MTDH介導(dǎo)黃芩苷抑制4T1乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用研究

張慧　黃立中　肖玉潔　 鄧天好　龔輝

[摘要] 目的 基于異黏蛋白（MTDH）基因探討黃芩苷對4T1細胞增殖、遷移、侵襲的影響。 方法 取對數(shù)生長期的4T1細胞，分為對照組，25、50、100、150、200 mg/L黃芩苷組，分別采用對應(yīng)藥物處理4T1細胞，MTT法檢測黃芩苷處理后的細胞活性，細胞劃痕實驗、Transwell法測定細胞遷移力、侵襲力，Western blot檢測細胞中MTDH表達水平。 結(jié)果 25 mg/L黃芩苷對細胞遷移影響不明顯，隨著濃度增大到50 mg/L，遷移抑制作用逐漸明顯，到100、150 mg/L時，表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但藥物作用24、48 h后，對細胞無明顯遷移抑制作用。不同濃度黃芩苷組間細胞侵襲抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。其中150 mg/L黃芩苷組細胞侵襲抑制率高于100 mg/L黃芩苷組（P < 0.05）。100、150 mg/L黃芩苷組細胞侵襲抑制率高于50 mg/L黃芩苷組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。與對照組比較，50、100、150 mg/L黃芩苷組MTDH表達量降低（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 黃芩苷能抑制乳腺癌細胞生長和增殖，抑制乳腺癌細胞的遷移能力和侵襲能力，其機制可能與下調(diào)MTDH的表達相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 黃芩苷;異黏蛋白;增殖;侵襲;遷移

[中圖分類號] R737.9 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）08（c）-0016-05

Effect study on MTDH mediated baicalin inhibiting proliferation， migration and invasion of 4T1 breast cancer cells

ZHANG Hui1 ? HUANG Lizhong2 ? XIAO YuJie2 ? DENG Tianhao3 ? GONG Hui3

1.Department of Medical Oncology， Chinese Medicine Hospital of Hainan Province， Hainan Province， Haikou ? 570203， China; 2.College of Combination of Chinese and Western Medicine， Hu′nan University of Chinese Medicine， Hu′nan Province， Changsha ? 410007， China; 3.Department of Medical Oncology， Hu′nan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital， Hu′nan Province， Changsha ? 410006， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of baicalin on proliferation， migration and invasion of 4T1 cells based on metadherin （MTDH） gene. Methods 4T1 cells in logarithmic growth stage were divided into blank control group and baicalin group with different doses of 25， 50， 100， 150 mg/L and 200 mg/L， and then treated with corresponding drugs. Cell activity after baicalin treatment was detected by MTT method. Migration was measured by scratch assay. Invasion was measured by transwell assay and MTDH expression in cells was measured by Western blot. Results The effect of baicalin at 25 mg/L on cell migration was not obvious. As the concentration increased to 50 mg/L， the inhibition of cell migration gradually became obvious. When the concentration increased to 100 mg/L and 150 mg/L， the inhibition of cell migration showed obvious effects. The inhibition rate of cell invasion of baicalin groups with different concentrations was statistically significant （P < 0.05）. The inhibition rate of cell invasion in the group of 150 mg/L baicalin was higher than that in the group of 100 mg/L baicalin （P < 0.05）. The inhibition rate of cell invasion in the 100 mg/L and 150 mg/L baicalin group was higher than that in the 50 mg/L baicalin group， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the control group， MTDH expression was decreased in the 50， 100 mg/L ?and 150 mg/L baicalin groups （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Baicalin can inhibit the growth and proliferation of 4T1 breast cancer cells， inhibit the migration and invasion ability of breast cancer cells， and its mechanism may be related to the down-regulation of MTDH expression.

[Key words] Baicalin; Metadherin; Proliferation; Migration; Invasion

乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位[1]，具有發(fā)病率高、侵襲率強、極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因[1-2]。研究顯示[3-5]，異黏蛋白（MTDH）基因過表達能促進乳腺癌細胞往肺、骨、腦等器官侵襲轉(zhuǎn)移的能力。黃芩是一種廣泛使用的中草藥，主要成分為黃芩苷已被證實具有廣譜抗腫瘤作用，本課題組前期采用黃芩苷聯(lián)合黃芩素進行體外實驗[6]，發(fā)現(xiàn)其能抑制乳癌細胞生長、誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡，抑制乳腺癌細胞的侵襲能力[7]。而黃芩苷在多種中藥中可提取，對臨床指導(dǎo)及使用意義更大。因此本研究探討黃芩苷對乳腺癌細胞侵襲遷移的影響及機制，為尋找低價安全有效的抗癌藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細胞株

4T1乳腺癌細胞株在BALB/c裸鼠中的生長轉(zhuǎn)移特性與人體中的乳腺癌十分接近，注射后能產(chǎn)生高轉(zhuǎn)移腫瘤，轉(zhuǎn)移至肺、肝等部位。該細胞株由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細胞中心提供。

1.2 實驗藥物及試劑

黃芩苷：純度98.6%，批號：110715-201416，購自中國藥品生物制品檢定所，用DMSO溶解，配成200 mg/L備用。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液：美國Hyclone公司;胰酶：美國Invitrogen公司;DMSO：美國Xiasi生物公司;MTT：美國Sigma公司;MTDH兔抗人單克隆抗體：美國Proteintech，貨號13860-1-AP。完全培養(yǎng)液的配置：10%胎牛血清、1%雙抗加入高糖DMEM培養(yǎng)液中，隨用隨配。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1CV超凈工作臺：蘇凈安泰公司;倒置光學(xué)顯微鏡：重慶光學(xué)儀器廠;TDZ5-40臺式離心機：長沙天創(chuàng)儀器公司;Transwell小室：Costar公司;6孔板：NEST;SHEL-LABCO2培養(yǎng)箱：日本Hitachi公司;GG112-10B恒溫水浴箱：上海醫(yī)療器械廠。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)及傳代 ?4T1細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待細胞生長達90%左右進行傳代。

1.4.2 MTT法測細胞生長抑制率 ?將對數(shù)生長期的細胞以1×104個/孔鋪于96孔板，分為對照組，25、50、100、150、200 mg/L黃芩苷組，對照組僅加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，黃芩苷組加入不同濃度的黃芩苷，每一濃度設(shè)6個平行孔，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，吸出上清，每孔加入無血清DMEM培養(yǎng)液溶解的MTT 20 μL（5 mg/mL），孵育4 h，吸出上清，以DMSO溶解藍紫色顆粒，在酶標儀490 nm處測量各孔的吸光度值（OD），再計算細胞抑制率。細胞抑制率=[1-（OD藥物-OD對照組）/（OD細胞-OD對照組）]×100%。

1.4.3 細胞劃痕實驗 ?按密度為5×105個/孔將4T1細胞懸液接種到6孔板，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細胞呈單層生長至80%，用無菌的10 μL移液器槍頭沿著細胞孔的中軸線輕輕劃過（肉眼<1 mm），PBS緩沖液輕輕沖洗，洗去細胞殘骸，分為對照組和25、50、100、150 mg/L黃芩苷組，黃芩苷各組加入相應(yīng)濃度的黃芩苷2 mL，對照組加入2 mL完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細胞遷移情況（100×），每組細胞均設(shè)2個平行孔，拍照記錄。

1.4.4 Transwell侵襲實驗 ?向已鋪Matrigel膠的Transwell細胞培養(yǎng)板上室中加入200 μL含濃度為25、50、100、150 mg/L黃芩苷的單細胞培養(yǎng)液（含細胞4×104個），Transwell細胞培養(yǎng)板下室加入完全培養(yǎng)液600 μL，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦掉小室的Matrigel膠和未穿膜的細胞，4%多聚甲醛固定10 min，用濃度0.1%結(jié)晶紫染色10 min，洗掉溶液中的結(jié)晶紫后在倒置光學(xué)顯微鏡下（200×），每組計數(shù)5個不同視野中的細胞數(shù)目。侵襲抑制率=（1-實驗組侵襲細胞數(shù)/對照組侵襲細胞數(shù)）×100%。

1.4.5 Western blot檢測MTDH表達 ?鋪于6孔板內(nèi)的4T1細胞生長至60%采用藥物處理，分為對照組和50、100、150 mg/L黃芩苷組。對照組予以完全培養(yǎng)液，黃芩苷各組給予不同濃度黃芩苷培養(yǎng)24 h，離心收集細胞，加入細胞裂解液并輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使裂解液和細胞充分接觸，提取總蛋白后進行電泳、轉(zhuǎn)膜，加入MTDH一抗、二抗孵育后ECL顯色曝光，Quantity One專業(yè)灰度分析軟件進行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析（ANOVA）;等級資料兩樣本相關(guān)性檢驗用Spearman等級相關(guān)分析法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測黃芩苷對4T1細胞活力的影響

25、50、100 mg/L濃度下，24、48 h兩個時間點黃芩苷對4T1細胞活力的影響不明顯。黃芩苷濃度增加到150、200 mg/L，48 h的細胞抑制率分別為40%和68%，明顯抑制細胞的生長?；谶@一階段的MTT實驗，考慮到高濃度黃芩苷（200 mg/L）對乳腺癌細胞活性的抑制作用，為了排除后續(xù)實驗中黃芩苷對4T1乳腺癌遷移和侵襲作用是由抑制細胞活性引起的，后續(xù)實驗采用25、50、100、150 mg/L黃芩苷。見圖1、表1。

2.2 不同濃度黃芩苷對4T1細胞遷移能力的作用

25 mg/L黃芩苷對細胞遷移影響不明顯，隨著濃度的增大到50 mg/L，遷移抑制作用逐漸明顯，到100、150 mg/L時，表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但藥物作用24、48 h后，對細胞無明顯遷移抑制作用。見圖2。

2.3不同濃度黃芩苷對4T1細胞侵襲抑制作用

與對照組比較，25 mg/L黃芩苷組細胞侵襲能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），50、100、150 mg/L黃芩苷組Transwell小室下面的細胞數(shù)均少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。不同濃度黃芩苷組間細胞侵襲抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。其中150 mg/L黃芩苷組細胞侵襲抑制率高于50、100 mg/L黃芩苷組（P < 0.05）。100mg/L黃芩苷組細胞侵襲抑制率高于50 mg/L黃芩苷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3～4。

與對照組比較，△P < 0.05;與50 mg/L黃芩苷組比較，*P < 0.05;與100 mg/L黃芩苷組比較，#P < 0.05

2.4黃芩苷對4T1細胞蛋白表達的影響

與對照組比較，50、100、150 mg/L黃芩苷組MTDH表達量降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表2、圖5。

3 討論

MTDH[8-9]是一個定位于8號染色體長臂2區(qū)2帶的原癌基因。既往在4種不同乳腺癌細胞株中均檢測到MTDH表達[10]。采用shRNA干擾乳腺癌細胞MTDH表達[11]，發(fā)現(xiàn)乳腺癌侵襲能力降低，而對復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者瘤組織中MTDH檢測發(fā)現(xiàn)，其表達明顯高于原發(fā)乳腺癌患者[12]，提示MTDH過表達與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。前期在動物實驗中對乳腺癌組織中MTDH表達及其與肺轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，MTDH與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。

黃芩苷分子式C21H18O11，在常用中藥黃芩、半枝蓮、燈盞細辛等藥材中均可以提取到，是中藥黃芩發(fā)揮功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，在黃芩中含量高達9%[15-16]。黃芩苷除傳統(tǒng)報道抗炎、抗病毒及解熱護肝作用外，對肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤具有抗瘤作用[17-18]。黃芩苷可以通過逆轉(zhuǎn)上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而有效抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[19]。課題組前期研究證實，黃芩苷具有抑制乳腺癌細胞生長、誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡，抑制乳腺癌細胞的侵襲能力[6-7]。

本研究MTT實驗證實了黃芩苷對細胞活性的抑制作用，提示黃芩苷可以有效的抑制乳腺癌細胞生長和增殖。遷移能力和侵襲能力是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中必須具備的兩個基本條件[20]。劃痕及Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能減弱4T1乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。進一步檢測黃芩苷干預(yù)后各組MTDH表達發(fā)現(xiàn)，MTDH的表達在黃芩苷各組均有不同程度的下調(diào)，提示黃芩苷抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲遷移的機制可能與下調(diào)MTDH的表達相關(guān)，從細胞實驗層次為黃芩苷抗乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移提供了理論依據(jù)。根據(jù)這一結(jié)論，本課題組已經(jīng)開展黃芩苷抗乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實驗，以期進一步研究黃芩苷的療效和MTDH相關(guān)調(diào)節(jié)機制。

[參考文獻]

[1] ?Zhang H，Zhu W，Biskup E，et al. Incidence，risk factors and prognostic characteristics of bone metastases and skeletal-related events（SREs） in breast cancer patients：A systematic review of the real world data [J]. J Bone Oncol，2018，11：38-50.

[2] ?Nayak D，Katoch A，Sharma D，et al. Indolylkojyl methane analogue IKM5 potentially inhibits invasion of breast cancer cells via attenuation of GRP78 [J]. Breast Cancer Res Treat， 2019，177（2）：307-323.

[3] ?Yu L，Di Y，Xin L，et al. SND1 acts as a novel gene transcription activator recognizing the conserved Motif domains of Smad promoters，inducing TGFβ1 response and breast cancer metastasis [J]. Oncogene，2017，36（27）：3906-3914.

[4] ?Juan Xu，Yeying Wang，Zhizheng Li，et al. Ultrasound-Targeted Microbubble Destruction （UTMD） Combined with Liposome Increases the Effectiveness of Suppressing Proliferation，Migration，Invasion，and Epithelial-Mesenchymal Transition（EMT） via Targeting Metadherin （MTDH） by ShRNA [J]. Med Sci Monit，2019，25：2640-2648.

[5] ?Li T，Li Y，Sun H. MicroRNA-876 is sponged by long noncoding RNA LINC00707 and directly targets metadherin to inhibit breast cancer malignancy [J]. Cancer Manag Res，2019，11：5255-5269.

[6] ?王婷，黃立中，肖玉潔，等.黃芩苷聯(lián)合黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡的機制研究[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6（9）：10-11.

[7] ?Wanjun Y，Xingcong M，Xiaoyan G，et al. Research progress in the correlation between baicalein and the invasion and metastasis of breast cancer [J]. Modern Oncology，2016，24（3）：491-494.

[8] ?Chen X，Li XY，Long M，et al. The FBXW7 tumor suppressor inhibits breast cancer proliferation and promotes apoptosis by targeting MTDH for degradation [J]. Neoplasma，2018，65（2）：201-209.

[9] ?Wang Zhao，Zheng-Yan Tang，Zhuo Yin，et al. Metadherin regulates epithelial mesenchymal transition in carcinoma [J]. Onco Targets Ther，2016，9：2429-2436.

[10] ?李超，宋振川，王新樂，等.異黏蛋白在乳腺癌細胞中的表達[J].中華實驗外科雜志，2013，30（12）：62-63.

[11] ?Liu ZZ，Cao H，Ding YZ，et al. Mechanism research on influence of down-regulating MTDH gene expression in breast canser cell metastasis [J]. Chin J Canser Prev Treat，2014，21（8）：575-579.

[12] ?Jin PX，Liu ZJ. Expression of metadherin gene in metastatic breast cancer and its clinical significance [J]. Academy Journal of Chinese PLA Medical School，2013，34（2）：133-136.

[13] ?Dhiman G，Srivastava N，Goyal M，et al. Metadherin：A Therapeutic Target in Multiple Cancers [J]. Front Oncol，2019，9：349.

[14] ?馮磊，毛丹，陳州華，等.轉(zhuǎn)移黏附基因在乳腺癌組織中的表達及其與肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J].中南藥學(xué)，2017， 15（4）：416-420.

[15] ?周偉，庾國楨，劉亞敏，等.黃芩苷通過IκBα/NF-κB通路調(diào)節(jié)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細胞凋亡[J].中成藥，2019，41（11）：2765-2769.

[16] ?鄭勇鳳，王佳婧，傅超美，等.黃芩的化學(xué)成分與藥理作用研究進展[J].中成藥，2016，38（1）：141-147.

[17] ?張艷麗，王聰，朱雷蕾，等.黃芩苷藥理作用研究進展[J].河南中醫(yī).2019，39（9）：1450-1454.

[18] ?盂璐，張學(xué)武，李正祿.黃芩苷誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細胞凋亡及對相關(guān)蛋白表達的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2010， 21（9）：2212.

[19] ?Zhou T，Zhang A. Baicalin inhibits the metastasis of highly aggressive breast cancer cells by reversing epithelial-to-mesen-chymal transition by targeting β-catenin signaling [J]. Oncol Rep，2017，38（6）：3599-3607.

[20] ?Christofori G. New signals from the invasive front [J]. Nature，2006，441（7092）：444-450.

（收稿日期：2019-10-24）

[基金項目] 湖南省教育廳一般項目（17C1205）;海南省省級中醫(yī)重點專科建設(shè)項目（腫瘤科）（S100111.401）;海南省自然科學(xué)基金面上項目（817338）。

[作者簡介] 張慧（1985.2-），女，博士;研究方向：惡性腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合防治。

[通訊作者] 龔輝（1986.6-），女，博士，在站博士后;研究方向：惡性腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合防治。