D-半乳糖聯(lián)合對氯苯丙氨酸致腎不藏志不寐大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)和凋亡基因的實驗研究

任小娟，張星平，王慶全，王冠英

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

不寐病隸屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)失眠癥，其病因病機復(fù)雜，辨證思路多樣，臨床表現(xiàn)各異。中醫(yī)治療不寐病具有較好的臨床療效，但由于辨證論治的多樣性導(dǎo)致其重復(fù)性較低。本課題組根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》的五神理論、藏象理論以及后世醫(yī)家相關(guān)理論，結(jié)合五臟辨證提出中醫(yī)不寐五神分型診斷法[1]。該分型與五臟辨證相吻合[2]，受中醫(yī)師個體辨證傾向影響較小，客觀性強，可操作性、可重復(fù)性強，也頗有療效，便于臨床、科研推廣運用。具體包括腎不藏志不寐、心不藏神不寐、肺不藏魄不寐、肝不藏魂不寐和脾不藏意不寐。其中腎不藏志不寐為中醫(yī)不寐五神分型中較為常見的證型，主癥為夜寐早寤，病位在腎，其病因為陰、陽、氣、血、痰、瘀、寒、熱等各種原因?qū)е履I臟的虛損，核心病機是腎志不入于舍，即腎不藏志[3]。

腎不藏志不寐是以早寤(早醒)為主要臨床特征，多見老年人。這不僅與我們前期腎不藏志不寐臨床研究相一致，而且與ANWAR E AHMED研究所發(fā)現(xiàn)的老年失眠多導(dǎo)睡眠圖(PSG)中早醒的睡眠特征相吻合[4]。故我們選擇衰老大鼠進(jìn)行睡眠剝奪建立腎不藏志不寐大鼠。D-半乳糖致亞急性衰老和對氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠是衰老研究和失眠研究中常用經(jīng)典造模方法[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)與睡眠有著密切聯(lián)系[7]；凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)和促凋亡因子Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)不僅與衰老有關(guān)[8]，還與睡眠密切相關(guān)[9]。因此，本實驗采用D-半乳糖聯(lián)合PCPA建立腎不藏志不寐大鼠，從神經(jīng)遞質(zhì)和凋亡基因角度，觀察該模型大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)和凋亡基因表達(dá)的變化，通過定位航行探索運動軌跡熱圖觀察該模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，為腎不藏志不寐的進(jìn)一步研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：SYXK(新)2018-0003。造模前將各組大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后隨機分成4組，每組10只，包括：空白對照組、老年組、失眠組和腎不藏志不寐組(模型組)。

1.2 主要藥品與試劑

D-半乳糖，北京索來寶公司(批號：1013G051)；對氯苯丙氨酸(PCPA)，美國Sigma公司(批號：SHBJ7057)；熒光定量PCR試劑盒由日本Takara公司提供。GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2、Bax、Bcl-2引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。

1.3 動物模型的建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后每組大鼠予以對應(yīng)處理，具體如下。

空白對照組：大鼠予以生理鹽水120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)42 d，然后生理鹽水300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d；老年組：大鼠予以D-半乳糖120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)42 d，然后予生理鹽水300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d；失眠組：大鼠予以生理鹽水120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)42 d，然后PCPA 300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d；腎不藏志不寐組：大鼠予以D-半乳糖120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)42 d，然后PCPA 300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 大鼠體質(zhì)量變化

造模結(jié)束后(第46天)，測量各組大鼠體質(zhì)量，觀察各組大鼠體質(zhì)量變化。

1.4.2 大鼠定位航行探索運動軌跡的比較

采用Morris水迷宮觀察大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，利用水迷宮裝置觀察大鼠找到平臺所需的時間，于第6天記錄大鼠找到目標(biāo)平臺的定位航行探索運動軌跡，比較各組大鼠定位航行探索運動軌跡。

1.4.3 下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA相對表達(dá)量的測定

造模結(jié)束了，水合氯醛麻醉大鼠，冰上取大鼠腦組織，分離下丘腦，提取mRNA用于RT-PCR實驗。RNA提取及cDNA合成參照試劑盒說明書進(jìn)行，合成cDNA進(jìn)行PCR擴增。采用 Primer 3軟件設(shè)計 RT-PCR 引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s，退火10 s(退火溫度：GABAARα1亞單位為60 ℃、GABAARβ2亞單位為60 ℃、GABAARγ2亞單位為60 ℃)，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)后，95 ℃延伸15 s，60 ℃延伸1 min。將目的基因擴增結(jié)果經(jīng)內(nèi)參照校正后，以空白對照組目的基因擴增結(jié)果作為對照，2-△△ct法表達(dá)為mRNA的相對表達(dá)，計算其余各樣本與空白對照組的比值，作相對定量分析，最終結(jié)果以相對定量結(jié)果表示。

1.4.4 下丘腦Bax、Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量的測定

下丘腦cDNA合成步驟同上。采用 Primer 3軟件設(shè)計RT-PCR引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s，退火10 s(退火溫度：Bax亞單位為62 ℃、Bcl-2亞單位為62 ℃)，余步驟同上。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量的比較

與空白對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯減少(P<0.01；與模型組比較，失眠組、老年組大鼠體質(zhì)量均明顯增加(P<0.01)。見圖1。

注:A:空白對照組；B:老年組；C:失眠組；D:模型組；與空白組比較，##P<0.01;與模型組比較，**P<0.01圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化

2.2 定位航行探索運動軌跡的比較

與空白對照組比較，失眠組、老年組和模型組運動軌跡均明顯延長，其中模型組找到目標(biāo)靶平臺運動軌跡最長。軌跡熱圖見圖2。

2.3 下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2 mRNA的相對表達(dá)量

與空白組比較，模型組大鼠下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的相對表達(dá)量均顯著減少(P<0.05，P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，老年組大鼠下丘腦GABAARα1的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，失眠組大鼠下丘腦GABAARβ2的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，老年組和失眠組大鼠下丘腦GABAARγ2的相對表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)。見圖3。

2.4 下丘腦Bax、Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量

與空白組比較，老年組、模型組大鼠下丘腦Bax mRNA的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，老年組、模型組大鼠下丘腦Bcl-2mRNA的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，失眠組下丘腦Bax mRNA的相對表達(dá)量顯著減少(P<0.05)，失眠組大鼠下丘腦Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，老年組大鼠下丘腦Bax和Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)。見圖4。

注:A:空白對照組；B:老年組；C:失眠組；D:模型組；與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05圖3 下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的相對表達(dá)量

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)老年人隨著年齡的增加會伴隨認(rèn)知能力的下降[10]，失眠會增加老年人癡呆的風(fēng)險[11]，這說明老年失眠會出現(xiàn)認(rèn)知能力的下降。Morris水迷宮(MWM)實驗可以分析動物的定位導(dǎo)航能力和空間探索能力，是推斷實驗動物的學(xué)習(xí)記憶能力的常用方法[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)腎不藏志不寐大鼠探索目標(biāo)平臺的運動軌跡明顯長于正常大鼠，提示腎不藏志不寐大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。

γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它能夠抑制神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠起到催眠、鎮(zhèn)靜和抗焦慮等功能[13]。GABA是通過與其受體相結(jié)合產(chǎn)生神經(jīng)抑制性作用發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用，其受體包括GABAA受體(GABAAR)、GABAB受體(GABABR)和GABAC受體(GABACR)[14]。其中GABAAR是離子通道型受體，是很多臨床常用的鎮(zhèn)靜、抗焦慮及抗驚厥藥等的靶受體[15]。GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2型受體較常見，它們對睡眠的調(diào)節(jié)作用起著重要的影響[16]。JO K[17]研究發(fā)現(xiàn)黃精的水提取物能夠增加大鼠皮質(zhì)GABAARγ2蛋白表達(dá)從而改善睡眠。本研究發(fā)現(xiàn)腎不藏志不寐大鼠下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的相對表達(dá)量均低于對照組，提示腎不藏志不寐的機制可能與下丘腦抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA基因表達(dá)下降有關(guān)。

睡眠具有保護(hù)神經(jīng)元，防止和修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用[18]。B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)蛋白家族是第一個被發(fā)現(xiàn)參與凋亡調(diào)控過程的基因家族，在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[19]。Bcl-2家族成員由抗凋亡蛋白(Bcl-2，Bcl-2L和Bcl-w)和促凋亡蛋白(Bax，Bak，Bad，Bim和Bit等)組成[20]。其主要功能是直接調(diào)節(jié)線粒體膜的滲透性，調(diào)節(jié)促凋亡因子Bax的釋放，從而發(fā)揮抗凋亡或促凋亡的作用。促凋亡成員和抑凋亡成員的比例可促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其中以Bcl-2和Bax最具代表性[21]。有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax比例在晚上睡眠時間最高，而在失眠24 h之后發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax比例會下降[22]。ARTAMOKHINAI V等發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Bax在睡眠覺醒周期中也發(fā)揮著重要作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)腎不藏志不寐大鼠下丘腦Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量低于對照組，Bax mRNA的相對表達(dá)量高于對照組，提示腎不藏志不寐的機制可能與下丘腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本實驗研究了D-半乳糖聯(lián)合PCPA建立的腎不藏志不寐大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)和凋亡基因。結(jié)果表明，腎不藏志不寐大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)基因GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的表達(dá)較正常對照組下調(diào)，下丘腦凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)較正常對照組下調(diào)，Bax mRNA的表達(dá)較正常對照組上調(diào)。腎不藏志不寐大鼠模型的建立是腎不藏志不寐臨床研究和實驗研究的基礎(chǔ)，神經(jīng)遞質(zhì)和凋亡基因的調(diào)控可以作為腎不藏志不寐實驗研究的新的切入點。