Box-Behnken響應面法優(yōu)化盆炎靈顆粒的醇沉工藝研究

蔡霈 鄭藝 王哲明

[摘要] 目的 優(yōu)化盆炎靈顆粒的醇沉工藝。 方法 在單因素試驗的基礎上，以醇沉前液相對密度、乙醇終濃度與靜置時間為考察因素，以綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B、去甲異波爾定、甘草苷、延胡索乙素、落新婦苷的轉移率與固體去除率的綜合評分值為考察指標，采用基于Box-Behnken設計的響應面法優(yōu)化盆炎靈顆粒的醇沉工藝。色譜條件：色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，流動相A為乙腈，流動相B為0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～10 min，2% A;10～40 min，2%～12% A;40～80 min，12%～18% A;80～110 min，18%～25% A;110～120 min，25%～50% A），柱溫30℃，檢測波長200～400 nm。 結果 最佳醇沉工藝條件為醇沉前液相對密度1.13，乙醇終濃度60%，靜置時間21 h。驗證試驗結果顯示，綜合評分的預測值與實測值相對偏差為0.7%。 結論 優(yōu)化的醇沉工藝方法簡單、操作簡便且結果準確穩(wěn)定，可為盆炎靈顆粒的制劑生產提供可靠的理論依據(jù)。

[關鍵詞] Box-Behnken;響應面法;醇沉工藝;轉移率;固體去除率

[中圖分類號] R284.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）08（a）-0032-06

[Abstract] Objective To optimize the ethanol precipitation process for Penyanling Granules. Methods Based on the single factor test， the relative density of the liquid before ethanol precipitation， the final ethanol concentration and the ethanol precipitation time were used as factors. The transfer rates of chlorogenic acid， paeoniflorin， ferulic acid， salvianolic acid B， norisoboldine， liquiritin， tetrahydropalmatine， astilbin and the composite score of solid removal rate were selected as evaluation indexes. The ethanol precipitation process of Penyanling Granules was optimized by Box-Behnken response surface method. Chromatographic conditions： the column was Agilent TC-C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， the flow rate was 1.0 mL/min. The mobile phase A was acetonitrile and the mobile phase B was 0.2% phosphoric acid solution with gradient elution （0-10 min， 2% A; 10-40 min， 2%-12% A; 40-80 min， 12%-18% A; 80-110 min， 18%-25% A; 110-120 min， 25%-50% A）. The column temperature was 30℃ and the detection wavelength was 200-400 nm. Results The optimal ethanol precipitation process was as followed： the relative density of the extract was 1.13， and ethanol was added to allow the content of ethanol to reach 60%， and then been placed for 21 h. The test results indicated that the relative difference of comprehensive scoring value between predicated value and measured value was 0.7%. Conclusion The optimal ethanol precipitation process is simple， easy to operate and the results are accurate and stable， which can provide a reliable theoretical basis for the preparation production of Penyanling Granules.

[Key words] Box-Behnken; Response surface methodology; Ethanol precipitation process; Transfer rate; Solide removal rate

盆炎靈顆粒是已在湖南省婦幼保健院臨床使用20年的中藥復方制劑，由醋延胡索、香附、敗醬草、丹參、茯苓等多味中藥材組成，具有通暢血脈、消散瘀滯、消炎鎮(zhèn)痛等功效，主要用于婦科盆腔炎性疾病的治療[1]。中藥制劑的醇沉工藝是在制劑過程中應用不同濃度乙醇將其除雜、精制有效成分的關鍵步驟，具有工藝成熟、操作簡便、設備簡單等優(yōu)點，能夠減少患者日服用劑量，增加患者順應性，同時減少顆粒的吸濕性，使其成型性更好，增加制劑的穩(wěn)定性，延長儲存時間[2-5]。由于中藥成分復雜，對于中藥復方的醇沉工藝研究需要在處理過程中同時考慮多味藥材的有效成分含量以及固體去除率的變化。本試驗采用基于Box-Behnken的星點設計-結合響應面法[6-9]，以醇沉后樣品中綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B、去甲異波爾定、甘草苷、延胡索乙素、落新婦苷的轉移率和固體去除率的綜合評分值為考察指標，優(yōu)化盆炎靈顆粒的醇沉工藝，為規(guī)范盆炎靈顆粒的生產工藝以及后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10AT高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），SPD-M20A檢測器（日本島津公司），SB25-12DTN超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），DZF-6050型真空干燥箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司），TDZ4-WS低速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），Mettler Toledo XS205型電子分析天平（德國梅特勒-托利多公司，精度萬分之一），0.22 μm微孔濾膜（美國密理博公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

盆炎靈顆粒處方中各味藥材從湖南衡東縣中藥飲片廠購買，當歸（20170316，甘肅）、丹參（20170626，河北）、大血藤（20170317，湖南）、烏藥（20170318，安徽）、敗醬草（20170316，湖南）、赤芍（20170316，四川）、三棱（20170317，廣西）、醋延胡索（20170316，浙江）、醋香附（20170319，安徽）、甘草（20170316，內蒙古）、土茯苓（20170316，廣東）經湖南省中醫(yī)院王竹鑫主任藥師鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》[10]中各項規(guī)定。

8種標準物質為綠原酸、去甲異波爾定、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110753-201411、111825-201402、110736-201604、110773-201614、111610-201106、111798-201504、110726-201617、111562-201212，純度≥98%，用于含量測定）;乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）為蒸餾水自制，其余試劑均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 綠原酸、去甲異波爾定、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B的含量測定

2.1.1 色譜條件? 色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）;梯度洗脫：0～10 min，2% A;10～40 min，2%～12% A;40～80 min，12～18% A;80～110 min，18～25% A;110～120 min，25～50% A;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;檢測波長：200～400 nm（綠原酸：327 nm;阿魏酸：316 nm;甘草苷：237 nm;芍藥苷：230 nm;延胡索乙素：280 nm;去甲異波爾定：280 nm;丹酚酸B：286 nm;落新婦苷：291 nm）;進樣量：10 μL[11]。混合標準品及樣品的HPLC圖譜見圖1。

A：混合標準品HPLC圖譜;B：盆炎靈顆粒劑HPLC圖譜。1.綠原酸;2.去甲異波爾定;3.芍藥苷;4.阿魏酸;5.甘草苷;6.落新婦苷;7.延胡索乙素;8.丹酚酸B。HPLC：高效液相色譜法

2.1.2 對照品溶液配制? 精密稱取綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸標準物質適量，加甲醇分別配制成濃度為1.721、3.111、0.415、0.239、0.345、0.694、2.686、0.168 mg/mL標準對照品溶液，用0.22 μm微孔濾膜濾過即為對照品溶液。取上述8種對照品置于同一容量瓶中，以甲醇定容，混合液中各對照品濃度與上述標準對照品溶液相同，即得混合對照品溶液。各標準曲線制作、精密度、重復性、穩(wěn)定性以及加樣回收率試驗已在相關研究[12]中完成，均符合要求。

2.1.3 供試品溶液的制備? 量取盆炎靈提取液或醇沉上清液適量，相當于生藥材25 g，置于25 mL的錐形瓶中，加入甲醇定容，搖勻，轉速5000 r/min，離心半徑為10 cm，離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，即為供試品溶液。

2.2 物質轉移率的測定

取“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的物質量，并按下式計算各物質的轉移率。轉移率=醇沉上清液中物質量/盆炎靈提取液中物質量×100%。

2.3 固體去除率的測定

精密吸取盆炎靈提取液或醇沉上清液適量（相當于生藥材25 g），置于已干燥至恒定質量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后于105℃干燥3 h，置于干燥器中冷卻30 min，恒重后精密稱定質量，計算固體去除率。固體去除率=（盆炎靈提取液干膏質量-醇沉上清液干膏質量）/盆炎靈提取液干膏質量×100%。

2.4 單因素考察

單純以各有效物質轉移率或固體去除率來評價醇沉工藝的優(yōu)劣，可能會出現(xiàn)有效物質與雜質同時保留或去除的情況，難以得到合理的結果。因此在本研究中，采用多指標綜合評價法對盆炎靈提取液醇沉工藝進行綜合評價。中藥水提液醇沉工藝權重系數(shù)的設計應當在優(yōu)先保留有效成分的前提下，盡可能多地去除雜質，故設置固體去除率權重系數(shù)為40[13-14]。綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉移率權重系數(shù)均為7.5（各標準物質權重系數(shù)相等），在此基礎上進行綜合評分。

利用綜合評分值（P）對試驗結果進行分析：以Y表示試驗中指標成分的測定值（綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉移率及固體去除率的測定值分別為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9），Z表示指標成分的測定值的標準化數(shù)據(jù)（Z=Y/Ymax）[9]，綜合評分值P=（Z綠原酸+Z芍藥苷+Z去甲異波爾定+Z甘草苷+Z落新婦苷+Z延胡索乙素+Z丹酚酸B+Z阿魏酸）×7.5+Z固體去除率×40。

2.4.1 醇沉前液相對密度? 在乙醇終濃度為60%、靜置時間為24 h的情況下，考察醇沉前液相對密度分別為1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30。將醇沉上清液按照“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液后進行分析，按“2.2”項下方法測定綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉移率，按“2.3”項下方法測定固體去除率，并按綜合評分法進行計算。以醇沉前液相對密度1.15時，綜合評分最高。見圖2。

2.4.2 乙醇終濃度? 在醇沉前液相對密度為1.15、靜置時間為24 h的情況下，考察乙醇終濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%。將醇沉上清液按照“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液后進行分析，按“2.2”項下方法測定綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉移率，按“2.3”項下方法測定固體去除率，并按綜合評分法進行計算。以乙醇終濃度為60%時，綜合評分最高。見圖3。

2.4.3 靜置時間? 在醇沉前液相對密度為1.15、乙醇終濃度為60%的情況下，考察靜置時間分別為4、8、16、24、32、40 h。將醇沉上清液按照“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液后進行分析，按“2.2”項下方法測定綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉移率，按“2.3”項下方法測定固體去除率，并按綜合評分法進行計算。當靜置時間達到16 h時后，隨著時間延長，綜合評分值無明顯變化。見圖4。

2.5 Box-Behnken響應面法優(yōu)化提取條件

2.5.1 Box-Behnken響應面法試驗設計與試驗結果? 經上述單因素試驗確定考察因素分別為A（醇沉前液相對密度）、B（乙醇終濃度，%）、C（靜置時間，h）。采用3因素3水平的Box-Behnken響應面分析法進行試驗設計，考察因素與考察水平見表1。

按照前述評分方法，利用P對試驗結果進行評分。Box-Behnken響應面法試驗設計與試驗結果見表2。

應用Design-Expert 10.0軟件對各試驗的綜合評分值進行回歸分析，得到回歸方程為：P=89.84-0.077A+5.64B+2.34C+5.90AB-2.32AC-4.36BC-2.90A2-20.24B2-1.45C2（R2 = 0.9986）。方程中一次項的系數(shù)絕對值表明各因素對綜合評分值的影響程度。由上述回歸方程可知，各考察因素對盆炎靈醇沉工藝的影響程度為B>C>A。對回歸方程進行回歸統(tǒng)計方差分析，見表3。

用F檢驗來判定回歸方程中各考察因素對綜合評分值的影響，概率P < 0.01時為高度顯著影響，概率P < 0.05時為顯著影響。由表3可知，模型概率P < 0.01，提示該模型具有高度顯著性，R2 = 0.9986，提示模型擬合程度好。應用Design-Expert 10.0軟件考察醇沉前液相對密度、乙醇終濃度和靜置時間的兩兩相互作用對醇沉工藝的影響，繪制了該實驗條件的響應面圖，得到3個開口向下的凸形曲面?？疾斓?個因素與盆炎靈顆粒醇沉工藝綜合評分值呈拋物線關系，并且在考察的實驗條件范圍內，存在著響應值的極大值。見圖5。

經過中心組合設計優(yōu)化醇沉條件，最優(yōu)工藝條件：醇沉前液相對密度1.125、乙醇終濃度60.83%、靜置時間21.10 h。

2.5.2 驗證試驗? 參照上述最優(yōu)醇沉工藝，并結合試驗條件的可操作性，調整為醇沉前液相對密度1.13，乙醇終濃度60%，靜置時間21 h，綜合評分值為90.8773。按照該優(yōu)化工藝進行3批次醇沉驗證試驗，結果綜合評分值為90.2759，與預測值比較，相對偏差為0.7%（<5%）。見表4。

3 討論

本研究首先通過單因素試驗初步篩選使各因素水平能夠在星點設計范圍之內，以提高試驗設計的精確性;之后采用Box-Behnken響應曲面分析法，建立盆炎靈顆粒純化工藝的二次回歸數(shù)學模型，并分析了各因素對響應值的影響。中藥醇沉工藝的探索中，常用正交試驗來進行研究，但正交試驗僅能給出最佳因素水平組合，不能優(yōu)化出更好的條件[15-17]，而Box-Behnken響應曲面分析法能夠通過對試驗結果進行數(shù)據(jù)擬合，構建影響因素與響應值之間的擬合模型，從而推算出最佳工藝條件。對于多因素試驗研究，Box-Behnken響應面法是最佳的分析方法[18-21]。從上述試驗結果可知，本研究中所建立的數(shù)學模型擬合程度高，試驗誤差小。最佳的盆炎靈顆粒醇沉純化工藝條件：醇沉前液相對密度1.13、乙醇終濃度60%、靜置時間21 h。在此醇沉條件下盆炎靈顆粒中各主要有效物質的轉移率均>70%，且與預測值相差較小。由響應面法優(yōu)化得到的盆炎靈顆粒醇沉工藝參數(shù)準確、可靠，說明該數(shù)學模型具有指導工業(yè)生產的意義。對所選取指標進行了合理的權重系數(shù)分配，使得有效物質轉移率結合固體去除率的綜合評分更加合理，為盆炎靈顆粒制劑生產的工藝優(yōu)化提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2019-12-13）