原發(fā)性肝細(xì)胞癌中Ezrin和Survivin的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

韋花媚，陸海善，韋仕喜，黎俊楠，黃群芳

（右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，廣西 百色 533000）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌為一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在發(fā)達(dá)國家中的病死率居各類惡性腫瘤的前列[1]。隨著對肝癌發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因之一，因此，研究與肝癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因蛋白表達(dá)變化可為肝癌的診療提供可靠的生物標(biāo)志物[2]。Ezrin 屬ERM（ezrin,radixin,moesin）成員，為膜細(xì)胞骨架連接蛋白，不僅在細(xì)胞的運(yùn)動、遷移、黏附、有絲分裂等生理功能中起關(guān)鍵作用，還參與多種惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3]。研究表明[4]，Ezrin 主要通過調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)和黏附分子的途徑參與細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。Survivin 屬凋亡抑制因子家族，在抗凋亡機(jī)制中發(fā)揮重要作用，特異性表達(dá)于細(xì)胞的G2/M 期，且僅在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的早期表達(dá)，可有效促進(jìn)部分損傷惡性轉(zhuǎn)化，但其具體的活化機(jī)制尚未闡明[5]。本研究通過檢測原發(fā)性肝細(xì)胞癌前病變組織和原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織Ezrin 和Survivin 的表達(dá)水平，探討二者與原發(fā)性肝細(xì)胞癌浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月—2018年5月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接受手術(shù)切除的98 例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的癌組織標(biāo)本。其中，男性68 例，女性30 例；年齡46～85 歲，平均（67.52±6.48）歲；病程1～7年，平均（4.21±3.75）年。98 例患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例（有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40 例（無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組）。9 例肝組織正常標(biāo)本采自正常肝組織（正常對照組）。按Edmondson 法[6]進(jìn)行分級，根據(jù)腫瘤形態(tài)和分化程度分為Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ級10 例，均無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅱ級36 例，其中，20 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，16 例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅲ級38 例，其中，24 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，14 例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅳ級14 例，均有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。以上標(biāo)本均經(jīng)病理檢查核實(shí)。

1.2 主要試劑

Ezrin 鼠抗人單克隆抗體購自武漢博士德公司，Survivin 兔抗人單克隆抗體購自福州邁新公司。

1.3 操作方法

所有標(biāo)本用10%甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，最后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色、SP 免疫組織化學(xué)染色及光學(xué)顯微鏡觀察。根據(jù)SP 試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，一抗?jié)舛葹? ∶500，分別與陽性對照比較。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）替代一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

分別用高倍鏡和低倍鏡觀察切片，細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Ezrin 及Survivin 蛋白陽性表達(dá)。每個切片隨機(jī)選擇5 個高倍視野觀察，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比計(jì)分。染色強(qiáng)度：無色計(jì)0 分，淡黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分；陽性細(xì)胞數(shù)：≤5%計(jì)0 分，＞5%～25%計(jì)1 分，＞25%～50%計(jì)2 分，＞50%計(jì)3 分。最后計(jì)算染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)得分的乘積，0 分為（-），1、2、3 分為弱陽性（+），4、5 分為中度陽性（++），6 分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，3 組資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織與正常肝組織中Ezrin表達(dá)的比較

Ezrin 陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上，在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中呈片狀彌散分布，主要為弱陽性至中度陽性表達(dá)（見圖1）。正常對照組、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ezrin 陽性表達(dá)率分別為33.3%、42.5%和69.0%，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.795，P=0.012）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ezrin 的陽性表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2=6.814，P=0.009）；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ezrin 陽性表達(dá)水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.256，P=0.613）。見表1。

圖1 正常肝組織和原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中Ezrin 蛋白的表達(dá) （SP ×200）

表1 3 組Ezrin 陽性表達(dá)率的比較

2.2 原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織與正常肝組織中Survivin 表達(dá)的比較

Survivin 陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中呈片狀彌散分布，主要為中至強(qiáng)陽性表達(dá)（見圖2）。正常對照組、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Survivin 陽性表達(dá)率分別為0.0%、50.0%和84.5%，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.134，P=0.000）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Survivin 的陽性表達(dá)水平高于正常對照組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2=28.302 和13.510，均P=0.000）；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Survivin 陽性表達(dá)水平高于正常對照組（χ2=7.603，P=0.006）。見表2。

圖2 正常肝組織和原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中Survivin蛋白的表達(dá) （SP ×200）

表2 3 組Survivin 陽性表達(dá)率的比較

2.3 Ezrin、Survivin 表達(dá)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌臨床分級的關(guān)系

Ⅰ～Ⅳ級的原發(fā)性肝細(xì)胞癌Ezrin 與Survivin 的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示Ezrin 與Survivin表達(dá)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床分級無關(guān)。見表3。

2.4 Ezrin、Survivin 表達(dá)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌組織中，Ezrin 與Survivin 的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.458和0.489，均P=0.000）。

表3 不同臨床分級Ezrin 和Survivin 陽性表達(dá)的比較 例

3 討論

通過加強(qiáng)對肝癌分子病理機(jī)制的研究，找出與肝癌發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因素具有十分重要的臨床意義。越來越多的研究表明[7]，細(xì)胞骨架連接蛋白Ezrin 和細(xì)胞黏附分子是影響細(xì)胞黏附功能和腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展的重要物質(zhì)。Ezrin 在腫瘤發(fā)展、浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-9]。有文獻(xiàn)報道[10]，Ezrin的表達(dá)決定惡性腫瘤的吞噬功能，而吞噬功能則與惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ezrin 的表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明Ezrin 與腫瘤的進(jìn)展過程關(guān)系密切，其表達(dá)隨著惡性程度的增加呈上升趨勢。

Surivivin 蛋白是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，Survivin 具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織中，且與腫瘤的分化增殖、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)聯(lián)[11]。Survivin 屬凋亡抑制因子家族，定位于17q25 染色體，編碼143 個氨基酸；其獨(dú)特之處在于僅有一個氨基酸Zn2+結(jié)合的BIR 區(qū)，由一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)代替缺乏縮氨酸的指環(huán)結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)與Survivin 的抗凋亡機(jī)制關(guān)系密切[12]。研究表明[13]，正常成人組織除了胎盤和胸腺，其他組織的Survivin 含量較低，而在腫瘤細(xì)胞中Survivin mRNA 和蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)。結(jié)腸息肉、鮑恩病、乳腺腺瘤等癌前病變中也出現(xiàn)Survivin 的表達(dá)，提示Survivin 可出現(xiàn)于腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的早期，并參與惡性損傷轉(zhuǎn)化的整個進(jìn)程，但具體的參與方式尚不清楚。本研究中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Survivin 的表達(dá)水平高于正常對照組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Survivin 表達(dá)水平高于正常對照組，說明Survivin 與腫瘤的進(jìn)展過程關(guān)系密切，其表達(dá)隨著惡性程度的增加呈上升趨勢，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相符[14]。另外，本文發(fā)現(xiàn)Survivin 蛋白在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中呈過量表達(dá)的形式，推測Survivin 的異常表達(dá)可能發(fā)生于原發(fā)性肝細(xì)胞癌的早期階段。分析其原因可能為原發(fā)性肝細(xì)胞癌早期階段通過抑制細(xì)胞凋亡，而一些存在缺陷的基因細(xì)胞會繼續(xù)不停地生長，從而促進(jìn)基因突變的聚集，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生。分析Survivin 蛋白的表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)聯(lián)，隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Survivin 蛋白水平呈高表達(dá)，高表達(dá)的Survinvin 參與腫瘤細(xì)胞的生長及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的主要途徑是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可在早期出現(xiàn)，是原發(fā)性肝細(xì)胞癌判斷預(yù)后的重要因素之一。本研究中，原發(fā)性肝細(xì)胞癌Ⅰ～Ⅳ級患者Survivin 的表達(dá)水平無差異，說明Survivin 的表達(dá)水平與臨床分級無關(guān)。而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的Survivin 的表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示Survivin 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

綜上所述，Ezrin 與Survivin 在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的高表達(dá)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的侵襲性行為關(guān)系密切，可作為評估早期原發(fā)性肝細(xì)胞癌預(yù)后的指標(biāo)之一。