中藥復(fù)方脊髓康促進脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的實驗研究

邵陽 楊俊鋒 馬勇 徐辰 董赟 吳毛 王善付 殷杰 張素 王建偉

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)常見于嚴(yán)重脊柱外傷后，近些年數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)生概率逐年上升。脊髓損傷的發(fā)生涉及到機體各個系統(tǒng)，且并發(fā)癥復(fù)雜、嚴(yán)重，治療療程長、所需費用高，效果也不甚滿意，目前也沒有有效方法可恢復(fù)脊髓損傷后的運動功能。因此，極高的致殘率、不理想的復(fù)健效果給自身及國家?guī)砹顺林刎?fù)擔(dān)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療脊髓損傷方面，有較好的療效，中藥復(fù)方脊髓康是其中的代表制劑。研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方脊髓康在能夠清除氧自由基、改善損傷局部的炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)其免疫應(yīng)答、減少細(xì)胞凋亡，有效改善神經(jīng)生長環(huán)境，促進脊髓神經(jīng)元的再生[1-3]。

研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AS)，是目前促進脊髓損傷復(fù)健的熱點。當(dāng)脊髓損傷發(fā)生時，AS相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidicprotein，GFAP)高度表達，從而對神經(jīng)再生產(chǎn)生物理屏障；活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞還可以分泌抑制性的細(xì)胞外基質(zhì)分子如硫酸軟骨素蛋白聚糖(Chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)等一大類蛋白多糖，抑制損傷后神經(jīng)再生，從而對神經(jīng)再生產(chǎn)生一種化學(xué)障礙，因此如何抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞，成為促進脊髓神經(jīng)功能修復(fù)的關(guān)鍵。我們擬建立脊髓損傷大鼠模型，設(shè)立不同組別，研究中藥復(fù)方脊髓康對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，觀察GFAP在不同治療組中的表達程度。

1 材料與方法

1.1 大鼠及藥物制備

清潔級雌性SD大鼠，120只，體重220～300 g。無錫市血液病防治研究所提供，大鼠生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2017-0007，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

中藥復(fù)方脊髓康為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無錫附院的傳統(tǒng)經(jīng)驗方(國家發(fā)明專利號：ZL200910026193.7)，實驗用藥由無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科煎制，分為高、中、低三種濃度湯劑(2.5 g/mL、1.25 g/mL、0.625 g/mL)。冷藏備用。處方：生黃芪30 g、丹參20 g、川芎10 g、赤芍12 g、當(dāng)歸尾12 g、水蛭10 g、蜈蚣1條、制大黃10 g、澤瀉10 g、茯苓10 g、枳實10 g、厚樸10 g、肉蓯蓉10 g、淫羊藿10 g、地鱉蟲10 g、車前子包15 g、益智仁10 g。

1.2 實驗動物分組

共120只SD大鼠，隨機分配，共六組，每組20只(選取標(biāo)本時、隨機挑選10只)。包括假手術(shù)組、模型組、脊髓康不同劑量組(高濃度、中濃度、低濃度)和強的松組。

1.3 模型制備

本方案采用改良Allen法打擊大鼠T9-T11節(jié)段脊髓。成功造模，可見大鼠脊髓局部組織充血水腫，下肢肌肉痙攣、抽動，直至癱瘓。所有實驗SD大鼠，積極預(yù)防感染，術(shù)后1～3天，予青霉素腹腔注射。加強護理，每日兩次按摩膀胱，促進排尿。加強觀察，預(yù)防術(shù)后并發(fā)癥、降低死亡率。

1.4 標(biāo)本采集

各組大鼠分別于3天、7天、14天三個時間點組，進行標(biāo)本采集。以脊髓損傷大鼠造模損傷區(qū)為中心，逐層切開、分離肌肉組織，取出病損區(qū)域脊髓組織，10 mm左右，免疫組化實驗取材后，放置于福爾馬林溶液4℃冰箱保存。RT-PCR實驗取材后，即刻送回實驗室，-70℃冰箱保存。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 斜板實驗、肌力檢測評價 斜板實驗：將SD大鼠置于傾斜木板頂端，觀察其下落角度。以其能夠靜止于板上的最大角度為指標(biāo)；隨機抽取3只SD大鼠，在規(guī)定時間點，完成斜板實驗測試。肌力：按改良的Tarlov標(biāo)準(zhǔn)評價脊髓損傷后肌力情況；分為五個等級：1分，大鼠后肢未見肌肉收縮；2分，大鼠后肢可見肌肉收縮，無關(guān)節(jié)活動；3分，后肢肌肉收縮、無法站立；4分，能站立，但行走不能；5分，大鼠后肢肌力正常。各組大鼠術(shù)前均為5分。隨機抽取3只SD大鼠，在規(guī)定時間點，完成肌力測試。

1.5.2 免疫組化法觀察GFAP的表達 按照實驗步驟，取得各時間點標(biāo)本，行組織梯度脫水、浸蠟、包埋等處理。行標(biāo)本切片，隨機選取3份樣本用于檢測。對切片洗滌、加入抗體、增強、復(fù)染等相關(guān)操作后，運用高倍顯微鏡觀察染色的陽性表達情況。

1.5.3 RT-PCR法測定脊髓組織中GFAP mRNA表達 由生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物設(shè)計并合成，經(jīng)BLAST引物驗證并預(yù)實驗檢測，熔解曲線均為單一峰形，未見其他峰值。具體序列見表1。

表1 基因序列表

由相關(guān)公司進行引物設(shè)計并合成，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書，按照qRT-PCR反應(yīng)體系加樣、操作，按兩步法進行PCR反應(yīng)程序。以管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，分析GFAP在脊髓組織中的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 中藥方對SCI大鼠斜板實驗數(shù)據(jù)的影響

實驗結(jié)果表明，脊髓損傷大鼠經(jīng)中藥復(fù)方脊髓康治療后，術(shù)后第7天起脊髓康(中、高劑量組及強的松組)斜板實驗數(shù)據(jù)較模型組明顯增加(P<0.05)。第14天各給藥組大鼠斜板實驗數(shù)據(jù)較模型組明顯增加(P<0.05)，中藥各劑量組治療效果與強的松組相似。見表2。

表2 各組大鼠脊髓斜板實驗數(shù)據(jù)

2.2 中藥復(fù)方脊髓康對脊髓損傷大鼠雙后肢神經(jīng)功能評分的影響

實驗結(jié)果表明，脊髓損傷大鼠經(jīng)中藥復(fù)方脊髓康治療后，術(shù)后第7天及第14天雙后肢神經(jīng)功能評分較模型組明顯增加(P<0.05)，治療效果與強的松組相似。其中中藥復(fù)方脊髓康中等劑量組與強的松組在術(shù)后第3天時的評分較模型組增加(P<0.05)，低劑量及高劑量組未見明顯差別。見表3。

表3 各組大鼠雙后肢神經(jīng)功能評分分)

2.3 免疫組化法觀察GFAP蛋白的表達

假手術(shù)組鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)AS散在分布，未見明顯肥大、增生，形態(tài)正常。模型組鏡下觀察，可見神經(jīng)纖維損傷，AS反應(yīng)性活化明顯，視野下密集分布，形態(tài)肥大。與模型組相比，強的松組視野下觀察到的AS活化明顯受到抑制，數(shù)量較少，但形態(tài)存在變化，肥大、增生。觀察中藥組可見活化的AS較少，與強的松組相比，星形細(xì)胞有部分肥大。見圖1。

注：本組實驗結(jié)果僅表明脊髓康能夠發(fā)揮作用。具體組間差異并不明確，故中藥組僅選一組作為示例。

2.4 RT-PCR法測定脊髓組織中GFAP mRNA表達

術(shù)后各個時間點，模型組GFAP mRNA表達量最高，且與各給藥組的差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著時間延長，在術(shù)后14天，模型組GFAP mRNA表達量達到頂峰，明顯高于其他組別(P<0.01)。與強的松組相比，脊髓康高、低劑量組GFAP mRNA相對表達量偏高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，脊髓康中劑量組在術(shù)后3天，GFAP mRNA與強的松組相比未見明顯差異(P=0.064)。強的松組、脊髓康高、中、低劑量組在3天、7天、14天各時間點GFAP mRNA均呈動態(tài)表達，脊髓損傷3天時至最高峰，之后逐漸下降。見表4。

3 討論

脊髓損傷的發(fā)生涉及到機體各個系統(tǒng)，且并發(fā)癥復(fù)雜、嚴(yán)重，治療療程長、所需費用高，效果也不甚滿意，目前也沒有有效方法可恢復(fù)脊髓損傷后的運動功能。AS在體內(nèi)一般存在形式有靜止與活化兩種。當(dāng)SCI發(fā)生時，AS將由靜止態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)?；罨腁S會促使下游部分脫氫酶同工酶活性將顯著增強，GFAP的表達水平也明顯升高，AS形態(tài)將顯著增大。當(dāng)受到損傷、缺血等刺激時，AS將不斷有絲分裂，體積變大，數(shù)量增多，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

表4 各組大鼠脊髓組織中GFAP mRNA表達鼠數(shù)3)

AS在脊髓損傷后的病理變化與以下情況有關(guān)：(1)接觸抑制作用減弱：細(xì)胞間相互接觸可以促進細(xì)胞周期素依賴性酶抑制劑P21蛋白的表達，同時可對pRb蛋白的磷酸化產(chǎn)生抑制作用，促使AS再次進入細(xì)胞周期。(2)高分子量葡萄糖胺聚糖透明質(zhì)酸(HA)可以使AS保持在靜止態(tài)，對AS的增殖起到抑制作用；當(dāng)SCI時，HA的降低會促使AS的繼發(fā)性增長。(3)脊髓損傷位置的AS還可經(jīng)旁分泌、自分泌細(xì)胞因子來促使自身增殖。AS在白介素21B、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的刺激下將會由靜止態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)；然后在成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-α等的作用下進入到細(xì)胞周期；再通過腫瘤壞死因子-γ、腫瘤壞死因子-α等作用形成膠質(zhì)瘢痕。(4)黏蛋白C不僅能增值A(chǔ)S，也能一直AS，但未活化AS在長期作用下，會自行活化。

目前，AS已成為脊髓損傷治療、修復(fù)神經(jīng)元的潛在重要靶點之一。脊髓損傷后病損區(qū)域神經(jīng)元持續(xù)生長、神經(jīng)功能有效恢復(fù)的關(guān)鍵點，總結(jié)起來有以下幾方面：(1)能夠提供神經(jīng)元生長的底物；(2)具有促進病損區(qū)域神經(jīng)元生長的相關(guān)因子；(3)抑制膠質(zhì)瘢痕增生形成所造成的屏障阻隔[4-6]。主流觀點認(rèn)為[7-11]，脊髓損傷后病損區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的“物理性屏障”及“化學(xué)系屏障”，是阻礙神經(jīng)元再生及神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵元兇?；诖死碚?，大量國內(nèi)學(xué)者對中醫(yī)藥展開研究，以此明確其對于星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用及意義。因此，如何調(diào)控AS，同時減輕繼發(fā)性脊髓損傷，是脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的突破口之一[12-14]。

大量針對GFAP的研究已經(jīng)明確了其作為AS活化的代表性產(chǎn)物，能夠反映膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。而CSPG因其能夠改善局部微環(huán)境，改善繼發(fā)性脊髓損傷，而同樣受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，脊髓損傷區(qū)域內(nèi)可見CSPG表達上升[15-16]，治療后感覺與運動功能恢復(fù)效果與之密切相關(guān)。鞠躬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷后，CSPG是阻礙神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵因素，CSPG會結(jié)合周圍不同細(xì)胞外基質(zhì)，抑制神經(jīng)再生。有學(xué)者采用干細(xì)胞移植、鞘內(nèi)注射硫酸軟骨素酶ABC等多種手段[18-19]，降低CSPG的表達，可明顯改善脊髓損傷預(yù)后，促進運動功能恢復(fù)。目前研究報道大多認(rèn)為，CSPG導(dǎo)致的繼發(fā)性神經(jīng)功能受損由糖胺聚糖鏈介導(dǎo)[20]。因此，去除糖胺聚糖鏈或可促進功能康復(fù)。

我們對造模大鼠進行研究，設(shè)立實驗組及對照組，研究中藥復(fù)方脊髓康對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用效果及其內(nèi)在機制。發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志行產(chǎn)物，GFAP在脊髓損傷區(qū)域呈強陽性表達，這一病理變化符合既往研究結(jié)果。

此次研究證實，中藥復(fù)方脊髓康能夠促進脊髓損傷大鼠運動及感覺功能的恢復(fù)，隨著中藥濃度的增加，其療效有增加趨勢。針對脊髓損傷大鼠脊髓損傷區(qū)域取材，行免疫組化及RT-PCR，可以明確大鼠脊髓損傷后損傷區(qū)域GFAP表達明顯增高。在進行藥物干預(yù)后，脊髓康各組及強的松組在GFAP表達上明顯低于模型組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；脊髓康組內(nèi)各時間點比較，可以發(fā)現(xiàn)脊髓康中等劑量組在療效上優(yōu)于低劑量組及高劑量組，因此掌握合適的濃度也是提高療效的關(guān)鍵點。

綜上所述，中藥復(fù)方脊髓康能夠促進脊髓損傷大鼠斜板實驗和雙后肢神經(jīng)功能評分改善；通過免疫組化及RT-PCR法觀察，脊髓康組和激素組都能抑制GFAP表達，控制膠質(zhì)瘢痕形成，減輕脊髓損傷后繼發(fā)性損傷。