiàn)了紅酒色素吡喃花青素在E.coli中的首次合成［48］，相比于傳統(tǒng)的植物提取，該方法生產(chǎn)的吡喃花青素更加穩(wěn)定。此外，E.coli混合培養(yǎng)系統(tǒng)還被用于合成多種天然產(chǎn)物，如咖啡酰蘋果酸等酯化合物［49］、α-蒎烯等萜類化合物［50］、白藜蘆醇等多酚化合物［51］等。表2總結(jié)了人工多細(xì)胞體系在天然產(chǎn)物合成方面的最新研究成果。

表1 混合培養(yǎng)鑒定新的次生代謝物的最新研究Tab.1 Recent studies on mixed cultures identifying novel secondary metabolites

表2 人工多細(xì)胞體系在高附加值化合物生產(chǎn)中的最新研究成果Tab.2 Summary of recent progress in valuable compound production applying synthetic microbial consortia

續(xù)表

相比之下，關(guān)于真核-真核微生物混合培養(yǎng)的研究還較少。比較典型的例子是通過混合培養(yǎng)兩株工程Pichia pastoris，以甲醇為碳源，實(shí)現(xiàn)抗高膽固醇血癥的藥物莫納可林J和洛伐他汀的生物合成［57，69］?；炀囵B(yǎng)體系中，洛伐他汀和莫納可林J的產(chǎn)量分別達(dá)到250.8 mg/L和593.9 mg/L，與單一培養(yǎng)相比，洛伐他汀的生物合成能力提高了2.2倍，莫納可林J的生物合成能力提高了13.4%。

細(xì)菌與真核生物的跨物種混合培養(yǎng)用于天然產(chǎn)物的合成已取得一定進(jìn)展。Rodríguez-Bustaante等［70］分離到一個(gè)由酵母菌（Trichosporon asahii）和細(xì)菌（Paenibacillus amyllyticus）組成的微生物混菌體系，其中T.asahii負(fù)責(zé)將葉黃素裂解為β-紫羅蘭酮，而P.amyllyticus將β-紫羅蘭酮還原為7，8-二氫-β-紫羅蘭酮和7，8-二氫-β-紫羅蘭醇衍生物，這是煙草香氣中存在的化合物。在另一種工程E.coli和S.cerevisiae的跨種共培養(yǎng)體系中，以葡萄糖為唯一碳源獲得了2 mg/L的含氧紫杉烷（有效的化療藥物）［23］。在這一過程中，E.coli負(fù)責(zé)紫杉烯的上游從頭合成，隨后高效表達(dá)細(xì)胞色素P450的S.cerevisiae將紫杉烯轉(zhuǎn)化為含氧紫杉烷。然而，該混合培養(yǎng)體系中，S.cerevisiae代謝產(chǎn)出的乙醇對(duì)E.coli的生長(zhǎng)和紫杉烷的合成有顯著的抑制作用。為了優(yōu)化該體系的菌群結(jié)構(gòu)，研究人員設(shè)計(jì)了碳源互惠的方式，即木糖被E.coli消耗并轉(zhuǎn)化為乙酸，S.cerevisiae利用乙酸為碳源并將其轉(zhuǎn)化為含氧紫杉烷。經(jīng)過遺傳修飾后，最終獲得了33 mg/L的含氧紫杉烷。最近，Zhang等［68］構(gòu)建了E.coli和S.cerevisiae的交叉培養(yǎng)，內(nèi)源性酪氨酸途徑被導(dǎo)入E.coli，用于高水平生產(chǎn)酪氨酸，隨后由下游工程酵母轉(zhuǎn)化為柚皮素。最終以木糖為碳源轉(zhuǎn)化獲得了21.16 mg/L柚皮素，較酵母單菌發(fā)酵提高了8倍。

除了兩種微生物的相互作用外，研究者也設(shè)計(jì)了含有3種或3種以上菌株的復(fù)雜人工多細(xì)胞體系。比如，Liu等［64］設(shè)計(jì)了一種由E.coli、Bacillus subtilis和Shewanella.oneidensis組成的混菌體系用于微生物發(fā)電。在此過程中，E.coli首先轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)乳酸，乳酸作為碳源和電子供體被B.subtilis轉(zhuǎn)化為核黃素。最后，Shewanella.oneidensis轉(zhuǎn)化核黃素進(jìn)行產(chǎn)電。另一方面，Shewanella.oneidensis氧化乳酸生成醋酸鹽，可作為E.coli和B.subtilis的碳源。這3種菌株形成了一個(gè)交叉喂養(yǎng)的多細(xì)胞產(chǎn)電系統(tǒng)，11 mmol/L葡萄糖轉(zhuǎn)化可獲得約550 mV的穩(wěn)定電力并持續(xù)輸出15 d以上。此外，通過構(gòu)建一個(gè)由3株E.coli組成的多細(xì)胞系統(tǒng)，可用于迷迭香酸的非線性合成；與單一菌株培養(yǎng)相比，迷迭香酸的產(chǎn)量提高了38倍［66］。另一個(gè)多細(xì)胞體系的例子是花青素的從頭合成，該研究將苯丙酸、黃烷酮、黃烷-3-醇和花色苷生產(chǎn)過程中涉及的15個(gè)酶轉(zhuǎn)化步驟分配到4個(gè)獨(dú)立的E.coli中，實(shí)現(xiàn)了黃烷-3-醇的首次異源合成［65］。

雖然多細(xì)胞體系在天然產(chǎn)物的合成方面已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但如何將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。除了菌群結(jié)構(gòu)調(diào)控和培養(yǎng)條件的權(quán)衡優(yōu)化外，還有更多的實(shí)際問題需要考慮：①不同微生物組成的混合培養(yǎng)會(huì)引起一些次級(jí)代謝物的合成，給菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控、產(chǎn)品的下游分離帶來了更多挑戰(zhàn)；②多細(xì)胞體系內(nèi)，細(xì)胞之間的交流主要通過物質(zhì)和信號(hào)分子的傳遞起作用，如何提高這類物質(zhì)的傳遞和接收效率是提高多細(xì)胞體系運(yùn)作效率的關(guān)鍵；③多細(xì)胞體系內(nèi)細(xì)胞之間的交流是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，很難實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定生產(chǎn)［9］。因此，從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的角度來判斷多細(xì)胞體系的工業(yè)潛力還為時(shí)過早。更多的大規(guī)模試驗(yàn)，特別是長(zhǎng)期培養(yǎng)過程有待考察。

3 基于多細(xì)胞體系構(gòu)建的木質(zhì)纖維素一體化加工過程

木質(zhì)纖維素是世界上儲(chǔ)量最豐富的可再生資源，是生產(chǎn)生物燃料和化學(xué)品的理想原料。然而，木質(zhì)纖維素的生物煉制是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括糖化酶的生產(chǎn)、生物質(zhì)的降解以及己糖和戊糖的利用等多個(gè)步驟［71］。將這些步驟分開進(jìn)行將導(dǎo)致高成本和較長(zhǎng)的發(fā)酵周期。一體化生物加工過程（consolidated bioprocessing，CBP）通過利用一種微生物或微生物菌群同時(shí)完成水解酶的生產(chǎn)、生物質(zhì)原料的降解以及生物化學(xué)品的合成這三大功能，能夠顯著降低木質(zhì)纖維素原料降解轉(zhuǎn)化的成本［72-73］。傳統(tǒng)的CBP系統(tǒng)設(shè)計(jì)分為兩類：一是改造木質(zhì)纖維素利用菌株生產(chǎn)化學(xué)品［74-76］；二是在非木質(zhì)纖維素利用菌株中引入木質(zhì)纖維素降解酶［77-79］。然而，無論哪種策略，都無法避免繁重的基因編輯工作［80］。此外，很難找到能夠產(chǎn)生所有木質(zhì)纖維素降解酶的微生物［81］。目前，異源生產(chǎn)的木質(zhì)纖維素降解酶活性僅達(dá)到每升幾百個(gè)濾紙單位（FPU）［82-84］，而天然的木質(zhì)纖維素利用菌株，如Trichoderma reesei，其木質(zhì)纖維素降解酶活性可達(dá)到每升數(shù)萬個(gè)濾紙單位。

將多細(xì)胞體系應(yīng)用于一體化生物加工過程中，通過混合培養(yǎng)木質(zhì)纖維素降解菌株與目標(biāo)產(chǎn)品生產(chǎn)菌株，可克服傳統(tǒng)CBP的技術(shù)瓶頸（圖2）。通過共培養(yǎng)T.reesei和Lactobacillisp.可直接利用未解毒的經(jīng)水蒸氣預(yù)處理山毛櫸木材，生產(chǎn)19.8 g/L乳酸，相當(dāng)于理論最高產(chǎn)量的85.2%［85］。Buzzini［86］設(shè)計(jì)了以玉米糖漿低聚糖和糊精為原料生產(chǎn)類胡蘿卜素的Debaryomyces castellii和Rhodotorula glutinis共培養(yǎng)體系。D.castellii水解底物獲得的麥芽糖和葡萄糖，再經(jīng)R.glutinis轉(zhuǎn)化為類胡蘿卜素。在補(bǔ)料分批共培養(yǎng)系統(tǒng)中，以玉米糖漿為碳源可轉(zhuǎn)化獲得8.2 mg/L類胡蘿卜素。通過混合培養(yǎng)工程S.cerevisiae和降解纖維素的放線菌，可實(shí)現(xiàn)直接轉(zhuǎn)化未經(jīng)加工的生物質(zhì)，如柳枝稷、玉米秸稈、甘蔗渣和楊樹合成甲基鹵化物［87］。此外，Sgobba等［88］設(shè)計(jì)的E.coli和Corynebacterium glutamicum混菌體系，實(shí)現(xiàn)了從淀粉直接生產(chǎn)L-賴氨酸及其衍生物。在這一過程中，來自灰鏈霉菌的α-淀粉酶被異源引入E.coli，使其可以利用淀粉作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝。E.coli水解淀粉所產(chǎn)生的葡萄糖繼而用于培養(yǎng)C.glutamicum。另一方面，E.coli為賴氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，C.glutamicum合成并分泌的賴氨酸才能存活。E.coli和C.glutamicum菌形成了一個(gè)互惠共生的穩(wěn)定的人工雙細(xì)胞體系。

CBP人工多細(xì)胞體系目前主要用于能源物質(zhì)的生產(chǎn)，如生物乙醇、生物丁醇、微生物脂質(zhì)和氫氣等。對(duì)于生物乙醇的生產(chǎn)，Patle和Lal［89］利用Zymomonas mobilis和Candida tropicalis的混菌體系轉(zhuǎn)化酶解后的木質(zhì)纖維素合成乙醇，收率高達(dá)97.7%。T.reesei、S.cerevisiae和Scheffersomyces stipitis的混合培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)纖維素酶生產(chǎn)以及己糖和戊糖同時(shí)利用，以未經(jīng)脫毒的稀酸預(yù)處理后的麥草漿為底物可直接用于乙醇的生產(chǎn)［90］。原核與原核、原核與真核以及真核與真核用于生物乙醇、生物丁醇和異丁醇生產(chǎn)的CBP人工多細(xì)胞體系都已相繼報(bào)道［89，91-93］。Clostridium beijerinckii和C.cellulovorans組成的人工混菌體系，可轉(zhuǎn)化未經(jīng)生物處理的麥草生產(chǎn)3.7 g/L乙醇、14.2 g/L丁醇和5.4 g/L丙酮［94］。在微生物脂質(zhì)生產(chǎn)方面，Papone等［95］通過共培養(yǎng)Chlorellasp.KKU-S2和Toluraspora globosaYU5/2，以甘蔗糖蜜為底物時(shí)，細(xì)胞生物量達(dá)到6.90 g/L，油脂產(chǎn)量達(dá)到0.33 g/L。此外，研究人員也設(shè)計(jì)和構(gòu)建了CBP人工多細(xì)胞體系用于沼氣發(fā)酵和生物氫生產(chǎn)［96-98］。

圖2 木質(zhì)纖維素一體化生物加工人工多細(xì)胞體系Fig.2 Schematic illustrations of consolidated bioprocessing strategy for lignocellulose biorefinery using microbial consortia

底物降解速率是CBP過程中的關(guān)鍵限速步驟。加快木質(zhì)纖維素的降解，提高單糖的供給速率是提高CBP降解轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。木質(zhì)纖維素具有非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，單一的微生物菌株無法有效地分泌降解木質(zhì)纖維素的所有酶組分。據(jù)報(bào)道，微生物共培養(yǎng)可以增加纖維素酶和半纖維素酶復(fù)合體的產(chǎn)量［99］。例如，共培養(yǎng)A.ellipticus和A.fumigatus提高了纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量［100］。Pleurotus ostreatus和Phanerochaete chrysosporium的混合培養(yǎng)體系中，木質(zhì)素分解酶的產(chǎn)量也得到提高［101］。A.oryzae與其他真菌，特別是與P.chrysosporium混合后，α-纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和漆酶的活性都得到了提升［102］。多細(xì)胞體系降解酶的總活性并不是單個(gè)細(xì)胞提供的降解酶活性的總和，甚至?xí)^這個(gè)總和。因此，共培養(yǎng)木質(zhì)纖維素降解菌群可以進(jìn)一步提升木質(zhì)纖維素的降解速率。

4 多細(xì)胞體系強(qiáng)化環(huán)境生物修復(fù)

人口的迅速增長(zhǎng)帶來了一系列環(huán)境問題，如水質(zhì)惡化、重金屬污染和可溶性磷的損失等［103-105］。生物修復(fù)技術(shù)，即利用特定的微生物吸收、轉(zhuǎn)化、清除和降解環(huán)境污染物，從而清除環(huán)境中的污染物，已在環(huán)境修復(fù)方面取得了一定的成果［106］。然而，利用單一菌株對(duì)環(huán)境中的復(fù)雜污染物進(jìn)行生物降解的效率仍然很低且受到諸多限制［107］。因此，理性設(shè)計(jì)與構(gòu)建魯棒性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的人工多細(xì)胞體系用于生物修復(fù)受到越來越多的關(guān)注。

針對(duì)水質(zhì)的富營(yíng)養(yǎng)化問題，主要的任務(wù)是去除氮元素、磷元素、污染物和毒素等［108］。目前，污水處理的生物工藝包括厭氧消化、硝化和反硝化3個(gè)環(huán)節(jié)，并經(jīng)過多輪循環(huán)處理才能達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)，而每一個(gè)環(huán)節(jié)的處理都需要配備多個(gè)處理池以及大量活性污泥，工藝復(fù)雜，成本投入高［109］。相比之下，微藻群落（微藻和細(xì)菌/真菌）為水體修復(fù)提供了一種有效可行的途徑。與僅使用硝化菌相比，共培養(yǎng)Scenedesmus dimorphus和硝化菌可使廢水中氮元素和磷元素的去除率分別提高3.4倍和6.5倍［110］。微藻Chlorella vulgaris和細(xì)菌P.putida的共培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（氮、磷）和化學(xué)需氧量（COD）的去除效率較單菌培養(yǎng)都提升顯著［111］。利用Scenedesmussp.和厭氧污泥共培養(yǎng)對(duì)淀粉廢水進(jìn)行處理，氮和磷的去除率分別達(dá)到89%和80%［112］。從共生關(guān)系來看，微藻通過光合作用釋放有機(jī)物和O2，而細(xì)菌/真菌可以利用這些有機(jī)物和O2作為碳源和能源物質(zhì)。同時(shí)，細(xì)菌/真菌為微藻提供CO2和生長(zhǎng)促進(jìn)因子，如維生素和鐵離子（圖3）［113-114］。在實(shí)現(xiàn)污水修復(fù)的同時(shí)，收獲的生物質(zhì)還可用作生物燃料、生物化學(xué)品和動(dòng)物飼料生產(chǎn)的原料［115-117］。盡管微藻與細(xì)菌/真菌共生系統(tǒng)展現(xiàn)了諸多優(yōu)勢(shì)，但可用的土地、足夠的光照和適當(dāng)?shù)臏囟热匀粐?yán)重限制了此生物修復(fù)技術(shù)在廢水處理方面的應(yīng)用［118］。此外，微藻的回收與處理技術(shù)還不成熟，需要很高的能量投入［118］。為了更好地發(fā)展微藻菌群的生物修復(fù)技術(shù)，還需設(shè)計(jì)功能更強(qiáng)大的設(shè)備和開發(fā)更有效的回收技術(shù)。

重金屬，如鋅和鎳，會(huì)引起核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，從而被認(rèn)為是最危險(xiǎn)的污染物。盡管已發(fā)現(xiàn)多種具有不同金屬元素去除潛力的微生物［119-120］，但由于廢水中成分的復(fù)雜多樣，使用單一菌株進(jìn)行金屬去除效率低下。多細(xì)胞體系中含有多種魯棒的金屬去除菌株，可以實(shí)現(xiàn)金屬的多元同步去除。例如，Scenedesmus quadricauda和Pseudokirchneriella subcapitata共培養(yǎng)能夠去除污水中的Zn2+和Ni2+［121］。Ilamathi等［122］采用海藻酸鈉微珠固定化混合培養(yǎng)酵母與銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌或E.coli，銅、鎘、鉻和鎳的回收率分別達(dá)到了84.62%、67.17%、49.25%和61.02%。

偶氮染料是最常用的一類化學(xué)染料，也是一類重要的環(huán)境污染物［123］。普通的物理和化學(xué)方法很難對(duì)這些染料進(jìn)行脫色［124］。雖然特定微生物可以降解偶氮染料，但其降解產(chǎn)物往往是有毒的芳香胺或比母體染料更難降解的代謝物［125］。而人工多細(xì)胞體系可通過協(xié)同代謝實(shí)現(xiàn)更高程度的生物降解和礦化［126］。例如，橙色二號(hào)可以被Enterobacter cloacae和Enterococcus casseliflavus的菌群完全脫色，而E.cloacae和E.casseliflavus單菌對(duì)其脫色率分別只有10%和23%［127］。Proteus vulgaris和Micrococcus glutamicus混合培養(yǎng)體系可以在3 h內(nèi)完成對(duì)猩紅R的完全脫色，而采用P.vulgaris和M.glutamicus單菌對(duì)其進(jìn)行脫色的時(shí)間分別為14 h和20 h［128］。P.vulgaris和Micrococcus glutamicus的混菌體系對(duì)磺化活性染料綠HE4BD的脫色率也顯著高于使用單菌培養(yǎng)［129］。

圖3 廢水處理過程中微藻與細(xì)菌/真菌的共生關(guān)系Fig.3 Symbiotic relationship between microalgae and bacteria/fungi during wastewater treatment

多細(xì)胞體系在降解其他污染物，如殺蟲劑、抗生素和其他毒素方面也顯示出獨(dú)特的能力。例如，假單胞菌和葡萄球菌共培養(yǎng)比單獨(dú)培養(yǎng)更能有效去除苯酚［130］。Serratia和Trichosporonsp.的共培養(yǎng)，可以完全礦化有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱［131］。類似 地，Arthrobactersp.NB1、Serratiasp.NB2和Stenotrophomonassp.NB3NB1組合與單一培養(yǎng)相比，硝基苯的降解效率更高［132］。有研究表明，多細(xì)胞體系對(duì)多環(huán)芳烴（PAH）的去除效率也高于單一培養(yǎng)物［133］。

5 多細(xì)胞體系內(nèi)的信號(hào)交互機(jī)制

為深入探究多細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞間的信息互作機(jī)制，還需從信號(hào)分子、物理接觸以及基因突變等方面進(jìn)行深入研究。微生物可以產(chǎn)生并分泌一些關(guān)鍵信號(hào)化合物，如N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）和小肽，在“群體感應(yīng)”（quorum sensing，QS）中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和表觀遺傳修飾物調(diào)控微生物的生物學(xué)功能［134］。AHL是革蘭氏陰性菌群內(nèi)的主要信號(hào)分子［135］。當(dāng)環(huán)境中的AHL濃度達(dá)到閾值水平，它們會(huì)激活LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。LuxR/AHL復(fù)合物可以激活多個(gè)基因的表達(dá)，其中包括負(fù)責(zé)合成AHL的基因［134］。該QS調(diào)控機(jī)制已成功應(yīng)用于E.coli-E.coli的混合培養(yǎng)中，通過控制細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡速率，可實(shí)現(xiàn)菌群內(nèi)部結(jié)構(gòu)的可控調(diào)節(jié)［136-138］，或減少物種之間的底物競(jìng)爭(zhēng)［8］。在革蘭氏陽性菌群內(nèi)，一些小肽物質(zhì)（或叫自身誘導(dǎo)肽，autoinducing peptide，AIP）是主要的QS分子［135，139］。與AHL不同，這些小肽在序列和結(jié)構(gòu)上各不相同，且需要通過專門的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行分泌和吸收［140］。AIP調(diào)控的QS系統(tǒng)通常采用一種雙組分的基因調(diào)控機(jī)制——膜結(jié)合的AIP受體組氨酸激酶（HK）和DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)器。當(dāng)環(huán)境中的AIP達(dá)到一定濃度后，就會(huì)被HK受體磷酸化并導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。磷酸化的AIP會(huì)結(jié)合到目標(biāo)DNA上以調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄［140］。QS交流模式不僅存在于同屬性的微生物間，在真核微生物和原核微生物之間，也存在QS傳遞系統(tǒng)。例如，通常在真菌/細(xì)菌混合培養(yǎng)系統(tǒng)中可發(fā)現(xiàn)苷色酸衍生物，苷色酸在真菌和細(xì)菌的信息交流過程中也扮演著重要的角色［141-142］。綜上所述，通過理性設(shè)計(jì)與構(gòu)建菌群內(nèi)QS信號(hào)分子生產(chǎn)者和接受者，可實(shí)現(xiàn)菌群結(jié)構(gòu)的可控調(diào)節(jié)。

上述QS分子都是在環(huán)境中自由擴(kuò)散并通過濃度響應(yīng)機(jī)制實(shí)現(xiàn)信息的傳遞，而有些QS分子的運(yùn)輸需要借助特殊的傳播載體。例如，長(zhǎng)鏈AHL等疏水信號(hào)需要通過膜泡（membrane vesicle，MV）完成在細(xì)胞間的傳遞［143］。而在某些情況下，信息的交互還依賴于菌群內(nèi)細(xì)胞的密切接觸。典型的案例就是A.nidulans與放線菌的密切接觸促使了聚酮化合物的合成［142］。在基因?qū)用?，混菌培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致基因丟失、組蛋白修飾和水平基因轉(zhuǎn)移等一系列基因表型變化。例如，Streptomyces clavuligerus與Staphylococcus aureusN315共培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致S.clavuligerus中一個(gè)占基因組大小21%的1.8 Mbp的質(zhì)粒丟失。而另一方面，S.clavuligerus獲得了合成全霉素的能力［28］。推測(cè)認(rèn)為，S.clavuligerus基因片段的缺失減輕了細(xì)胞代謝過程中基因復(fù)制和表達(dá)的負(fù)擔(dān)。作為回報(bào)，沉默的全霉素合成途徑被特異性地激活。細(xì)菌也可以通過主要的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（Saga/Ada）誘導(dǎo)組蛋白修飾來改變真菌基因的表達(dá)［144］。一般來說，組蛋白乙?；c轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，因而可調(diào)節(jié)基因表達(dá)。此外，基因水平轉(zhuǎn)移也是菌群信息交流的常見現(xiàn)象?；蚪M分析顯示，Rhodococcus307CO在微生物組合系統(tǒng)中含有一個(gè)來自鏈霉菌的較大DNA片段，導(dǎo)致產(chǎn)生新的紅鏈霉素A和B的異構(gòu)體抗生素［145］。

微生物群體內(nèi)部的信息交互是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。目前，最有效的途徑是通過表征微小混菌體系，降低其復(fù)雜性，并通過檢測(cè)特定的中間代謝物或引入報(bào)告菌株，構(gòu)建具有代表性的混菌模型庫。相應(yīng)地，先進(jìn)的預(yù)測(cè)和分析技術(shù)，如宏基因組學(xué)、系統(tǒng)生物成像質(zhì)譜、微流控技術(shù)、細(xì)胞分離和打印、高通量培養(yǎng)等技術(shù)的發(fā)展，也可指導(dǎo)混菌體系的理性設(shè)計(jì)、構(gòu)建與調(diào)控。

6 人工多細(xì)胞體系的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

當(dāng)前的人工多細(xì)胞體系研究還比較簡(jiǎn)單，通常只是共培養(yǎng)兩種或三種微生物。此外，共培養(yǎng)體系的構(gòu)建還相對(duì)隨機(jī)，體系的構(gòu)建及研究尚處于初期嘗試階段，缺乏理論指導(dǎo)。設(shè)計(jì)與構(gòu)建一個(gè)系統(tǒng)魯棒、穩(wěn)定和可控的人工多細(xì)胞體系需要經(jīng)歷構(gòu)建、調(diào)控、重構(gòu)和強(qiáng)化等多個(gè)階段，逐級(jí)解決每個(gè)階段面臨的挑戰(zhàn)是多細(xì)胞體系研究最有效的方式。

如何實(shí)現(xiàn)不同菌種在同一個(gè)封閉系統(tǒng)內(nèi)的穩(wěn)定共存是構(gòu)建多細(xì)胞體系的前提。多細(xì)胞體系內(nèi)的各類細(xì)胞通常具有不同的生長(zhǎng)特性，如溫度、pH和氧濃度等。為了協(xié)調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)條件的不匹配等情況，采用順序接種培養(yǎng)以滿足不同菌株對(duì)于生長(zhǎng)條件（如溫度和pH）的需求是最常用的方法［146］。然而，順序培養(yǎng)導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)品生產(chǎn)強(qiáng)度降低。近年來，采用生物材料或特殊的發(fā)酵設(shè)備為菌群內(nèi)的細(xì)胞創(chuàng)造獨(dú)立適合的微環(huán)境，平衡多細(xì)胞體系內(nèi)個(gè)體細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝環(huán)境，已受到越來越多的關(guān)注。例如，微囊和液滴微流控技術(shù)已被用于為單個(gè)細(xì)胞創(chuàng)造相對(duì)最佳的生長(zhǎng)微環(huán)境，每個(gè)細(xì)胞在空間上獨(dú)立培養(yǎng)，避免造成交叉影響［147-148］。此外，在生物反應(yīng)器中設(shè)計(jì)一個(gè)進(jìn)氣口，其上包裹一層致密的氣體滲透膜或其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的選擇透過性膜，可以實(shí)現(xiàn)氣體或營(yíng)養(yǎng)成分的梯級(jí)分布，實(shí)現(xiàn)體系內(nèi)各類細(xì)胞的有序分布和培養(yǎng)［149］。

合理的菌群結(jié)構(gòu)和底物分配是實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞體系穩(wěn)定高效運(yùn)作的關(guān)鍵。調(diào)整菌群內(nèi)不同細(xì)胞的接種量和接種時(shí)間是調(diào)整種群結(jié)構(gòu)最直接、最有效的方法。然而，如果多細(xì)胞體系補(bǔ)給相同的碳源時(shí)，會(huì)存在底物競(jìng)爭(zhēng)，這將導(dǎo)致每個(gè)物種在菌群中的生長(zhǎng)不受控制。目前，常用的思路是設(shè)計(jì)幾條平行代謝路徑，使菌群內(nèi)不同細(xì)胞專一性地利用不同的碳源，減輕底物造成的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)。例如，在不同的微生物中分別構(gòu)建只利用戊糖和己糖的代謝途徑［33］。這不僅可以消除底物競(jìng)爭(zhēng)，而且可以實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素水解液中混合糖的同步利用。另一種途徑是構(gòu)建基質(zhì)和中間體的順序利用模式。例如，單糖可以首先被第1種微生物代謝成中間代謝物，如乙酸等。然后，無單糖利用能力的另一菌株可以以這些中間代謝物為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，并合成最終目標(biāo)化學(xué)品［23］。近年來，隨著對(duì)不同菌種間信號(hào)傳遞機(jī)制的深入了解，通過QS響應(yīng)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控菌群的結(jié)構(gòu)已被證實(shí)可行［138］。

高效的傳質(zhì)，包括中間體、能量和輔因子是提升多細(xì)胞體系產(chǎn)品合成效率的關(guān)鍵。與單一細(xì)胞工廠不同，在多細(xì)胞體系內(nèi)，第一個(gè)細(xì)胞代謝的產(chǎn)物可能是下一個(gè)細(xì)胞的底物。因此，這類物質(zhì)需要穿過多種膜組織，這也增加了物質(zhì)傳遞的難度。近期，時(shí)空有序分布這一概念在多細(xì)胞體系的研究中備受關(guān)注。有序的空間分布可以有效調(diào)控菌群的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，提升物質(zhì)、能量和信號(hào)的傳遞效率，提升菌群對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性［150-151］。事實(shí)上，這種3D菌群結(jié)構(gòu)廣泛存在于自然環(huán)境中。多種微生物共存的厭氧污泥顆粒就是自然界中3D菌群的一個(gè)典型案例。產(chǎn)酸菌被包裹在顆粒外面，將復(fù)雜的大分子有機(jī)物分解成有機(jī)酸，這些有機(jī)酸隨后被位于中間層的乙酸菌轉(zhuǎn)化為H2。外層產(chǎn)生的H2和CO2會(huì)被最里層的產(chǎn)甲烷菌消耗轉(zhuǎn)化為甲烷［152］。在這一體系中，微生物創(chuàng)造了三層球狀的菌群結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的按需供給、代謝物的高效傳遞和菌群的“集團(tuán)作戰(zhàn)”能力。

3D菌群的構(gòu)建可通過自組裝和人工組裝兩種方式完成。自組裝可以在不使用任何結(jié)合劑的情況下將核心細(xì)胞固定在另一微生物形成的基質(zhì)中。典型的例子是由細(xì)菌Acetobacter aceti和光合微藻Chlamydomonas reinhardtii組成的菌群［153］。在這個(gè)系統(tǒng)中，當(dāng)A.aceti在液體培養(yǎng)中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)在空氣與水界面產(chǎn)生醋酸纖維墊，這種材料可以捕獲C.reinhardtii并為其生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，并為A.aceti提供氧氣［153］。另一個(gè)例子是廣泛存在的生物膜，通常是微生物為了適應(yīng)惡劣的環(huán)境條件聚集形成的［154］。在生物膜中，細(xì)菌生活在自身產(chǎn)生的親水的胞外聚合物（EPS）中，并自我組裝形成一個(gè)協(xié)調(diào)的功能群落。在這個(gè)群落中，細(xì)胞可以分享營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并免受環(huán)境中有害因素的影響［155］。至于人工組裝策略，可以通過設(shè)計(jì)智能設(shè)備或材料來幫助通過細(xì)胞進(jìn)行空間排列［156］。例如，微流控和微孔裝置已被用于3D菌群的構(gòu)建。此外，通過材料介導(dǎo)，在保證中間物質(zhì)自由交換的前提下為單個(gè)物種創(chuàng)造分隔的生長(zhǎng)空間也是未來的重點(diǎn)研究方向［157］。例如，利用噴墨打印細(xì)胞和明膠的多光子3D打印技術(shù)，已被用于構(gòu)建具有更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞體系［24，158］。

開發(fā)先進(jìn)的計(jì)算分析工具預(yù)測(cè)群落行為是多細(xì)胞體系研究的另一重要方向［54，148］。Minty等［82］設(shè)計(jì)了一個(gè)由50個(gè)參數(shù)組成的方程模型來描述和預(yù)測(cè)E.coli和T.reesei的共生行為，這一模型可以識(shí)別木質(zhì)纖維素生產(chǎn)異丁醇過程中的關(guān)鍵參數(shù)，并對(duì)共培養(yǎng)的穩(wěn)定性進(jìn)行深入評(píng)估，從而為多細(xì)胞體系內(nèi)復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的研究與調(diào)控提供更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)化分析和指導(dǎo)。因此，菌群內(nèi)部作用機(jī)理的建模、功能載體材料的引入以及分析預(yù)測(cè)計(jì)算模型的開發(fā)將成為未來微生物多細(xì)胞體系研究的重要方向。

7 展望

多細(xì)胞體系通過：①將產(chǎn)物的合成路徑分模塊分工到幾個(gè)細(xì)胞中，減輕了單個(gè)細(xì)胞的工作壓力；②實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞間物質(zhì)、信號(hào)和能量的交換與傳遞，促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物代謝合成；③組合多種功能細(xì)胞，提高了群體對(duì)復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)性和魯棒性，以完成更加復(fù)雜的工作。鑒于此，多細(xì)胞體系正在醫(yī)藥、制造、環(huán)保、能源等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。但目前人工多細(xì)胞體系的構(gòu)建與應(yīng)用仍存在一些局限性。通過培養(yǎng)過程的優(yōu)化、QS的應(yīng)用、時(shí)空有序3D菌群結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)以及多細(xì)胞體系計(jì)算分析工具的開發(fā)與模型的構(gòu)建等策略，從雙菌、三菌等簡(jiǎn)單的多細(xì)胞體系入手，針對(duì)性地解決共生、合作和發(fā)展（work together，work better and work best）三個(gè)階段所面臨的挑戰(zhàn)，是今后人工多細(xì)胞體系的主要研究方向。隨著人們對(duì)生命系統(tǒng)認(rèn)知的逐漸提升以及生物技術(shù)的不斷發(fā)展，在可預(yù)見的未來，設(shè)計(jì)與構(gòu)建穩(wěn)定、魯棒和可控的人工多細(xì)胞體系將在更多領(lǐng)域得到應(yīng)用，成為合成生物學(xué)發(fā)展的新的重要方向。