73株海鱸源嗜水氣單胞菌的耐藥性分析

陳雪影 葉彩燕 柴文君 黃錦爐 曾林

摘 要：2015—2019年，從不同地區(qū)發(fā)病海鱸體內(nèi)分離得到73株嗜水氣單胞菌，對(duì)其進(jìn)行了9種抗菌藥物的抗藥性比較研究，均以M-H培養(yǎng)基進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，并根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司提供的判定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估敏感性。結(jié)果表明，分離菌株對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率為77%（56/73），對(duì)四環(huán)素類的多西環(huán)素和四環(huán)素的耐藥率分別為42%（31/73）、34%（25/73），對(duì)氨基糖苷類的新霉素、慶大霉素、卡那霉素敏感率為86%（63/73）、78%（57/73）、68%（50/73），對(duì)恩諾沙星和氟苯尼考敏感率為70%（51/73）、71%（52/73）。

關(guān)鍵詞：海鱸;嗜水氣單胞菌;耐藥性分析

中圖分類號(hào) S941? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）17-0110-03

The Resistance to Antibiotics of Aeromonas hydrophila Isolated from Lateolabrax japonicas

CHEN Xueying1，2 et al.

（1Guangdong Haid Group Co.， Ltd， Guangzhou 510000， China; 2 Zhuhai Hailong Biotechnology Co.， Ltd， Zhuhai 519000， China）

Abstract：To investigate the resistance of 73 Aeromonas hydrophila strains isolated from Lateolabrax japonicas in different areas in 2015—2019， and provide reasonable basis for controlling disease caused by Aeromonas hydrophila. The isolations to nine antibiotics was analyzed by M-H medium and the sensitivity was evaluated according to the criteria provided by Hangzhou microorganism. Asthe results showed， 77% （56/73） ，42% （31/73） and 34% （25/73）isolations were resistant to sulfamethoxzzole，tetracycline and doxycycline， respectively. The sensitivity rates of neomycin， gentamycin，kanamycin，enrofloxacin and florfenicol were 86% （63/73）， 78% （57/73）， 68% （50/73）， 70% （51/73） and71% （52/73）.

Key words： Lateolabrax japonicas; Aeromonas hydrophila; Antibiotics; Resistance

海鱸（Lateolabrax japonicus），又稱花鱸或七星鱸，隸屬于鱸形目、鰭鱸科、花鱸屬，是我國沿海區(qū)域重要的養(yǎng)殖品種之一。廣東珠海是海鱸養(yǎng)殖重點(diǎn)區(qū)域，年產(chǎn)量約12萬t，占全國總產(chǎn)量的近70%，現(xiàn)珠海斗門海鱸均采用傳統(tǒng)的池塘高密養(yǎng)殖模式[1]。近年來，隨著海鱸養(yǎng)殖技術(shù)的不斷成熟，養(yǎng)殖密度大斷加大，養(yǎng)殖環(huán)境也不斷惡化，導(dǎo)致病害問題日趨嚴(yán)峻。一方面，細(xì)菌性疾病如諾卡氏菌和病毒病如虹彩病毒等，發(fā)病率高、傳染性性強(qiáng)、死亡量大、治療十分困難，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失;另一方面，一些條件致病菌如嗜水氣單胞菌，由于其發(fā)病癥狀不如諾卡氏菌好辨認(rèn)，一線從業(yè)人員對(duì)其認(rèn)識(shí)不足和缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)室診斷工具，存在對(duì)該菌重視度不足的現(xiàn)象，仍憑以往的養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)使用調(diào)水、換水，沒有及時(shí)對(duì)癥下藥，以至于損失擴(kuò)大[2-3]。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬弧菌科、氣單胞菌屬，可引起多種水生動(dòng)物患腸炎或敗血癥，如羅非魚的腐皮病、草魚的腸炎病、牛蛙的紅腿病、鱉的穿孔病、鱘魚的敗血癥等[4-7]。當(dāng)前，國內(nèi)關(guān)于海鱸嗜水氣單胞菌的研究報(bào)道甚少，一方面可能由于養(yǎng)殖區(qū)域較窄，未引起廣大研究者的關(guān)注;另一方面，海鱸疾病的研究多數(shù)集中在諾卡氏菌等專一性疾病，嗜水氣單胞菌病尚未引起重視。而嗜水氣單胞菌屬條件致病菌，在不適其生長(zhǎng)繁殖的條件下，若水溫較低、水質(zhì)良好，一般不會(huì)致病。但如果放養(yǎng)密度大、水溫升高、水質(zhì)惡化、魚體機(jī)械損傷、魚體質(zhì)下降等因素，可能會(huì)造成魚體感染發(fā)病。為此，本試驗(yàn)以分離自不同年份和區(qū)域的海鱸源嗜水氣單胞菌73株為研究對(duì)象，采用瓊脂擴(kuò)散法比較不同嗜水氣單胞菌分離株的藥物敏感性，以期為海鱸嗜水氣單胞菌的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 嗜水氣單胞菌73株，分離自不同區(qū)域海鱸，由廣東海大集團(tuán)海大研究院保存提供。菌株來源如表1所示。

1.2 細(xì)菌的培養(yǎng) 按無菌操作要求，挑取低溫保存的嗜水氣單胞菌活化后接種于LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30℃，120 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)24h，收集菌液，4000r/min離心5min收集菌體，用生理鹽水進(jìn)行稀釋，將稀釋菌液與 McFarland比濁管進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，使受試菌株的菌液終濃度均達(dá)到3×107 cfu/mL。

1.3 藥敏試驗(yàn) 供試抗生素類藥敏紙片共9種，恩諾沙星（5μg/片）、氟苯尼考（75μg/片）、新霉素（30μg/片）、慶大霉素（10μg/片）、卡那霉素（5μg/片）、復(fù)方新諾明（11.25μg/片）、多粘菌素B（10μg/片）、多西環(huán)素（300 IU/片）、四環(huán)素（30μg/片），購自杭州天和微生物試劑有限公司。試驗(yàn)方法參考馬緒榮等[8]主編的《藥品微生物檢驗(yàn)手冊(cè)》推薦的紙片瓊脂擴(kuò)散法。用無菌棉簽取生理鹽水稀釋的菌液，在M-H瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂布，將培養(yǎng)基30℃恒溫箱中靜置數(shù)分鐘，使瓊脂培養(yǎng)基表面干燥，用無菌鑷子將不同的藥敏紙片均勻地貼在瓊脂培養(yǎng)基的表面，30℃，培養(yǎng)24h。觀察、測(cè)量各菌株的抑菌圈直徑。結(jié)果判定參照杭州天和微生物試劑有限公司提供的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥率 檢測(cè)結(jié)果顯示，供試菌株對(duì)復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、四環(huán)素、多粘菌素B、氟苯尼考的耐藥率較高，分別為77%、42%、34%、26%、23%。對(duì)恩諾沙星和慶大霉素的耐藥率分別為4%、1%。對(duì)新霉素和慶大霉素的耐藥率為0。供試菌株對(duì)新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、卡那霉素、多粘菌素的敏感率分別為86%、78%、71%、70%、68%、52%。對(duì)多西環(huán)素、四環(huán)素、新霉素3種藥物的敏感率為0（見表2）

2.2 不同年份嗜水氣單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，2015—2019年間，嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星和慶大霉素的耐藥率有升高的趨勢(shì)，恩諾沙星由0升高為15%，慶大霉素由0升高為8%，說明嗜水氣單胞菌對(duì)2種藥物出現(xiàn)了耐藥。2015—2019年間，嗜水氣單胞菌對(duì)新霉素和卡那霉素的耐藥率保持為0，未出現(xiàn)耐藥菌株。嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明的耐藥性呈先升高后下降的趨勢(shì)，但與年份無明顯規(guī)律。2015—2019年間，嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星和慶大霉素的敏感率有下降的趨勢(shì)。對(duì)多西環(huán)素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明的敏感率一直為0，說明嗜水氣單胞菌對(duì)3種藥物不敏感。嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考、新霉素、卡那霉素、多粘菌素B的敏感性與時(shí)間無明顯規(guī)律。綜合來看，分離株對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類、酰胺醇類、多肽類藥物敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、四環(huán)素類不敏感。

3 討論

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界中，通常在水體養(yǎng)殖環(huán)境惡化和魚體體質(zhì)較弱時(shí)，對(duì)多種養(yǎng)殖魚類具有不同程度的致病性，若防控不及時(shí)或用藥不當(dāng)時(shí)，可造成養(yǎng)殖魚類的大面積死亡[9]。因此，針對(duì)不同分離源嗜水氣單胞菌開展菌株耐藥性分析，對(duì)于有效防控該菌感染病例具有十分重要的指導(dǎo)意義。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，73株海鱸源嗜水氣單胞菌對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類、酰胺醇類的敏感性較高，新霉素、慶大霉素、卡那霉素達(dá)86%（63/73）、78%（57/73）、68%（50/73），恩諾沙星和氟苯尼考達(dá)70%（51/73）、71%（52/73）的敏感率，與其他研究結(jié)果相似[10-11]。分離株對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥，如多西環(huán)素和四環(huán)素的耐藥率分別為42%（31/73）、34%（25/73）。此外，77%（56/73）的菌株對(duì)復(fù)方新諾明耐藥，與金珊等[12]報(bào)道的復(fù)方新諾明具有抑菌作用的結(jié)果有一定的差異。但供試嗜水氣單胞菌普遍對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、慶大霉素、新霉素等抗生素在內(nèi)的藥物敏感。通過對(duì)藥敏結(jié)果的回顧分析發(fā)現(xiàn)，不同年份分離的嗜水氣單胞菌對(duì)同一種抗生素的耐藥程度是存在差異，如2015—2019年間，嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星和慶大霉素的耐藥率隨時(shí)間的推移呈升高的趨勢(shì)，恩諾沙星的耐藥率由0升高為15%，對(duì)慶大霉素耐藥率由0升高為8%，說明嗜水氣單胞菌對(duì)2種藥物出現(xiàn)了耐藥。但嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明的耐藥性呈先升高后下降的趨勢(shì)，與年份無明顯規(guī)律。有學(xué)者認(rèn)為，以上現(xiàn)象與養(yǎng)殖地區(qū)長(zhǎng)期使用單一藥物、給藥途徑、用藥劑量以及耐藥菌株通過各種媒介傳播等因素密切相關(guān)[13-14]。

在監(jiān)測(cè)過程中，采樣的魚池均沒有暴發(fā)嗜水氣單胞菌病，但細(xì)菌分離鑒定卻檢測(cè)到魚體中存在較高的嗜水氣單胞菌感染率，因此嗜水氣單胞菌作為一種條件致病菌，可以在海鱸體內(nèi)無癥狀攜帶。由于抗生素的使用，可能會(huì)抑制嗜水氣單胞菌的臨床癥狀，發(fā)展出病原菌攜帶魚，當(dāng)養(yǎng)殖密度過大、水質(zhì)惡化或水溫變化時(shí)，嗜水氣單胞菌病便可能會(huì)暴發(fā)[15]。該病發(fā)生后養(yǎng)殖戶常采用控料、停料的方式，但嗜水氣單胞菌具有傳染性，未得到較好的控制，合法使用的抗生素具有的一定的效果，在實(shí)際中有效劑量卻高于普通魚，內(nèi)服藥物達(dá)不到治療效果，高劑量使用后，往往在上市之前不能達(dá)到休藥期，從而加大了食品安全隱患。對(duì)于防控該病，建議從傳染病的角度，如消滅傳染源、切斷傳播途徑、降低動(dòng)物的易感性等措施進(jìn)行防控，減少抗生素的使用，以確保水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

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（責(zé)編：張宏民）