Rho/ROCK激酶信號通路在大鼠宮腔粘連中的作用

黃博，李雋，董蘭，鐘亞娟，程靜，黃志欣

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430060）

宮腔粘連又稱Asherman 綜合征，是由多種病因?qū)е伦訉m內(nèi)膜基底層脫落或受損后出現(xiàn)的子宮內(nèi)膜纖維化并形成粘連帶，導(dǎo)致宮腔部分或全部閉鎖。其主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)異常（可為經(jīng)量減少或繼發(fā)性閉經(jīng)），周期性下腹痛，繼發(fā)不孕及異常妊娠（包括復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胎死宮內(nèi)及胎盤異常）等[1-2]，嚴重影響育齡女性的身體健康和生活質(zhì)量。近年來，宮腔粘連的發(fā)病率越來越高，其發(fā)病機制及防治方法仍是婦科生殖領(lǐng)域研究的難題。針對宮腔粘連的治療主要是宮腔鏡直視下分離粘連并術(shù)后放置宮內(nèi)節(jié)育器、球囊支架等，可以輔以防粘連材料[3-5]及雌激素治療。宮腔粘連最重要的治療策略就是抑制子宮內(nèi)膜纖維化，促進子宮內(nèi)膜的再生和功能恢復(fù)，目前對其作用機制研究較少，故治療上一直無突破。因此，探索宮腔粘連的發(fā)病機制，并尋求有效的靶點阻斷子宮內(nèi)膜纖維化，促進子宮內(nèi)膜的再生修復(fù)是臨床工作者共同面臨的一大挑戰(zhàn)。

相關(guān)研究已證實[6-9]，Rho/ROCK 信號通路能夠調(diào)控細胞增殖，參與組織損傷修復(fù)和再生，如肝纖維化、原發(fā)性高血壓腎纖維化、肺纖維化等，提示該信號通路在組織纖維化進程中具有重要作用。Rho 蛋白為Ras 蛋白超家族成員之一，包括RhoA、RhoB 和RhoC 3 種分子，Rho 通過與鳥苷三磷酸（GTP）結(jié)合，觸發(fā)下游激酶級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮多種生物學(xué)功能[10]。ROCK又稱Rho 激酶，是目前功能研究最為詳細的Rho 下游靶效應(yīng)分子[11]，有ROCKI 與ROCKII 2 種亞型，ROCK接受Rho 傳導(dǎo)的活化信號，使多個氨基酸位點被磷酸化而激活，從而介導(dǎo)下游的一系列磷酸化/脫磷酸反應(yīng)[12]。Rho/ROCK 信號通路活化可使肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase,MLCP）上的肌球蛋白輕鏈（myosin light chain,MLC）亞單位磷酸化，MLCP 活性降低，從而阻礙MLC 脫磷酸化，提高成纖維細胞內(nèi)MLC 磷酸化水平，增加肌球蛋白和肌動蛋白交聯(lián)[13]，進而誘導(dǎo)細胞骨架重組、細胞遷移和應(yīng)力纖維形成，參與組織纖維化病變。本研究采用宮腔注射95%無水乙醇復(fù)制大鼠宮腔粘連模型[14]，并分析宮腔粘連大鼠模型子宮內(nèi)膜組織中Rho/ROCK 信號通路相關(guān)蛋白的表達與宮腔粘連及TGF-β1表達的關(guān)系，探討其可能的作用機制，為預(yù)防宮腔粘連及術(shù)后復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

蘇木精-伊紅染液（HE）（珠海貝索公司），二抗試劑盒（北京中杉金橋公司），Vimentin、Keratin、TGF-β1、RhoA、RhoC、ROCKI、ROCKII 抗體（英國Abcam 公司），RhoB（北京博奧森公司）。光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司，IX73 型），明美顯微數(shù)碼測量分析系統(tǒng)（廣州明美光電技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗動物

健康SD 清潔級雌性大鼠32 只（國家實驗動物種子中心上海分中心暨上海斯萊克實驗動物有限責任公司），體重250～270g，9 周齡左右。實驗中對動物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標準。

1.3 方法

1.3.1 大鼠宮腔粘連模型的復(fù)制隨機將大鼠分為模型組和對照組，每組16 只。兩組大鼠均正常飲水及進食。模型組大鼠按350mg/kg 10%水合氯醛麻醉，光照維持體溫（37.0±0.5）℃。無菌手術(shù)切開腹壁，打開腹腔，緩慢挑出“Y”型子宮，動脈夾夾閉每側(cè)子宮上下兩端，在子宮最下端入針，注射0.5ml 95%乙醇，3min 后吸出乙醇，生理鹽水沖洗2 遍，切口創(chuàng)面覆蓋濕紗布?；謴?fù)正常子宮解剖位置，再用生理鹽水沖洗腹腔后逐層關(guān)腹。術(shù)后3d 肌內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。對照組大鼠陰道插管，宮腔灌注等量生理鹽水。每天觀察大鼠進食、排便及精神狀況。

1.3.2 大鼠子宮解剖形態(tài)的觀察模型復(fù)制后第15 天，兩組大鼠體重無明顯差異，恢復(fù)良好。處死所有大鼠，手術(shù)取兩組大鼠子宮，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟切片，HE 染色，觀察子宮形態(tài)學(xué)變化。采用明美顯微數(shù)碼測量分析系統(tǒng)測量子宮內(nèi)膜厚度，每張圖片選取3 個位置量取，取平均值，不同樣本選取的位置盡量一致；同時在光學(xué)顯微鏡下，每組隨機選取5 個切片，每個切片隨機選取6 個視野進行腺體計數(shù)，取平均值。

1.3.3 免疫組織化學(xué)SP 法檢測大鼠子宮內(nèi)膜組織中角蛋白、波形蛋白、Rho/ROCK 信號通路相關(guān)蛋白及TGF-β1 的表達以上石蠟切片標本脫蠟水化，3%過氧化氫H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，進行抗原修復(fù)，室溫下非免疫羊血清封閉20min，吸去多余血清，滴加適當稀釋的第一抗體，4℃過夜。加二抗，37℃溫箱中培育0.5h。滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37℃溫箱中培育0.5h。以上各步驟結(jié)束后均用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，5min/次。滴加新鮮配制的DAB 溶液，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染、脫水、封片。用已知陽性片作陽性對照，用PBS 代替第一抗體作陰性對照。

1.3.4 結(jié)果判斷子宮內(nèi)膜上皮細胞中有黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞，先低倍鏡后高倍鏡，每張切片選取5 個陽性視野，采用Image-Pro-Plus 軟件分析累積光密度（IOD）值和平均光密度（AOD）值，計算TGF-β1及Rho/ROCK 信號通路相關(guān)蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 8.0 軟件統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的子宮形態(tài)

復(fù)制模型后第15 天，模型組大鼠“Y”形子宮變得粗細不均，不順滑，韌性變差；對照組大鼠子宮腔形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，分為內(nèi)膜層、肌層和外膜層，子宮內(nèi)膜呈單層柱狀上皮結(jié)構(gòu)，覆蓋宮腔表面，子宮內(nèi)膜腺體豐富，呈橢圓形或圓形，主要位于黏膜下層和基底層（見圖1）。模型組子宮腔變小，子宮內(nèi)膜變薄，子宮內(nèi)膜厚度為（211.283±47.059）μm，與對照組（455.979±58.824）μm 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.567，P=0.003）；模型組子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)松散甚至壞死，未見明顯波浪形，部分上皮內(nèi)膜缺失，連續(xù)性中斷，組織開始纖維化粘連，子宮內(nèi)膜腺體萎縮，腺體數(shù)目為（1.333±0.308）個，與對照組（5.667±1.385）個比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.256，P=0.003），模型組腺體數(shù)目減少（見圖2）。

2.2 大鼠子宮內(nèi)膜組織角蛋白及波形蛋白的表達

對照組子宮內(nèi)膜的柱狀上皮細胞呈棕黃色顆粒，可見分布均勻的角蛋白，而模型組陽性著色很少；對照組角蛋白表達量為（0.033±0.003），模型組角蛋白表達量為（0.004±0.001），兩組比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=71.155，P=0.000），模型組中角蛋白表達下降。波形蛋白呈棕黃色顆粒，沉積于子宮內(nèi)膜間質(zhì)的基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞中，對照組表達量為（0.040±0.012），模型組表達量為（0.029±0.003），兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.167，P=0.071）。見圖3。

2.3 大鼠子宮內(nèi)膜組織中TGF-β1 的表達

圖1 兩組大鼠子宮的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化

圖2 兩組大鼠子宮內(nèi)膜和腺體的變化

對照組和模型組TGF-β1蛋白的表達量分別為（0.003±0.000）和（0.013±0.001），兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=59.450，P=0.000），模型組TGF-β1表達升高。見圖4。

圖3 兩組大鼠子宮內(nèi)膜組織角蛋白及波形蛋白的表達

2.4 大鼠子宮內(nèi)膜組織中Rho/ROCK 信號通路相關(guān)蛋白的表達

兩組大鼠子宮內(nèi)膜的RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII 表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），模型組子宮內(nèi)膜RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII 的表達均升高。見表1和圖5～9。

圖4 兩組大鼠子宮內(nèi)膜組織TGF-β1 的表達

表1 兩組大鼠RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII 表達量比較 （±s）

表1 兩組大鼠RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII 表達量比較 （±s）

組別 RhoA RhoB RhoC ROCKI ROCKII模型組 0.014±0.001 0.018±0.001 0.028±0.006 0.026±0.003 0.003±0.001對照組 0.023±0.002 0.004±0.002 0.012±0.001 0.013±0.002 0.001±0.000 t 值 43.368 63.570 58.958 28.452 69.093 P 值 0.001 0.000 0.000 0.002 0.000

圖5 大鼠子宮內(nèi)膜組織RhoA 的表達（免疫組織化學(xué)染色×400）

圖6 大鼠子宮內(nèi)膜組織RhoB 的表達（免疫組織化學(xué)染色×400）

圖7 大鼠子宮內(nèi)膜組織RhoC 的表達（免疫組織化學(xué)染色×400）

圖8 大鼠子宮內(nèi)膜組織ROCKI 的表達（免疫組織化學(xué)染色×400）

圖9 大鼠子宮內(nèi)膜組織ROCKII 的表達（免疫組織化學(xué)染色×400）

3 討論

子宮內(nèi)膜纖維化和子宮內(nèi)膜再生障礙是宮腔粘連形成的關(guān)鍵[15]。有效的子宮內(nèi)膜損傷動物模型是研究該類疾病發(fā)生、發(fā)展和治療反應(yīng)等不可或缺的支撐條件[16]。本研究大鼠模型復(fù)制成功后，模型組大鼠子宮變得粗細不均，不順滑，韌性變差；子宮腔變小，子宮內(nèi)膜明顯變薄；腺體萎縮、數(shù)目減少。故注射無水乙醇可復(fù)制穩(wěn)定的大鼠宮腔粘連動物模型。角蛋白作為子宮內(nèi)膜上皮細胞標志物，會隨組織膜纖維化程度的增加而減少[17]，本研究結(jié)果也顯示，宮腔粘連模型組中角蛋白表達下降。波形蛋白作為間質(zhì)細胞標志物，在子宮內(nèi)膜受損初期，基質(zhì)細胞明顯減少時表達下降，隨著損傷的修復(fù)，子宮內(nèi)膜上皮發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，波形蛋白表達逐漸增加，表明波形蛋白可能參與了組織修復(fù)及纖維化，本實驗中，兩組波形蛋白的表達無差異，考慮與子宮內(nèi)膜腺上皮損傷修復(fù)及纖維化程度有關(guān)。

研究認為[18-19]，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是宮腔粘連的可能發(fā)病機制之一，子宮內(nèi)膜基底層損傷后，上皮細胞再生障礙，其向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化并獲得遷移能力，導(dǎo)致成纖維細胞不斷增殖及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）過度沉積，同時子宮內(nèi)膜增生受到抑制，內(nèi)膜組織逐漸被纖維結(jié)締組織取代，出現(xiàn)內(nèi)膜纖維化，進而導(dǎo)致宮腔組織粘連。TGF-β1蛋白主要表達于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)中，是最主要的促纖維形成細胞因子，通過結(jié)合成纖維細胞膜上特異性受體而發(fā)揮作用。在正常的生理條件下，成纖維細胞釋放的纖維蛋白原和纖維蛋白溶解處于動態(tài)平衡，但在病理條件下，TGF-β1通過刺激ECM 的合成，從而誘導(dǎo)合成纖溶酶原活化因子抑制（PAI-1）和金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP），進而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）的表達和活性，進一步導(dǎo)致ECM 合成和降解紊亂，使ECM 沉積。ECM 大量堆積在子宮內(nèi)膜中，內(nèi)膜中結(jié)締組織逐漸生成，最終導(dǎo)致纖維化，形成宮腔粘連[20]。國內(nèi)外研究結(jié)果顯示，TGF-β1子宮內(nèi)膜的高表達與宮腔粘連的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，并隨宮腔粘連疾病嚴重程度的加重而升高[21-22]。本研究也顯示，模型組大鼠子宮內(nèi)膜中TGF-β1表達高于對照組，TGF-β1參與大鼠宮腔粘連的形成。

近年來，Rho/ROCKI 信號通路在組織器官纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的作用已受到廣泛關(guān)注。已有研究表明，TGF-β1通過激活RhoA 誘導(dǎo)腹膜纖維化病變[23]；TGF-β1能夠直接在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)RhoB[24]及RhoC[25]的表達。TGF-β1也可通過激活ROCK 導(dǎo)致組織纖維化病變[26-27]。TGF-β1通過激活Rho/ROCK 信號通路誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[28]，誘導(dǎo)尿道瘢痕成纖維細胞纖維化[29]病變及心房重構(gòu)[30]。有文獻報道，激活ROCKI 可促進子宮內(nèi)膜纖維化[31]。上述一系列研究表明，Rho/ROCK 是TGF-β1重要的下游信號通路，也是其促組織纖維化的重要分子機制。但TGF-β1和Rho/ROCKI 信號通路在子宮內(nèi)膜纖維化進程中的作用尚未見報道。本研究顯示，模型組大鼠子宮內(nèi)膜的Rho（RhoA、RhoB、RhoC）、Rho 激酶（ROCKI、ROCKII）及TGF-β1的表達高于對照組，推測TGF-β1可能通過激活Rho/ROCK 信號通路促使子宮內(nèi)膜損傷后組織纖維化，導(dǎo)致宮腔粘連。Rho/ROCK 信號通路很有可能成為新的、有前景的治療靶點，也為臨床治療宮腔粘連提供合理有效的方法。