西草凈對斑馬魚的急性毒性研究

蔣利生 吳曉峰 康杰

摘要 [目的]評價西草凈原藥對斑馬魚的毒性。[方法]以斑馬魚為研究對象，將其暴露在不同濃度的西草凈中，觀察中毒癥狀及死亡情況，計算其半致死濃度（LC50） 和安全濃度（SC） 。[結(jié)果]暴露時間為24、48、72、96 h時的LC50分別為9.984、8.397、7.923、7.923 mg/L，安全濃度分別為0.998 4、0.939 7、0.792 3、0.792 3 mg/L，參照GB/T 31270.12—2014，西草凈對斑馬魚屬于中毒農(nóng)藥。[結(jié)論]西草凈對斑馬魚具有一定的影響，應(yīng)科學(xué)合理的使用，避免進(jìn)入水體。

關(guān)鍵詞 斑馬魚;西草凈;半致死濃度

中圖分類號 X503.22 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）18-0063-02

Abstract [Objective] To evaluate the toxicity of simetryn to zebrafish.[Method]Taking zebrafish as the research object， it was exposed to simetryn of different concentrations， ?the symptoms of poisoning and death were observed， and the semilethal concentration （LC50） and safe concentration （SC） were calculated.[Result]The LC50 at exposure times of 24， 48， 72， and 96 h were 9.984， 8.397， 7.923，and 7.923 mg/L， and the safe concentrations were 0.998 4， 0.939 7， 0.792 3， and 0.792 3 mg/L， respectively. According to GB/T 31270.12-2014， simetryn was toxic to zebrafish.[Conclusion]Simetryn has certain influence on zebrafish， so it should be used scientifically and reasonably to avoid entering water.

Key words Zebrafish;Simetryn;Median lethal concentration

西草凈（Simetryn）屬均三氮苯類除草劑，化學(xué)名稱為 2-甲硫基-4，6二（乙胺基）-1，3，5-三嗪，是1959 年由瑞士嘉基（Geigy）公司研發(fā)的一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型選擇性芽前土壤處理劑，可用于水稻、玉米、大豆、小麥、花生、棉花等作物田間除草[1-3]，其作用方式為抑制光合作用希爾反應(yīng)，影響糖類的合成和淀粉的積累，從而達(dá)到除草效果[4]。莊占興等[5]研究發(fā)現(xiàn)，西草凈對谷子田1年生闊葉雜草、莎草科雜草活性高，使用劑量低于600 g/hm2時對稻谷安全;趙永成[6]研究證明，西草凈能有效防除水稻田莎草科雜草和闊葉雜草，且對水稻安全。因具有安全、高效、高選擇性等特點，且降解半衰期小于30 d，屬易降解農(nóng)藥[7]，因此，西草凈具有廣闊的市場前景。

斑馬魚（Barchydanio rerio）是一種常見的模式動物，具有繁殖周期短、胚胎透明、個體小、易于養(yǎng)殖、對水質(zhì)污染與毒性物質(zhì)反應(yīng)靈敏等特點，因此被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、生態(tài)風(fēng)險評估等研究。目前關(guān)于西草凈對環(huán)境靶標(biāo)生物的研究較少，該研究參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價準(zhǔn)則》[8]和OECD試驗準(zhǔn)則[9]，以斑馬魚為受試對象，研究西草凈對斑馬魚的急性毒性，以評價西草凈的毒性效應(yīng)、環(huán)境風(fēng)險，為其實際田間應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供環(huán)境安全保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 主要儀器：LC-20A型高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器和化學(xué)工作站（日本島津公司），AUY220萬分之一電子天平（日本島津公司），HQ40d便攜式多參數(shù)數(shù)字化分析（美國哈希公司），YD200型水總硬度測定儀（上海三信儀表廠）等。

試劑與藥品：丙酮（分析純）和吐溫-80購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;曝氣自來水，由實驗室制備;西草凈，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)純度為97.0%，購于山東濱農(nóng)科技有限公司。

1.2 試驗生物

斑馬魚購于水族館，在試驗室條件下馴養(yǎng)8 d，每天光照12 h，及時清除糞便及食物殘渣，死亡率為1.5%。馴養(yǎng)期間每天喂食市售配合餌料2次，試驗前24 h停止喂食，試驗期間不喂食。選擇大小一致、健康無病的斑馬魚進(jìn)行試驗，根據(jù)抽樣結(jié)果所得，試驗所用斑馬魚平均體長2.23 cm，平均體重0.212 6 g，試驗過程中最大承載量不超過1.0 g魚/L水。

1.3 試驗條件 試驗用水硬度為102～145 mg/L（CaCO3計），pH為6.5～8.0，溶解氧大于空氣飽和值的65%，水溫在（25±1）℃范圍內(nèi)，光暗比為12 h/12 h。

1.4 試驗方法

1.4.1 參比物試驗。

用重鉻酸鉀進(jìn)行參比物試驗，設(shè)計濃度為100.00、140.00、196.00、274.40、384.16 mg/L，每處理10條斑馬魚，試驗周期24 h，觀察并記錄試驗用魚的中毒癥狀和死亡數(shù)，用玻璃棒輕觸魚尾部無可見運(yùn)動即可判定為死亡，及時清除死魚。參比物質(zhì)重鉻酸鉀對斑馬魚24 h的LC50值應(yīng)處于200～400 mg/L。

1.4.2 魚類急性毒性試驗。

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)計西草凈標(biāo)示濃度為4.82、5.79、6.94、8.33、10.00、12.00 mg/L。定量稱取西草凈原藥置于燒杯，加入丙酮溶解，再加入吐溫-80攪勻，蒸餾水稀釋后轉(zhuǎn)入1 000 mL的容量瓶中定容，得到母液濃度為500 mg/L，分別從母液中移取28.94、34.72、41.67、50.00、60.00、72.00 mL于1 000 mL容量瓶中，曝氣自來水定容后轉(zhuǎn)入魚缸中，再分別向魚缸中加入2 L曝氣自來水后攪勻，同時設(shè)置溶劑為丙酮和吐溫-80的溶劑對照組和空白對照組，每處理設(shè)置3個重復(fù)，每重復(fù)接入10條斑馬魚，置于水浴槽中培養(yǎng)，試驗期間不給食。試驗開始后分別于24、48、72、96 h觀察并記錄試驗用魚的中毒癥狀和死亡數(shù)，用玻璃棒輕觸魚尾部無可見運(yùn)動即可判定為死亡，及時清除死魚。計算24、48、72、96 h的LC50和95%置信區(qū)間，安全濃度SC=LC50×0.1。

1.4.3 藥液實際濃度檢測。

為獲得更準(zhǔn)確的試驗結(jié)果，在0和96 h分別取樣進(jìn)行藥液中實際濃度的檢測，色譜條件為：色譜柱：InertSustain C18，250 mm×4.6 mm（i.d）不銹鋼柱，5 μm;柱溫：30 ℃;流速：0.8 mL/min;檢測波長：260 nm;進(jìn)樣量：20 μL;流動相：乙腈+水（水中含0.05%磷酸）=50+50（V/V）。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 參比物試驗結(jié)果

斑馬魚為供試生物的參比物試驗中，重鉻酸鉀對斑馬魚LC50（24 h）為230.4 mg/L;95%置信限為204.11～260.08 mg/L，說明該批次斑馬魚能用于試驗，所采用的設(shè)備、條件和方法也符合要求。

2.2 急性毒性試驗結(jié)果

西草凈處理斑馬魚后，斑馬魚出現(xiàn)了游動緩慢、沉底、腹部充血等癥狀，其中對游動的抑制癥狀最明顯，與暴露濃度呈正相關(guān)，試驗期間，各處理均出現(xiàn)死亡斑馬魚。圖1表明，隨著西草凈濃度的升高，斑馬魚死亡率越來越大，隨著染毒時間的推移，斑馬魚死亡率也逐漸升高，但在72 h后趨于穩(wěn)定。試驗過程中取0和96 h的藥液上機(jī)檢測，西草凈實測濃度（表1）變化范圍未超過20%，因此在毒性數(shù)據(jù)處理中采用標(biāo)示濃度進(jìn)行毒性數(shù)據(jù)分析，毒性結(jié)果見表2。表2表明，暴露時間為24、48、72、96 h時，西草凈對斑馬魚的LC50分別為9.984、8.397、7.923、7.923 mg/L，安全濃度分別為0.998 4、0.939 7、0.792 3、0.792 3 mg/L，西草凈對斑馬魚的LC50值和安全濃度均隨著染毒時間的推移，數(shù)據(jù)變小，毒性增高。

3 討論

隨著農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，除草劑的使用量日益增加，農(nóng)藥施用后，通過漂移、雨水沖刷等進(jìn)入水環(huán)境中，會對魚類造成不同程度的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，不同除草劑對斑馬魚的毒性具有差異，不同生命階段的斑馬魚對除草劑的敏感性也有所不同[10]，阿特拉津在20 mg/L時便導(dǎo)致斑馬魚的死亡，并且影響斑馬魚胚胎的孵化率，阿特拉津30 mg/L 時會導(dǎo)致斑馬魚脊索彎曲[11]，芐嘧磺隆對斑馬魚具有一定的遺傳毒性[12]。

該研究發(fā)現(xiàn)，96 h時西草凈對斑馬魚的LC50為7.923 mg/L，依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[8]第12部分魚類急性毒性試驗（GB/T 31270.12—2014），農(nóng)藥對魚類的急性毒性按LC50的大小劃分為4個等級：LC50（96 h）>10 mg/L為低毒，1.0 mg/L

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