初發(fā)與復發(fā)急性B淋巴細胞白血病患兒單核細胞microRNA表達譜分析*

邱麗娟，世淑蘭，蒲剛玲，夏世梅，房建銘，田新

[昆明市兒童醫(yī)院（昆明醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院），云南省兒童重大疾病研究重點實驗室，云南 昆明 650228]

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia,ALL）是由于原始及幼稚淋巴細胞在造血組織異常增殖并可侵犯各組織臟器的一種造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病。根據(jù)白血病細胞的免疫表現(xiàn)型，分為急性B 淋巴細胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）和急性T 淋巴細胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL），統(tǒng)計顯示其中80%為B-ALL[1]。ALL的發(fā)病人群年齡最常見于＜5 歲及＞50 歲，其中80%為兒童[2]。ALL 患兒治療后可完全緩解，5年生存率可達到80%，遠高于成人ALL 患者30%～40%的3年總生存率[3-4]。即使如此，由于個體差異和化療藥物耐藥等問題，仍然存在部分ALL 患兒在誘導治療后復發(fā)，繼而面臨更差的預后結(jié)果。所以探索治療后的預后指征，以及初發(fā)與復發(fā)患者間的差異，對臨床治療具有重要的指導意義。

MicroRNA（miRNA）作為非編碼RNA 分子，可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達，參與細胞的生命活動，繼而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。大量研究證實miRNA 能夠影響造血細胞的分化以及多種腫瘤細胞增殖、分化和凋亡，與白血病密切相關。在B-ALL中，下調(diào)miR-3173 能通過蛋白酪氨酸蛋白激酶2促進細胞的浸潤[5]。miR-196b 在B-ALL 及T-ALL 中均低表達，可以通過結(jié)合C-myc癌基因的3'-端調(diào)控期轉(zhuǎn)錄[6]。同時，miR-196b/miR-1290 能通過調(diào)節(jié)ALL 中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3 的表達，參與白藜蘆醇的抗腫瘤作用[7]。在融合基因型t（2 ∶11）（p21 ∶q23）白血病和t（11 ∶14）（q24 ∶q32）B-ALL中miR-125b 高表達，與白血病的發(fā)生緊密相關[8]。結(jié)合臨床分析發(fā)現(xiàn)，miR-125b 與兒童ALL 的德國柏林法蘭克福蒙斯特化療方案的不良療效相關[9]。miR-16 在生存期長的患者組表達，高于生存期短的患者組，可作為T-ALL 的候選預后指示靶標[10]?；仡櫼酝芯浚喾NmiRNA 參與ALL 的發(fā)病，影響藥物的治療效果，甚至與預后相關[10]。但還沒有針對兒童B-ALL初發(fā)和復發(fā)患者血液中的單核細胞miRNA 表達譜差異的研究，而這些差異表達的miRNA 可能成為臨床治療的靶標分子和判斷預后的輔助指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采集3 例初發(fā)B-ALL[初發(fā)組（EX1）：EX1 1、EX1 2、EX1 3]、3 例復發(fā)B-ALL 患者[復發(fā)組（EX2）：EX2 1、EX2 2、EX2 3]及3 例無血液疾病的健康兒童[對照組（control）：control 1（NS815619）、control 2（NS706165）、control 3（NS596963）]的外周血。ALL 分型采用細胞形態(tài)學和免疫表型診斷。診斷標準滿足骨髓中原始/幼稚淋巴細胞比例≥20%，疾病分型參照WHO 2016 版分類標準，免疫分型采用多參數(shù)流式細胞術。形態(tài)學：細胞大小不一，胞漿量少，核漿比較高；胞漿呈藍色，可見空泡；核呈圓形或不規(guī)則形，偶見切跡及凹陷；染色質(zhì)細致-粗超；可見核仁1～3 個。標志物：CD19+、人類白細胞抗原-DR（HLA-DR）+、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）+、cCD79a+。復發(fā)診斷標準：①骨髓原始淋巴細胞+幼稚淋巴細胞＞5%～＜20%，經(jīng)過抗白血病治療1 個療程仍未達到骨髓完全緩解者；②骨髓原始淋巴細胞+幼稚淋巴細胞＞20%者；③髓外白血病細胞浸潤者；有其中三者之一視為復發(fā)。

1.2 方法

1.2.1 分離細胞3 ml EDTA 抗凝血中加入等體積Ficoll 分離液（德國Sigma 公司，10771），1 400 r/min離心20 min，取上、中層界面的單個核細胞層，用D-Hank's 液（北京百奧萊博科技有限公司，SJ0724）洗滌、1 050 r/min 離心5 min，重復1 次，取部分細胞重懸于生理鹽水中檢測細胞數(shù)及紅細胞的分離效果。剩余部分加入Trizol[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，15596-026]混勻后保存于超低溫冰箱備用。

1.2.2 核酸提取及建庫通過Trizol 裂解細胞，采用酚/氯仿抽提分離DNA 和RNA，吸取水相層與異丙醇混勻沉淀RNA，75%乙醇洗滌2 次獲得細胞總RNA。瓊脂糖電泳分析RNA 降解程度，Nanodrop [賽默飛世爾科技（中國）有限公司]檢測OD260/OD280 比值。使用Small RNA Sample pre Kit（中國北京Illumina 有限公司，RS200-0012）構(gòu)建文庫，Qubit[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]定量RNA 濃度，Agilent 2100[安捷倫科技（中國）有限公司]精確檢測RNA 完整性，上機進行HiSeq 檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

高通量測序平臺下機的原始數(shù)據(jù)，結(jié)合對測序序列（reads）、比對（mapped）和測序質(zhì)量的綜合分析，對篩選得到的sRNA 進行種類和數(shù)量分析。其中，利用miR Evo-v1.1 分析已知miRNA 數(shù)，整合miR Evo-v1.1 和miR deep2-0-0-5 預測新miRNA。差異表達分析使用基于負二項分布的DESeq2[11]，進一步行K-means/SOM 聚類分析。利用miRanda、PITA 和RNAhybrid 取交集行靶基因預測，然后通過GO[12]和KEGG[13]進行富集分析。Student-t檢驗計算不同樣本間各參數(shù)的差異，針對有生物重復的同一實驗組內(nèi)的樣本，使用DESeq R package（1.8.3）對不同組進行差異表達分析。P值使用Benjamini-Hochberg 方法進行矯正，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各個標本miRNA 檢測結(jié)果

對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進行篩選并選擇長度在18～35 nt 的sRNA，與miR Base 數(shù)據(jù)庫中指定范圍序列進行比對，獲得匹配上的sRNA 信息，包括比對上的miRNA 成熟體，miRNA 前體，sRNA 種類，sRNA個數(shù)。最終鑒定到的已知miRNA 成熟體（mature）和前體（hairpin）及novel miRNA（新的非同源miRNA）成熟體和前體的個數(shù)。見表1。

表1 鑒定的miRNA 及預測的相關miRNA

2.2 差異miRNA 的篩選

B-ALL 疾病組與對照組的miRNA 表達譜存在差異。統(tǒng)計測序所得miRNA 表達量（已知miRNA 及新miRNA），并利用每百萬條reads 的轉(zhuǎn)錄本（transcripts per million,TPM）進行表達量歸一化處理（公式為：單一miRNA reads 數(shù)×106/總reads 數(shù)），來校準miRNA 的表達量，根據(jù)TPM 密度分布，各樣本的基因表達模式見圖1A。通過計算Pearson 相關系數(shù)的平方，反映實驗組內(nèi)獨立樣本間基因表達水平相關性，結(jié)果顯示每組內(nèi)的3 個獨立樣本的相似度較高（見圖1B）。其中，對照組的R2＞0.922，復發(fā)組的R2＞0.886，初發(fā)組的R2＞0.896（1.00，完全相關；0.70～＜1.00，高度相關；0.40～＜0.70 中度相關；0.10～＜0.40，低度相關；＜0.10，微弱或無相關）。

通過差異倍數(shù)（fold change）和校正后的水平（校正后Padj/ Qvalue）評估每組樣本之間miRNA 的表達差異，篩選出差異的miRNA，結(jié)果顯示EX1 VS control，173 miRNA 上調(diào)，193 miRNA 下調(diào)，EX2 VS control，176 miRNA 上調(diào)，201 miRNA 下調(diào)，存在較多差異表達的miRNA。但是EX1 vs EX2，10 miRNA上調(diào)，10 miRNA 下調(diào)，存在表達差異（見圖2）。

每個實驗組均含有3 個樣本（初發(fā)組、復發(fā)組、對照組），即生物學重復，所以根據(jù)校正后P＜0.05 的條件篩選獲得20 個差異表達的miRNAs，其中差異較大的5 個miRNA 分別為has-miR-30a-3p，has-miR-30a-5p，has-miR-30c-2-3p，has-miR-139-5p，hasmiR-99b-5p。見表2。

2.3 差異miRNA 分析

利用疾病組和對照組之間的兩兩比較所得miR集的并集在每個組/樣本中的TPM 值，進行層次聚類分析（見圖3A）。將差異miRNA 進行統(tǒng)計，繪制差異miRNA 維恩圖，反映各組樣本的miRNA 差異表達集（見圖3B）。

2.4 靶基因預測及富集分析

根據(jù)基因功能國標標準分類體系，結(jié)合篩選到的差異表達miRNA 靶基因（候選靶基因），獲得Gene Ontology 富集分析結(jié)果（見表3）。差異表達miRNA對應靶基因主要功能集中在細胞質(zhì)、細胞內(nèi)組分、蛋白結(jié)合、細胞內(nèi)、細胞質(zhì)部分。

結(jié)合3 種基本分類[生物學過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）]，針對EX1 VS EX2，大部分的候選靶基因功能為CC，少數(shù)為BP 和MF（見圖4）。

圖1 樣本miRNA 表達量TPM 密度分布及樣品間相關性

圖2 差異miRNA 的火山圖

表2 miRNA 表達差異分析結(jié)果（前5）

根據(jù)KEGG 公共數(shù)據(jù)庫，基于復發(fā)組和初發(fā)組差異表達miRNA 對應的候選基因，富集的Pathway 前4名包括糖代謝、AMPK 信號通路、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝、mTOR 信號通路，但校正后的P值差異無統(tǒng)計學意義（見表4）。

圖3 差異表達miRNA 集及其聚類分析

表3 樣品中候選靶基因的Gene Ontology 富集列表（前5）

圖4 候選靶基因GO 富集柱狀圖

表4 候選靶基因KEGG 顯著性富集列表（前4）

3 討論

ALL 疾病的發(fā)生是多種遺傳學與分子生物學異常的綜合結(jié)果，目前其臨床治療以化療為主，兒童ALL治療緩解率較高。但是一旦出現(xiàn)復發(fā)，患兒的治療效果會明顯降低，甚至死亡。另外，研究發(fā)現(xiàn)miRNA 參與包括DNA 修復、病毒防御、發(fā)育、造血過程、細胞增殖、細胞凋亡等很多生物過程，研究ALL 發(fā)病中miRNA 的作用機制具有重要意義。miRNA 可以為ALL 分型提供參考，有研究組通過對比T-ALL 和B-ALL 的miRNA 表達情況，篩選獲得不同型急性淋巴細胞白血病的差異表達miRNA[14]。同時，有研究提出可將miRNA 作為區(qū)分判斷急性髓系白血病和ALL的參考因素[15]。針對B-ALL，還有研究專門針對兒童發(fā)病人群，篩選到發(fā)病預測分子靶標（miR-326）。本研究通過對比復發(fā)和初發(fā)患者miRNA 表達譜，分析miRNA 在復發(fā)的ALL 病例中的差異變化，發(fā)現(xiàn)20 個差異表達的miRNA，可能為篩選今后區(qū)分復發(fā)和初發(fā)ALL 患者的靶標提供參考，為白血病發(fā)病機制研究提供新思路。

除此以外，miRNA 與ALL 的疾病發(fā)展和臨床治療密切相關。在動物模型中，共表達miR-125b 和Bcr/Abl 融合基因能使小鼠患白血病[8]，提示miRNA直接參與了白血病的發(fā)病。通過統(tǒng)計分析397 例ALL兒童患者不同藥物的化療效果和其miRNA 表達情況，發(fā)現(xiàn)miRNA 與藥物療效之間密切關聯(lián)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，復發(fā)患者和初發(fā)患者差異表達的5 個miRNAs：has-miR-30a-3p，has-miR-30a-5p，has-miR-30c-2-3p，has-miR-139-5p，has-miR-99b-5p。其中，miR-30a 被證實在ALL 中和MYC 及MYBL2 癌基因的調(diào)控相關[17-18]。miR-30a-5p 在乳腺癌、腸癌和非小細胞肺癌中的異常表達，影響癌癥的發(fā)展和治療效果[19-22]，提示miR-30a 可以作為腫瘤治療的候選靶點。miR-139-5p 在髓系白血病和T-ALL 中表達受到抑制，可能作為腫瘤候選治療靶點[23-25]。并且miR-30a 和miR-139-5p 均在腫瘤中參與P53信號的調(diào) 控[23，26]。本研究結(jié)果顯示，B-ALL 復發(fā)組與初發(fā)組中miR-30a 和miR-139-5p 的差異表達，提示復發(fā)B-ALL 中P53 信號通路可能發(fā)揮重要作用。has-miR-30c-2-3p 和has-miR-99b-5p 與白血病相關的研究報道較少，有研究發(fā)現(xiàn)慢性粒細胞白血病中檢測到miR-99b下調(diào)，在1 項篩選白血病相關的研究中發(fā)現(xiàn)髓系白血病中miR-30c 下調(diào)[26-27]。結(jié)合本研究結(jié)果中miR-30c和miR-99b 表達量在初發(fā)和復發(fā)組之間發(fā)生改變，提示其可能在B-ALL 復發(fā)期間分別發(fā)揮抑制或促進作用。

差異表達的miRNA 候選靶基因在疾病組與正常對照組和復發(fā)組與初發(fā)組間的富集結(jié)果存在差異，值得注意的是，復發(fā)組與初發(fā)組間候選靶基因GO 富集結(jié)果提示大部分基因?qū)儆诩毎煞址诸悺Ｌ崾緩桶l(fā)與初發(fā)期比較，包括細胞質(zhì)、細胞內(nèi)、細胞表面蛋白結(jié)合等細胞結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化。同時，糖代謝異常是影響白血病預后的因素之一，本研究中復發(fā)組與初發(fā)組間的差異預示糖代謝在復發(fā)過程中發(fā)揮促進作用[28]。結(jié)合LKBI-AMPK-mTOR 信號通路在調(diào)節(jié)細胞代謝、生長、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用的前期研究結(jié)論[29]，即使矯正P＞0.05，但其調(diào)控miRNA 變化倍數(shù)大于2，可推測其參與B-ALL 的復發(fā)，但具體的調(diào)控作用，需進一步的研究。總的來說，對復發(fā)B-ALL 與初發(fā)B-ALL 的區(qū)別研究，將為更準確地探討ALL 發(fā)病機制提供思路，篩選其差異表達miRNA 譜從miRNA 水平為B-ALL 的研究提供了數(shù)據(jù)基礎。