Num1和Pil1超表達(dá)菌株構(gòu)建及互作關(guān)系探究

海力 肖瑤 龐文穎

摘要 為了研究Num1和Pil1之間是否存在互作，構(gòu)建了Pil1超表達(dá)菌株，并通過酵母四分體解離技術(shù)成功構(gòu)建得到用于免疫共沉淀試驗的超表達(dá)Pil1和Num1的菌株。通過免疫共沉淀試驗對Num1與Pil1的互作關(guān)系進(jìn)行初步研究，并對試驗中遇到問題的可能原因進(jìn)行了分析。這些結(jié)果為研究Pil1是否參與細(xì)胞膜上Num1簇的形成奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 酵母;Num1;Pil1;免疫共沉淀

中圖分類號 Q78 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）18-0107-05

Abstract To study whether there is an interaction between Num1 and Pil1，we constructed a Pil1 overexpression strain，and then successfully constructed the strain overexpressing both Pil1 and Num1，which can be used for coimmunoprecipitation experiments，via yeast tetrad dissection technique.We conducted preliminary study on the interaction between Num1 and Pil1 by coimmunoprecipitation，and analyzed possible reasons for problems encountered in the experiment.These results laid the foundation for studying whether Pil1 participates in the formation of Num1 clusters on the cell membrane.

Key words Yeast;Num1;Pil1;Coimmunoprecipitation

細(xì)胞器（organelle）一般認(rèn)為是散布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有一定形態(tài)和功能的微結(jié)構(gòu)或微器官。細(xì)胞中的細(xì)胞器主要有線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、中心體、葉綠體、高爾基體、核糖體等。它們組成了細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞能正常工作、運轉(zhuǎn)。曾經(jīng)認(rèn)為不同的細(xì)胞器在細(xì)胞中執(zhí)行不同的功能，各細(xì)胞器獨立運作，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞器之間是相互聯(lián)系的，并且這些聯(lián)系對于細(xì)胞器的功能和整個細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要[1-3]。

線粒體與質(zhì)膜間的接觸對于細(xì)胞正常生長也很重要，這些接觸會對線粒體形態(tài)、分裂、融合、定位和遺傳進(jìn)行調(diào)控[4]，線粒體與質(zhì)膜的連接使得線粒體附著在細(xì)胞皮層，使線粒體保持延伸狀的形態(tài)，更重要的是這種連接會確保在有絲分裂過程中線粒體被準(zhǔn)確地分配至子細(xì)胞中[5]，同時，這種線粒體-質(zhì)膜連接也參與到線粒體分裂[6-7]。

細(xì)胞器間的接觸是通過細(xì)胞器間的蛋白互作實現(xiàn)。并且，在不同的生理環(huán)境下定位于接觸位點的蛋白質(zhì)會建立、維持或者改變接觸，從而影響多種細(xì)胞的基本功能[8]。在釀酒酵母中，線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）-質(zhì)膜（PM）三者間形成的錨結(jié)構(gòu)（MECA）將線粒體與PM和ER相連，使得3個細(xì)胞器膜彼此靠近[9]， MECA的核心蛋白組分是Num1蛋白，Num1是一個313 kD蛋白，由一個N末端卷曲螺旋（CC）結(jié)構(gòu)域（95～303 aa），一個推測的鈣結(jié)合區(qū)EF-hand（303～316 aa），一個FFAT基序（306～330 aa），一個包含13個由64個殘基串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成的（592～1 776 aa）的中間TR結(jié)構(gòu)域，以及一個C末端的PH（pleckstrin homology）結(jié)構(gòu)域組成[10-11]。Num1通過C末端的PH結(jié)構(gòu)域與質(zhì)膜結(jié)合，通過N末端的CC結(jié)構(gòu)域與線粒體結(jié)合，從而使線粒體和細(xì)胞質(zhì)膜連接起來。有趣的是，線粒體與質(zhì)膜之間的Num1蛋白簇也作為動力蛋白的皮質(zhì)錨，在紡錘體的正確定位中起重要作用[12-14]。動力蛋白沿著星狀微管運行，之后被錨定至細(xì)胞膜的Num1簇[15]，以幫助有絲分裂過程中紡錘體的正確定位[12-13]。反過來，Num1簇的形成也受到線粒體的調(diào)控，當(dāng)線粒體遺傳受到抑制時， Num1簇的形成受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致動力蛋白介導(dǎo)的紡錘體定位產(chǎn)生錯誤，導(dǎo)致細(xì)胞核的不正常分離[16]。

質(zhì)膜是否也在Num1簇的形成中起作用，為了研究這一問題，從實驗室之前通過Num1的Pull-Down試驗鑒定出的蛋白中，篩選出定位在細(xì)胞膜的蛋白Pil1進(jìn)一步研究[17]。Pil1是酵母Eisosome的主要成分，Eisosome是一種大的蛋白復(fù)合體，定位于酵母質(zhì)膜上[18]。Eisosome通過Pil1直接與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)結(jié)合并產(chǎn)生內(nèi)陷[19]。為了驗證Pil1和Num1之間的互作，構(gòu)建了過表達(dá) Pil1 和 Num1 的菌株，通過免疫共沉淀試驗檢測 Pil1 和 Num1 的相互作用，旨在為研究Eisosome是否在Num1簇的形成中起作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。 釀酒酵母YWL37基因型：MATα ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63[17];YT52基因型：MATa TRP1-GAL1-Num1-YFP-HIS ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63;質(zhì)粒pFA6a- TRP-GAL1-3HA;免疫共沉淀試驗所需菌株收集量為YT47：135 mg;YT52：166 mg;YT84：149 mg。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑。YPD培養(yǎng)基和缺乏相應(yīng)氨基酸的SD （synthetic define）培養(yǎng)基;SPM培養(yǎng)基（Yeast extract 1 g/L，CSM 0.2 g/L，Glucose 0.5 g/L，Potassium acetate 10 g/L）;Lithium-Sorb溶液（10 mmol/L Trisbase，100 mmol/L Sorbitol，10 mmol/L LioAC，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）;PEG（40% PEG，10 mmol/L LioAC，10 mmol/L Trisbase，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）;轉(zhuǎn)膜液（10%甲醇，0.05%SDS，25 mmol/L Trisbase，190 mmol/L Glycine）;TBST溶液（50 mmol/L Trisbase，300 mmol/L NaCl，0.05% Tween 20，pH 8.0）。

1.2 方法

1.2.1 GAL1-3HA-PIL1菌株的構(gòu)建。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 對PIL1進(jìn)行過表達(dá)啟動子和蛋白標(biāo)簽的標(biāo)記。

1.2.1.1 PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化片段。為了后續(xù)更好地篩選到Pil1高表達(dá)量菌株，以pFA6a-TRP-GAL1-3HA質(zhì)粒為模板擴(kuò)增了標(biāo)記PIL1的轉(zhuǎn)化片段TRP-GAL1-3HA。引物序列和PCR反應(yīng)條件見表1、2。

PCR擴(kuò)增程序：第一步98 ℃ 預(yù)變性1 min;第二步98 ℃ 變性10 s，45 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸1 min（根據(jù)PCR預(yù)計產(chǎn)物片段長度調(diào)整），2個循環(huán);第三步98 ℃ 變性10 s，53 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸1 min，33個循環(huán);第四步72 ℃ 徹底延伸 8 min，最后 12 ℃ 保存。

PCR擴(kuò)增完成之后每50 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物加 5 μL 5×loading buffer混勻后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳檢測后用凝膠提取試劑盒回收，將回收產(chǎn)物放至4 ℃ 暫存。

1.2.1.2 酵母感受態(tài)細(xì)胞制備。從-80 ℃ 冰箱中取所需菌株在YPD固體培養(yǎng)基上劃線，放置30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d，挑菌落到3 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃，220 r/min 搖床培養(yǎng)24 h左右;次日吸取6 μL菌液（視酵母菌長勢而定）到新的30 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)至對數(shù)期 （OD600 約為0.5）;3 000 r/min 離心3 min棄上清，收集30 mL 對數(shù)期生長的YWL37細(xì)胞，取10 mL 滅菌水重懸清洗細(xì)胞，之后3 000 r/min 離心1 min去上清，加3 mL Lithium-Sorb溶液吹打重懸細(xì)胞，3 000 r/min 離心2 min 去上清;用360 μL Lithium-Sorb 和40 μL 鮭魚精子DNA （作為載體DNA，使用之前應(yīng)先在沸水中煮10 min 后放冰上冷卻） 重懸浮細(xì)胞，分裝到新的1.5 mL離心管中，每管100 μL，于-80 ℃ 保存。

1.2.1.3 目的片段轉(zhuǎn)化。取100 μL YWL37感受態(tài)細(xì)胞置于冰上;取10 μL PCR回收產(chǎn)物TRP-GAL1-3HA至100 μL YWL37感受態(tài)細(xì)胞中，加入6倍體積PEG混勻，室溫靜置30 min;然后加入38 μL 二甲基亞砜（DMSO），42 ℃ 水浴熱激5 min，之后3 000 r/min 離心2 min，棄上清;加50 μL 滅菌水重懸細(xì)胞，之后將細(xì)胞涂布缺乏色氨酸的固體培養(yǎng)基SD-TRP。

1.2.1.4 陽性克隆的篩選。在對應(yīng)的SD-TRP培養(yǎng)基上挑選單克隆，在新的SD-TRP培養(yǎng)基上劃線篩選單克隆，重復(fù)1次;將從第二次劃線的培養(yǎng)基上挑選的單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待提酵母總蛋白進(jìn)行鑒定。

1.2.2 重組轉(zhuǎn)化子的過表達(dá)鑒定。

1.2.2.1 GAL1啟動子超表達(dá)菌株細(xì)胞培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)化篩選得到的克隆在YPD固體培養(yǎng)基劃線，30 ℃恒溫24 h，之后接種細(xì)胞至3 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min 搖床中培養(yǎng)至飽和（約24 h）。取6 μL生長飽和的細(xì)胞液，轉(zhuǎn)移至3 mL含有2%棉子糖（Raffinose）的YPA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min 搖床中培養(yǎng)16 h。將培養(yǎng)16 h的細(xì)胞液，3 000 r/min 離心2 min，棄上清，向沉淀中加入含2%半乳糖（Galactose）的YPA液體培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min搖床中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后收集細(xì)胞。

1.2.2.2 TCA法制備酵母總蛋白。3 000 r/min離心5 min收集上述培養(yǎng)的細(xì)胞至收集管，向沉淀中加入100 μL 20%三氯乙酸（TCA） ，之后加直徑1 mmol/L玻璃珠至液面以下，室溫使用珠式細(xì)胞破碎儀（Minibeeadbeater16，Biosepc）破碎細(xì)胞1 min，冰上冷卻2 min，重復(fù)3次。用針頭在收集管底部扎一小孔，將收集管放入1.5 mL離心管中，4 ℃ 1 000 r/min離心3 min，棄收集管，3 000 r/min繼續(xù)離心5 min，棄上清。向沉淀中加40 μL 2×蛋白上樣緩沖液（protein loading buffer） 和40 μL Tris-HCl（pH 8.0）混勻，之后沸水中煮5 min，12 000 r/min 離心1 min，-20 ℃保存，上清用于蛋白質(zhì)免疫印跡。

1.2.2.3 蛋白免疫印跡。該試驗共檢測2種蛋白：Pil1和Num1。分別采用10%變性聚丙烯酰胺凝膠及6.25%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-PAGE膠配方見表3、4。電泳結(jié)束后，針對Pil1使用半干轉(zhuǎn)儀在含10%甲醇的轉(zhuǎn)膜液中將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，針對Num1則使用濕轉(zhuǎn)的辦法在相同的轉(zhuǎn)膜液中將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜浸泡至含5%脫脂奶粉的TBST溶液輕搖1 h。封閉之后，使用HA抗體（THETMc-HA Tag Antibody，mAb，Mouse，GenScript）或GFP抗體（Mouse Anti GFP Monoclonal-Antibody，興華基因）室溫輕搖孵育2 h，TBST溶液洗3次，每次10 min，之后使用二抗室溫輕搖孵育1 h，TBST溶液洗3次，每次10 min，然后使用含3 μL H2O2 的10 mL顯色液對PVDF膜上的蛋白進(jìn)行顯色，凝膠成像儀曝光檢測。

Western Blot檢測顯示Pil1成功超表達(dá)，命名為YT47 （GAL1-TRP-3HA-PIL1）。

1.2.3 酵母四分體解離法構(gòu)建免疫共沉淀（CoIP）菌株及表達(dá)鑒定。

1.2.3.1 親代酵母菌株雜交。取YT47、YT52在YPD固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，長出細(xì)胞后，挑取適量的親代菌株在新的YPD固體培養(yǎng)基上混合，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用牙簽挑混合菌落頂部少量菌在相應(yīng)雙缺培養(yǎng)基SD-TRP-HIS上劃線培養(yǎng)1～2 d，之后挑取菌落轉(zhuǎn)移至3 mL SPM液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)3～4 d（不能超過4 d），普通光學(xué)顯微鏡下觀察是否有四分體存在。

1.2.3.2 酵母細(xì)胞壁去除。取70 μL SPM中細(xì)胞液至1.5 mL離心管，3 000 r/min離心1 min，棄上清。加100 μL Lithium-Sorb溶液和8 μL Zymolase混勻，37 ℃靜置8 min，之后進(jìn)行四分體解離或存放于4 ℃直至使用。

1.2.3.3 酵母四分體解離及菌株篩選。取細(xì)胞沉淀20 μL滴至YPD固體培養(yǎng)基，豎立培養(yǎng)皿，使沉淀在培養(yǎng)基表面成一條直線，利用酵母四分體解離操作儀（MSM400，Singer）按照使用說明書，進(jìn)行四分體分離，解離完成后將培養(yǎng)基放置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞長出，之后根據(jù)需要得到相應(yīng)的菌株，將培養(yǎng)皿復(fù)制至SD-HIS，SD-TRP培養(yǎng)基和交配型選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選結(jié)果如表5。

1.2.3.4 Western Blot鑒定。將篩選得到的菌落轉(zhuǎn)移至 3 mL YPD 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集對數(shù)期細(xì)胞提取總蛋白并進(jìn)行 Western Blot 鑒定。

1.2.4 CoIP檢測Pil1與Num1的互作。

收集細(xì)胞：每個CoIP需要用不少于90 mg的細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)：第1天，從-80 ℃冰箱中取出CoIP所需菌株，用YPD培養(yǎng)基活化;第3天早上從平板上取細(xì)胞接種到3 mL YPD液體培養(yǎng)基中;第4天，等細(xì)胞長至飽和，下午吸取108 μL 菌液至54 mL 液體培養(yǎng)基中（48.6 mL YPA-D+5.4 mL 20% Raffinose）過夜培養(yǎng)16 h;第5天，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入54 mL YPA+半乳糖培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞。

免疫共沉淀試驗方法：

（1）細(xì)胞長好以后，3 000 r/min離心2 min棄上清，再加入1 mL滅菌水重懸，3 000 r/min離心1 min棄上清，加入1 mL 1× 細(xì)胞裂解液（lysis buffer）[配方見表6、7，不含蛋白酶抑制劑（protease inhibitor cocktail），購自Roche]重懸后轉(zhuǎn)入1.5 mL收集管中，3 000 r/min離心1 min棄上清后可在-80 ℃保存。

（2） 吸取30 μL Protein G磁珠（GE Healthcare）到1.5 mL 離心管（EP管）中（剪槍頭），加入1 mL 1×lysis buffer（不含PI）清洗，之后將EP管放入磁力架MagRack 6，收集磁珠到離心管一側(cè)，吸棄上清，再加入1 mL 1× lysis buffer（不含PI）重復(fù)洗一次棄上清，加入200 μL 1×lysis buffer（含PI）洗一次棄上清后，向EP管中加入200 μL 1×lysis buffer和3 μL GFP抗體，4 ℃孵育。

（3）細(xì)胞破碎：向已收集好的細(xì)胞中（保存在-80 ℃的細(xì)胞取出后需置于冰上融化）先加入300 μL 1×lysis buffer（含PI），重懸后加入1×lysis buffer（含PI）至600 μL，然后向收集管中加入珠子至液面以下。細(xì)胞破碎45 s，拿出放置在冰上靜置2 min，重復(fù)3個循環(huán)。

（4）在收集管底部戳一個洞，插到1.5 mL EP管中，4 ℃、3 000 r/min離心2 min后，向收集管中加入200 μL 1×lysis buffer（含PI），繼續(xù)3 000 r/min離心2 min，棄收集管，再12 000 r/min離心15 min，取50 μL上清作為Input。

（5）吸取剩余上清（大約有600 μL）到孵育抗體的1.5 mL EP管中，4 ℃繼續(xù)孵育1.5 h。

（6）孵育完后，用磁力架收集磁珠，取50 μL上清作為未結(jié)合蛋白（unbound）后棄上清。

（7）用1×洗脫液（wash buffer）（不含PI） 洗磁珠3次，每次加1 mL 1× wash buffer。

（8）用磁力架收集磁珠到離心管一側(cè)，棄上清后加入40 μL ddH2O和40 μL 2× protein loading buffer， 沸水煮5 min，-20 ℃保存。 向Input和unbound中加入50 μL 2× protein loading buffer沸水煮5 min，-20 ℃保存。

（9）點樣前拿出樣品沸水煮5 min，短暫離心，取上清點樣，進(jìn)行Western Blot檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAL-3HA-Pil1重組菌株的構(gòu)建和表達(dá)鑒定 為了檢測Pil1與Num1在細(xì)胞內(nèi)是否發(fā)生互作，以質(zhì)粒pFA6a-TRP-GAL1-3HA為模板擴(kuò)增TRP1-GAL1-3HA片段（1 798 bp）（圖1），并將此片段轉(zhuǎn)化至YWL37野生型菌株，通過Western?Blot檢測到Pil1的表達(dá)（圖2），構(gòu)建得到了TRP1-GAL1-3HA-PIL1超表達(dá)菌株，命名為YT47。

2.2 酵母四分體解離法構(gòu)建重組菌株 由于用于酵母雜交的親代酵母中均帶有TPR標(biāo)記，所以根據(jù)酵母四分體篩選分離后再用Western Blot進(jìn)一步鑒定（圖3），篩選得到A2（MATa TRP-GAL-3HA-PIL1 TRP-GAL1-NUM1-YFP-HIS 命名為YT84），B1（MATa TRP-GAL-3HA-PIL1 TRP-GAL1-NUM1-YFP-HIS 命名為YT85）。

HA抗體檢測A2、B1菌株中Pil1是否超表達(dá)。結(jié)果顯示A2、B1菌株構(gòu)建成功，將用于免疫共沉淀（CoIP）試驗。

2.3 CoIP檢測Num1與Pil1的互作 CoIP試驗使用GFP抗體（兔抗）（Genescript）孵育Protein G，經(jīng)GFP抗體沉淀下來的蛋白分別用GFP抗體和HA抗體檢測，試驗結(jié)果如圖4所示。Num1-GFP蛋白被成功地沉淀下來（圖4上右，第2道和第3道）。而且，3HA-Pil1蛋白也隨著Num1-GFP蛋白共同沉淀下來（圖4下右，第3道）。但是，在不表達(dá)Num1-GFP而只表達(dá)3HA-Pil1 的CoIP樣品中也檢測到3HA-Pil1蛋白（圖4下右，第1道），說明3HA-Pil1蛋白與免疫沉淀用的GFP抗體或Protein磁珠發(fā)生了非特異性結(jié)合。

3 結(jié)論與討論

該研究通過基因同源重組及酵母四分體解離等方法成功構(gòu)建了TRP-GAL-3HA-PIL1 TRP-GAL1-NUM1-YFP-HIS菌株，旨在通過免疫共沉淀試驗探究Num1與Pil1的互作關(guān)系，以期為后續(xù)研究Pil1所在的Eisosome膜結(jié)構(gòu)是否影響細(xì)胞膜上Num1簇（Num1多聚體）的形成奠定基礎(chǔ)。在用Protein G磁珠和GFP抗體進(jìn)行的CoIP試驗中，雖然3HA-Pil1能和Num1-GFP共同沉淀下來，但是在只表達(dá)3HA-Pil1而不表達(dá)Num1-GFP的細(xì)胞沉淀下來的樣品中也檢測到了3HA-Pil1。分析這種非特異性條帶的出現(xiàn)可能與以下幾方面有關(guān)：①Protein G磁珠能非特異性結(jié)合3HA-Pil1蛋白;②用于免疫沉淀試驗的GFP抗體能非特異性結(jié)合HA標(biāo)記的Pil1蛋白，使其沉淀下來;③免疫共沉淀試驗中的清洗步驟不徹底，使得Pil1與Protein G間產(chǎn)生非特異性粘黏。

為得到無干擾的試驗結(jié)果，為后期試驗奠定基礎(chǔ)，可以從以下3個方面進(jìn)行改善：①更換不同品牌的Protein G;②檢測GFP 抗體的特異性;③調(diào)整免疫共沉淀試驗中l(wèi)ysis buffer的鹽離子濃度，提高清洗的嚴(yán)謹(jǐn)性。

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