基于UPLC-QTOF/MS技術(shù)鑒定雷公藤多苷片中的化學(xué)成分

章欣怡，辛貴忠,劉建群，劉麗芳*

(1.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f)屬于衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，具有祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)，解毒殺蟲，消腫止痛的功效。雷公藤多苷是從雷公藤藥材去皮根部提取的總苷，主要有效成分包括二萜、三萜以及生物堿類[1]。以雷公藤多苷為主要成分的雷公藤多苷片目前在臨床上廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、腎病綜合癥等，療效已經(jīng)得到普遍認(rèn)可[2]。然而雷公藤中的主要活性成分雷公藤甲素、雷公藤紅素等具有一定毒性，臨床上有多例因服用雷公藤制劑引起的不良反應(yīng)報道，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[3]。毒性反應(yīng)的發(fā)生原因多樣，可能由于藥材品質(zhì)欠佳、制劑工藝不足等多種因素導(dǎo)致。目前國內(nèi)生產(chǎn)雷公藤多苷片的廠家眾多，前期對多家企業(yè)生產(chǎn)的雷公藤多苷片的HPLC初步分析結(jié)果表明，不同來源的樣品中所含化學(xué)成分的差異較大，可能為雷公藤多苷片不良反應(yīng)產(chǎn)生的原因之一[4-5]。為了探究雷公藤多苷片的藥效與毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，規(guī)范制劑的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，有必要對該類品的化學(xué)成分進(jìn)行全面表征，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供分析依據(jù)。

超高效液相色譜(UPLC)與高分辨飛行時間質(zhì)譜(Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry, QTOF/MS)聯(lián)用技術(shù)目前已被成功應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的表征研究中[6]。本研究采用UPLC-QTOF/MS技術(shù)對雷公藤多苷片中所含的化學(xué)成分在電噴霧(electrospray ionization，ESI)質(zhì)譜中的裂解特點(diǎn)進(jìn)行了歸納總結(jié)，在此基礎(chǔ)上，對雷公藤多苷片所含的化學(xué)成分進(jìn)行了較全面的結(jié)構(gòu)分析和鑒定，旨在為雷公藤多苷片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)深入研究提供一定的思路和參考。

1 儀器與試藥

Milli-Q純水儀(Millipore公司，美國)，Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱(Waters公司，美國)，Shimadzu LC-30A Series UHPLC system (Shimadzu，德國)，配備SIL-20AC自動進(jìn)樣器，LC-20AD 二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A二極管陣列檢測器等。AB SCIEX QTOFTM 5600+ system (AB SCIEX Technologies，美國)，移液槍(eppendorf公司，德國)，5424高速離心機(jī)(eppendorf公司，德國)，Sartorius BT125D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，中國)，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司，常州)。

乙腈(色譜純，美國merck公司)，甲醇(色譜純，美國merck公司)，超純水(Milli-Q 純水儀，美國Millipore公司)，甲酸(質(zhì)譜級，Sigma-Aldrich公司)。雷公藤多苷片(購自國內(nèi)某藥企，批號：180604)。雷公藤甲素(購自鄭州豐耀農(nóng)業(yè)科技有限公司，批號：140320)。雷公藤紅素(購自鄭州豐耀農(nóng)業(yè)科技有限公司，批號：151208)。雷公藤次堿(購自成都普思生物科技股份有限公司，批號：PRF8042505)，對照品純度均大于98%。

2 方法

2.1 對照品溶液配制

取雷公藤甲素，雷公藤紅素和雷公藤次堿，精密稱定，置1 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液。將標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液等量混合并稀釋，制成濃度為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液配制

取適量雷公藤多苷片，研細(xì)后精密稱定750 mg粉末，加10 mL甲醇超聲提取30 min。13 000 rpm/min離心取上清液，N2吹干，加1 mL甲醇復(fù)溶，得濃度為100 μg/mL(按雷公藤多苷含量計)的供試品溶液。置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜和質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件

Shimadzu LC-30A Series UHPLC液相系統(tǒng)，柱溫為35 ℃。流速為0.2 mL/min，流動相為0.1%甲酸-水(A)和0.1%甲酸-乙腈(B)。流動相梯度：0～2 min，5%～20% B；2～9 min，20%～40% B；9～14 min，40% B；14～24 min，40%～65% B；24～27 min，65%～90% B；27～29 min，90% B；29～33 min，5% B，進(jìn)樣體積為2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件

AB SCIEX TripleTOF TM 5600+質(zhì)譜儀，ESI離子源，正離子模式下進(jìn)行檢測。霧化：N2，1.5 L/min；干燥器：N2，140 kPa，CID碰撞氣：氬氣，50 kPa；解簇電壓：90 V；碰撞能：50 V；離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管溫度：300 ℃；掃描范圍：m/z50～1 500；所有樣品數(shù)據(jù)采集均采用全掃描模式，非靶向模式獲得MS/MS二級碎片。

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Peak View 軟件(AB公司，美國)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過軟件自帶的分子式預(yù)測功能推測化合物的可能分子式，結(jié)合文獻(xiàn)檢索結(jié)果進(jìn)行初步鑒定。

3 結(jié)果與討論

通過2.3項(xiàng)下色譜條件對供試品溶液進(jìn)行UPLC-QTOF-MS/MS分析，正離子模式下總離子流圖(Total Ion Chromatogram, TIC)見圖1。綜合考慮保留時間，分子式，精確分子量，特征性離子碎片，參考文獻(xiàn)，共鑒定了36個化合物，包括14種生物堿，10種二萜類及其內(nèi)酯，11種三萜類及其內(nèi)酯，1種烴類。

圖1 雷公藤多苷片總提物UPLC-QTOF/MS總離子流圖

3.1 生物堿類化合物

雷公藤多苷中的生物堿分為大環(huán)內(nèi)酯型和非大環(huán)內(nèi)酯型倍半萜類生物堿，以前者含量居多。本實(shí)驗(yàn)選取雷公藤次堿為對照品研究大環(huán)內(nèi)酯型倍半萜類生物堿的質(zhì)譜裂解路徑，質(zhì)譜圖及裂解方式見圖2。

由圖2可知，雷公藤次堿在質(zhì)譜中的分子離子峰以m/z868.3035 [M+H]+的加和形式存在，質(zhì)譜碰撞裂解時首先丟失H2O，產(chǎn)生m/z850.292 7 [M+H-H2O]+的碎片。m/z850.292 7 [M+H-H2O]+的碎片離子易發(fā)生中性丟失，連續(xù)丟失一個C2H2O和H2O產(chǎn)生m/z808.282 8和m/z790.272 4的碎片。除丟失中性分子之外，雷公藤次堿中的苯甲酸基也會在碰撞中發(fā)生斷裂，由母離子m/z868.303 5脫去一分子BzOH形成m/z746.266 2 [M+H-BzOH]+碎片離子。該離子會繼續(xù)丟失C2H2O、H2O、CH3OH產(chǎn)生m/z704.256 7，m/z686.243 9，m/z644.236 0的碎片離子。此外，雷公藤次堿的大環(huán)斷裂后會產(chǎn)生倍半萜部分和吡啶二羧酸部分，后者有一個響應(yīng)較高的碎片離子m/z206.080 8。該碎片會繼續(xù)丟失CO, H2O形成m/z178.086 1、160.075 1、132.080 8。對照標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，可推斷化合物14為雷公藤次堿。結(jié)合其他倍半萜類生物堿的裂解方式，可以得到大環(huán)內(nèi)酯型倍半萜生物堿質(zhì)譜裂解的特點(diǎn)如下：1)分子離子峰以[M+H]+的加和形式存在。2)裂解方式有中性小分子丟失和開環(huán)，中性丟失過程中容易丟失H2O (18 Da)、CH3OH(32 Da)、C2H2O (42 Da)、CH3COOH(60 Da)，開環(huán)裂解后吡啶二羧酸部分含有羥基的生物堿會形成m/z204的特征碎片離子，不含羥基則形成m/z206的特征碎片離子。

圖2 雷公藤次堿質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律

化合物1的準(zhǔn)分子離子峰是m/z370.211 7，加和形式為[M+H]+。m/z353.188 4推斷為準(zhǔn)分子離子丟失一個NH3(17 Da)所獲得的碎片。因此說明化合物1在N上沒有甲基取代?；衔? 的二級質(zhì)譜中有一明顯的m/z160.1126 特征峰，為亞精胺類生物堿特征峰。根據(jù)另一特征峰m/z106.065 3，結(jié)合文獻(xiàn)和精確分子量匹配[7]，可知化合物1為Celafurine?；衔?的準(zhǔn)分子離子峰為m/z380.234 5，加和形式為[M+H]+。準(zhǔn)分子離子峰比化合物1多10 Da。化合物2的碎片裂解路徑與化合物1相似，結(jié)合文獻(xiàn)和精確分子量匹配[8]，可知化合物2為Celabenzine。同理可推斷化合物3為Celacinnine。

化合物4的準(zhǔn)分子離子峰為m/z780.274 8，加和形式為[M+H]+。m/z752.278 0、734.264 7、674.252 5、632.234 8為準(zhǔn)分子離子連續(xù)中性丟失CO(28 Da)、H2O(18 Da)、CH3COOH(60 Da)、C2H2O(42 Da)所獲得的碎片，表明母核上有羥基和羧基取代基。同時還檢測到較高的m/z204.065 0響應(yīng)，表明吡啶二羧酸部分含有羥基。結(jié)合文獻(xiàn)[9]，可推斷化合物4為Wilfordlongine。

化合物5的準(zhǔn)分子離子峰為m/z764.278 7，在m/z大于500的區(qū)域有CO(28 Da)、H2O(18 Da)、CH3COOH(60 Da)、C2H2O(42 Da)的中性丟失，與化合物4的裂解規(guī)律相似。同時化合物5有一明顯的m/z206.081 4響應(yīng)，說明其吡啶二羧酸部分不含羥基。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10]，推斷化合物5為Aquifoliunine E-Ⅲ。

化合物6的準(zhǔn)分子離子峰為822.289 4，加和形式為[M+H]+。化合物6與化合物5的準(zhǔn)分子離子峰相差42 Da，推測二者之間相差一個OAc。結(jié)合文獻(xiàn)[11]與特征峰m/z204.065 7，推測化合物6為Alatusinine。同理可推斷準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z806.290 2、874.273 4、868.304 7的化合物8、9、11為Wilfordinine E，Wilfordine，Congorinine E-1[10,12]。

化合物7的準(zhǔn)分子離子峰為m/z874.273 4，加和形式為[M+H]+。對照雷公藤次堿的標(biāo)準(zhǔn)圖譜可知，m/z762.266 3為準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子呋喃甲?；?FuOH，112 Da)所得，表明其含有呋喃甲酰基。結(jié)合文獻(xiàn)推斷化合物7為Wilfordconine[7]?；衔?0的準(zhǔn)分子離子峰m/z858.284 5，加和形式為[M+H]+，同樣有112 Da的特征丟失，同理可推測化合物10為Wilforgine。

化合物12的準(zhǔn)分子離子峰為m/z926.308 2，加和形式為[M+H]+。m/z804.273 9與準(zhǔn)分子離子峰相差122 Da，推斷其母核上可能有一苯甲?；〈；衔?2有一明顯特征峰m/z204.066 4，表明其含有羥基。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[7]，推斷化合物12為Wilfornine A。

化合物13的準(zhǔn)分子離子峰為m/z968.284 6，加和形式為[M+H]+。m/z856.269 4為準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子呋喃甲酰基(FuOH，112 Da)所得。化合物13在m/z500-840之間的碎片裂解方式與化合物10相似，且碎片離子質(zhì)荷比均相差2 Da，推測可能是脫去一分子后形成了雙鍵。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[13]，推測化合物13為Triptonine B。已推斷出的生物堿類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖3 生物堿類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3.2 二萜類化合物

雷公藤多苷中的二萜類化合物大部分屬于松香烷型和貝殼杉烷型，松香烷型的雷公藤甲素為其代表性成分。本研究選擇雷公藤甲素的對照品研究二萜類化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律。圖4為雷公藤甲素可能的質(zhì)譜裂解路徑。

由圖4可以看出，雷公藤甲素的準(zhǔn)分子離子峰是m/z361.166 4，加和形式為[M+H]+。m/z343.154 8，m/z325.146 2推斷為其連續(xù)丟失2分子H2O(18 Da)所得碎片，m/z287.128 7推斷為丟失2分子CO(28 Da)所得碎片。首先參考對照品，確定化合物16為雷公藤甲素。雷公藤甲素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中因?yàn)榫哂忻焰I，酯鍵，羥基取代基，所以在質(zhì)譜裂解路徑中容易丟失H2O和CO從而產(chǎn)生18 Da和28 Da的中性丟失。另外文獻(xiàn)報道，二萜內(nèi)酯類化合物還有可能在質(zhì)譜中發(fā)生C環(huán)均裂，從而生成互補(bǔ)碎片[14]。由于二萜類化合物的質(zhì)譜裂解方式較為復(fù)雜多樣，本研究主要通過準(zhǔn)分子離子峰和二級碎片與已報道萜類化合物相匹配，對雷公藤多苷片中所含的二萜類化合物進(jìn)行推斷?；衔?5、20、24裂解路徑不明確，但是與雷公藤藥材中已報道的萜類化合物質(zhì)譜信息匹配度較高，分別推斷為Tripterinin、Triptonoterpene methyl ether和Triptonoditerpenic acid[7]。

化合物17準(zhǔn)分子離子是m/z319.226 9，二級碎片來自于H2O和CO的中性丟失。其中二級碎片m/z255與準(zhǔn)分子離子峰之差為64 Da ，推測其可能為內(nèi)酯環(huán)開裂丟失2分子H2O和1分子CO所得。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[7]，推斷化合物17為Neotripterifordin?；衔?1的準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.216 8，比化合物少18 Da。化合物21與化合物17的裂解方式十分相似，因此推斷化合物21比化合物17少一個羥基，同理推斷化合物21為Doianoterpene B[14]。

化合物18與化合物22的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z303.231 9，m/z303.231 7，屬于同分異構(gòu)體。二者都有H2O和CO的中性丟失，區(qū)別在于化合物22有一m/z285.220 9碎片，可能為準(zhǔn)分子離子峰丟失CO2所得。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[15]，推測化合物18為ent-19-hydroxykaur-16-ene，化合物22為Doianoterpene C。

化合物19的準(zhǔn)分子離子峰為m/z329.175 2，二級碎片m/z269.114 8與準(zhǔn)分子離子峰相差60 Da，推測其可能含有羧基取代。其余二級碎片有H2O中性丟失?；衔?3與19的裂解方式相似。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10]，推斷化合物19為Triptoquinone A，化合物23為Triptoquinone B。已推斷出二萜類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖5。

圖4 雷公藤甲素裂解規(guī)律

圖5 二萜類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3.3 三萜類化合物

雷公藤多苷中的三萜類化合物組成相對復(fù)雜，主要包括木栓烷，烏蘇烷和齊墩果烷型等。木栓烷型的雷公藤紅素為其代表性成分。本研究選擇雷公藤紅素的對照品研究三萜類化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律，圖6為雷公藤紅素的質(zhì)譜裂解路徑。

由圖6可以看出，雷公藤紅素的準(zhǔn)分子離子峰是m/z451.285 0，加和形式為[M+H]+。m/z405.279 7為雷公藤紅素脫去一個中性小分子甲酸HCOOH(46 Da)所得碎片。五環(huán)三萜中的角甲基易發(fā)生位移和脫去，雷公藤紅素上的角甲基位于烯丙位，易脫去形成穩(wěn)定的C+離子。m/z257.211 1為A環(huán)與B環(huán)共用鍵上的角甲基脫去后形成雙鍵，接著發(fā)生Retro Diels-Alder(RDA)重排，最后脫去一個甲基后形成的離子。同理，碎片離子m/z249.185 1，m/z215.107 3分別為B環(huán)與C環(huán)，C環(huán)與D環(huán)共用鍵上的角甲基脫去重排后所得。參考對照品，確定化合物33為雷公藤紅素。雖然相比二萜類，三萜類的質(zhì)譜特征更加明顯，特別是具有C12，C13雙鍵的齊墩果烯和熊果烯，在質(zhì)譜碰撞下能發(fā)生明顯的C環(huán)裂解。但由于萜類化合物復(fù)雜的裂解路徑，三萜化合物的鑒定依舊遵循結(jié)合裂解規(guī)律與文獻(xiàn)報道的方式進(jìn)行推斷。其中化合物28，32無明顯質(zhì)譜裂解規(guī)律，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量和文獻(xiàn)報道推斷為30-hydroxyfriedelan-3-one與Orthosphenic acid[7,16]。

圖6 雷公藤紅素裂解規(guī)律

化合物25的準(zhǔn)分子離子峰是m/z459.311 5，加和形式為[M+H]+。m/z441.297 9為其丟失一分子H2O(18 Da)所得碎片。m/z231.101 8，m/z228.230 0為互補(bǔ)碎片，推測其C環(huán)17位發(fā)生裂解。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[7]，推斷化合物25為Triptotin H?；衔?9的準(zhǔn)分子離子峰是m/z485.329 1，加和形式為[M+H]+。準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子甲酸HCOOH(46 Da)形成碎片離子m/z439.329 1[M+H-HCOOH]+?；衔?9的裂解路徑與雷公藤紅素相似，結(jié)合文獻(xiàn)[7]可推斷為Cangoronine。同理可推得化合31為Wilforol A。

化合物26的準(zhǔn)分子離子峰是m/z455.353 6，加和形式為[M+H]+。準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子H2O后得碎片m/z437.342 8，提示該化合物上可能存在羥基取代。同時m/z317.210 9與準(zhǔn)分子離子峰相差138 Da，該質(zhì)量丟失為齊墩果-12-烯類的B環(huán)一般裂解方式，提示該化合物可能有齊墩果-12烯B環(huán)類似結(jié)構(gòu)。同時m/z208.179 8與m/z247.170 2為互補(bǔ)碎片，因此推測該化合物可能屬于齊墩果-12烯類。m/z219.138 1可能為m/z247.170 2中性丟失一分子CO(28 Da)所得，推測該化合物中可能有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[7]，推斷化合物26為Wilforlide A。化合物27的準(zhǔn)分子離子峰是m/z471.348 3，加和形式為[M+H]+?；衔?7與化合物26的分子量之差為16 Da，二者之間可能有羥基取代的差異?；衔?7的裂解方式與26相似，同樣存在互補(bǔ)碎片，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[7]，推斷化合物27為2α,3β,-dihydroxy-olean-12-ene-22,29-lactone。同理推測化合物30為Wilforlide B[12]。

化合物34的準(zhǔn)分子離子峰為m/z473.363 8，加和形式為[M+H]+。m/z455.353 6，m/z437.342 4為準(zhǔn)分子離子峰連續(xù)失去兩分子H2O所得。m/z409.347 5為m/z437.342 4失去一分子CO(28 Da)所得?；衔?4中同樣有138 Da特征性B環(huán)碎裂所得碎片m/z335.234 2，推測該化合物34可能屬于齊墩果-12-烯類。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[12]，推斷化合物34為Triptotriterpenic acid C。同理可推得化合物35為3β,28-dihydroxy-3-oxo-olean-12-en-29-oic acid[7]。已推斷出三萜類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖7。

圖7 三萜類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3.4 其他類化合物

化合物36的準(zhǔn)分子離子峰為281.248 0，加和形式為[M+H]+。其二級質(zhì)譜中有明顯的一系列m/z相差14的碎片離子峰，推測其可能為鏈烴結(jié)構(gòu)。結(jié)合精確相對分子質(zhì)量和相關(guān)文獻(xiàn)報道信息[1]，推斷化合物36為Linoleic acid。

已推斷出的化合物結(jié)構(gòu)見表1。

表1 雷公藤多苷片中36種化合物的定性分析結(jié)果

續(xù)表

4 結(jié)論

本研究基于目前已有的雷公藤化學(xué)成分研究報道和對照品裂解圖譜，首先建立了雷公藤多苷成分的質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)庫，根據(jù)化合物類型進(jìn)行分類匯總后探討了代表性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和質(zhì)譜裂解規(guī)律，進(jìn)而借助UPLC-QTOF/MS技術(shù)對雷公藤多苷片的主要化學(xué)成分進(jìn)行了全面的表征，最終鑒定出該制劑中的36個化合物，為雷公藤多苷片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)深入研究提供了重要參考。