響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用進(jìn)展

武愛(ài)龍 何冰 吳建陽(yáng) 周鮮嬌

摘 要：目前，植物組織培養(yǎng)的優(yōu)化策略較多，其中大多數(shù)使用單因素試驗(yàn)法或正交試驗(yàn)法研究各因素之間的交互作用，最終得到最優(yōu)方案。而響應(yīng)面法（RSM）是采用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行模型擬合并展開(kāi)優(yōu)化分析，從而得到最優(yōu)研究方案。該文從響應(yīng)面法在初代培養(yǎng)（誘導(dǎo)培養(yǎng)）、繼代培養(yǎng)（增殖培養(yǎng)）、生根培養(yǎng)以及其他培養(yǎng)條件中的應(yīng)用等方面綜述了目前響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對(duì)今后的運(yùn)用進(jìn)行了展望，以期為優(yōu)化植物組織培養(yǎng)過(guò)程和實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法;植物組織培養(yǎng);優(yōu)化條件;應(yīng)用展望

中圖分類號(hào) Q813.1;TB115.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）17-0021-03

植物組織培養(yǎng)是一種快速繁殖技術(shù)，其理論基礎(chǔ)是植物細(xì)胞全能性[1]。該技術(shù)就是通過(guò)從植物上分離細(xì)胞、組織、器官或者原生質(zhì)體，在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行接種，然后將其放置在含有植物激素和營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而得到完整的植物[2]。目前，植物組織培養(yǎng)在醫(yī)藥、園藝和農(nóng)林等行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，并取得了一定的效益，特別是在栽培無(wú)病毒植物、改良作物品種等方面取得了顯著成效。

目前，統(tǒng)計(jì)學(xué)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其中響應(yīng)面試驗(yàn)法（Response Surface Methodology，RSM）是以數(shù)理統(tǒng)計(jì)為基礎(chǔ)的一種模擬分析方式，正被越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注[3]。RSM設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方法有中心組合設(shè)計(jì)、全因素設(shè)計(jì)、Box-Behnken設(shè)計(jì)等。相對(duì)于傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法，RSM法能通過(guò)圖形更直觀地判斷優(yōu)區(qū)域;它利用前期試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)有限次數(shù)的試驗(yàn)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，建立數(shù)學(xué)模型，擬合出函數(shù)的全局關(guān)系式，通過(guò)描述響應(yīng)值與各因素間的關(guān)系，對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)與優(yōu)化，得到最佳試驗(yàn)條件模型;RSM法具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、更直觀、精確度高等特點(diǎn)[4]。因此，響應(yīng)面法在醫(yī)學(xué)、生物、化學(xué)等行業(yè)，以及生態(tài)學(xué)、工程學(xué)、生化提取工藝等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛 [5]。但是響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用并不是很多，因此有必要對(duì)響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

響應(yīng)面法是一種優(yōu)化方法，將數(shù)學(xué)建模應(yīng)用于綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，然后選擇一些極具代表性的各點(diǎn)展開(kāi)試驗(yàn)，在全局范圍內(nèi)對(duì)各因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系進(jìn)行回歸模擬，從而得到各因素的最佳值。與正常的正交設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)面法對(duì)各因素間的交互作用進(jìn)行了分析，能夠從整體上反映各因素的水平效果。目前，優(yōu)化培養(yǎng)條件的主要方式有響應(yīng)面法、正交試驗(yàn)法、單因素試驗(yàn)法等。

單因素試驗(yàn)法通常用于確定單個(gè)因素的范圍，分析較容易，獲得的結(jié)果也更加直觀，但是這種試驗(yàn)法忽視了各組分間的關(guān)系，甚至?xí)?dǎo)致最適宜的條件被忽視。正交試驗(yàn)法涉及到多個(gè)因素，但只能分析孤立試驗(yàn)點(diǎn)，無(wú)法確定整個(gè)區(qū)域因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)表達(dá)式。響應(yīng)面法主要是利用二次回歸模型對(duì)各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系進(jìn)行分析和擬合，試驗(yàn)精度高、次數(shù)少、周期短，克服了正交試驗(yàn)的不足，能夠得到離散水平的最佳組合[6]，以及整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。最終可以反映出每個(gè)因素的變化趨勢(shì)，得到在全部因素影響下的最佳工作條件，從而提高參數(shù)組合的準(zhǔn)確性;且試驗(yàn)次數(shù)少，節(jié)省了時(shí)間和成本，避免原料浪費(fèi)。近年來(lái)，響應(yīng)面法在食品學(xué)、生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[7]，因其操作簡(jiǎn)單、可預(yù)測(cè)性較高，近年來(lái)逐漸在植物組織培養(yǎng)研究中得到應(yīng)用[8]。

2 響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用

2.1 初代培養(yǎng)（誘導(dǎo)培養(yǎng)） 初代培養(yǎng)是指直接從機(jī)體提取細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。初代培養(yǎng)的主要目的是進(jìn)行無(wú)性繁殖系，從而得到無(wú)菌材料。在進(jìn)行初代培養(yǎng)時(shí)，通常會(huì)使用分化培養(yǎng)基或者誘導(dǎo)培養(yǎng)基，這類培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素含量較低，細(xì)胞分裂素含量較高。Abbasi等[9]通過(guò)響應(yīng)面法得到了大豆愈合組織誘導(dǎo)和分化的最佳培養(yǎng)基激素配比。Bagherieh 等[10]在研究滇紫草愈傷組織的繼代培養(yǎng)基時(shí)也使用了響應(yīng)面法。劉一霏等[11]在愈傷組織初代誘導(dǎo)中采用響應(yīng)面法將6-BA、2，4-D、NAA設(shè)置17種不同的濃度梯度，獲得大苞萱草愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA（2mg/L）+NAA（0.3mg/L）+2，4-D（0.3mg/L）。江林娟等[12]在研究馬鈴薯愈傷組織芽分化率時(shí)，使用了響應(yīng)面法優(yōu)化生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平，得到了最優(yōu)值，即TDZ、2，4-D、GA3分化培養(yǎng)基濃度配比為2.02、0.08、2.25mg/L。

2.2 繼代培養(yǎng)（增殖培養(yǎng)） 繼代培養(yǎng)是在外植體接種一段時(shí)間后，重新切割得到的愈傷組織，轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上，以進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。為達(dá)到預(yù)定的苗株數(shù)量，通常需要經(jīng)過(guò)多次的循環(huán)繁殖操作，因此繼代培養(yǎng)也稱之為增殖培養(yǎng)。其目的就在于在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增殖，使之越來(lái)越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢(shì)。張艷萍等[13]以野生白刺的無(wú)菌苗幼嫩莖段為外植體，利用響應(yīng)面法對(duì)白刺莖段增殖誘導(dǎo)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。采用2因素5水平的響應(yīng)面法對(duì)挑選出的6-BA和IBA 2個(gè)因素濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終得到增殖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方是MS+6-BA（0.22mg/L）+IBA（0.55mg/L）;培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，同單因素試驗(yàn)相比，前者的增殖系數(shù)從3.63提高到3.90。姚思揚(yáng)等[14]以草莓品種紅顏繼代組培苗為試驗(yàn)材料，利用響應(yīng)面法對(duì)其增殖條件進(jìn)行優(yōu)化。以瓊脂濃度、光照度、pH為試驗(yàn)因子，以增殖系數(shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)而得出紅顏草莓增殖條件的優(yōu)化結(jié)果：瓊脂濃度7.1g/L，pH 5.37，光照度為2177Lx;在此條件下，最佳增殖系數(shù)預(yù)測(cè)值為10.9305，實(shí)際操作結(jié)果為10.73。謝勇武等[15]采用南靖金線蓮為組培材料，以金線蓮接種 60d后鮮植株增殖倍數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在研究培養(yǎng)基中各單因素對(duì)金線蓮鮮植株增殖影響的基礎(chǔ)上，再利用響應(yīng)面法優(yōu)化金線蓮培養(yǎng)基，利用回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而得到最佳工藝條件為生長(zhǎng)素NAA 0.55mg/L、細(xì)胞分裂素6-BA 2.5mg/L、蔗糖38g/L、基本培養(yǎng)基MS添加倍數(shù)為1/2。

2.3 生根培養(yǎng) 植物材料增殖數(shù)量達(dá)到一定值時(shí)，須將一部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段，若不能及時(shí)轉(zhuǎn)移，將會(huì)導(dǎo)致苗子老化、發(fā)黃，甚至由于過(guò)于擁擠，導(dǎo)致無(wú)效苗數(shù)量增加，造成浪費(fèi)。植物組織培養(yǎng)是否成活與生根壯苗密切相關(guān)。彭文書(shū)等[16]以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，使用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)等方式得到了影響鐵皮石斛生根培養(yǎng)基條件最重要的因素分別是NAA濃度、6-BA 濃度、香蕉泥量以及馬鈴薯量;同時(shí)，利用回歸方程得到這4個(gè)因素的最佳濃度值，香蕉泥87.63g、馬鈴薯89.30g、NAA最優(yōu)濃度0.52mg/L、6-BA最優(yōu)濃度0.24mg/L。董燕婧等[17]使用Design-Expert8.0對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到適應(yīng)白芨幼苗生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基的最佳配方為：蔗糖30g/L、香蕉汁100g/L、活性炭0.6g/L、馬鈴薯汁50g/L、6-BA 2.0mg/L、瓊脂7g/L、NAA 0.2mg/L、MS;這種條件下能夠得到5.3條白芨幼苗根，平均根長(zhǎng)1.6cm，平均根粗1.19mm。

2.4 其他培養(yǎng)條件 目前，常規(guī)的組培快繁體系環(huán)節(jié)較多，主要有接種外植體、初代和繼代培養(yǎng)，同時(shí)還受到其他培養(yǎng)條件的影響。在使用響應(yīng)面法進(jìn)行單因素預(yù)試驗(yàn)時(shí)，需要確保其條件為最佳設(shè)計(jì)，從而為自變量變化和組培苗成活率兩者之間的關(guān)系構(gòu)建相應(yīng)的模型，并展開(kāi)綜合分析，最終得到優(yōu)化方案以對(duì)各項(xiàng)因素進(jìn)行試驗(yàn)[18]。李雪雪等[19]以單因素試驗(yàn)結(jié)果作為基礎(chǔ)構(gòu)建相應(yīng)曲面模型，并選擇光照時(shí)間、氯化汞消毒時(shí)間和天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度作為自變量，以葡萄微嫁接苗的成活率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果顯示，當(dāng)光照時(shí)間為16.92h、氯化汞消毒時(shí)間是7.11min、香蕉泥濃度697.09mg/L時(shí)，葡萄微嫁接苗成活率最高;為提高操作方便性，以最佳試驗(yàn)條件作為基礎(chǔ)，設(shè)定氯化汞消毒7.1min、光照時(shí)間17h、香蕉泥濃度700mg/L，葡萄微嫁接苗的成活率大概在65.2±0.8%，這充分說(shuō)明響應(yīng)面法能夠?qū)ζ咸盐⒓藿咏M培快繁技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化。詹杏熔等[20]使用響應(yīng)面法構(gòu)建模型對(duì)組培金線蓮單瓶產(chǎn)量進(jìn)行預(yù)測(cè)，最終得到了最佳培養(yǎng)基配方：蔗糖濃度2.89%、蘑菇預(yù)煮液濃度0.68%、0.53倍的MS基本培養(yǎng)基，最佳配方得到的金線蓮單瓶產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，這充分表明蘑菇預(yù)煮液可以視為天然有機(jī)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

3 響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用展望

響應(yīng)面法可以在初代培養(yǎng)（誘導(dǎo)培養(yǎng)）、繼代培養(yǎng)（增殖培養(yǎng)）、生根培養(yǎng)等操作過(guò)程中對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和條件進(jìn)行優(yōu)化，得到整個(gè)區(qū)域所有因素的響應(yīng)值和最佳組合的最佳值。響應(yīng)面法是對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化、提高愈傷組織芽分化率和增殖系數(shù)、壯苗生根、提高組培苗某些活性成分等的一種有效方法。與正交試驗(yàn)相比，響應(yīng)面法具有更高的準(zhǔn)確度，能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，提高工業(yè)化水平。

目前，響應(yīng)面法軟件由Design Expert 8升級(jí)到Design Expert 10版本，操作更加簡(jiǎn)便，功能更加強(qiáng)大，使用更加高效，尤其是可以利用二次多項(xiàng)式在驗(yàn)算點(diǎn)附近使用響應(yīng)面函數(shù)來(lái)同真實(shí)功能函數(shù)進(jìn)行擬合。蔣水華[21]對(duì)功能函數(shù)方法進(jìn)行擬合，對(duì)各項(xiàng)精度和效率進(jìn)行計(jì)算，從而從整體上系統(tǒng)分析響應(yīng)面。研究發(fā)現(xiàn)，在使用隨機(jī)響應(yīng)面時(shí)，可以和高階隨機(jī)多項(xiàng)式相配合，從而提高其同真實(shí)功能函數(shù)的擬合度，更加準(zhǔn)確地得到最佳培養(yǎng)條件。由此可見(jiàn)，響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛。

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（責(zé)編：徐世紅）