養(yǎng)陰活血解毒方對實驗大鼠肝組織相關(guān)標(biāo)志性蛋白表達的影響

梁小文，張鈺斌，馬超，謝鴻恩，陳啟紅，劉中景

(粵北第二人民醫(yī)院感染科，廣東 韶關(guān) 512028)

肝硬化及其并發(fā)癥是當(dāng)下臨床醫(yī)生所面對的主要肝病人群，也是臨床治療難題，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏有效治療藥物，西藥抗病毒治療只能在一定程度上控制病情，仍然不能阻止肝硬化的反復(fù)發(fā)病甚至逆轉(zhuǎn)肝硬化[1]。近年來，大量的臨床與基礎(chǔ)研究工作業(yè)已證實，中醫(yī)中藥在抗肝硬化方面有著明顯治療優(yōu)勢[2],其機理主要表現(xiàn)在拮抗肝星狀細胞(HSC)的活化；抑制活化的HSC細胞增殖與膠原生成；調(diào)節(jié)肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶活性，逆轉(zhuǎn)肝竇毛細血管化等等[3]。一致認(rèn)為“扶正化瘀”為中醫(yī)治療肝硬化的基本原則[4]，而滋養(yǎng)肝腎活血化瘀中藥處方具有明顯的抗肝纖維化效果[5]。

我們在長期臨床實踐的基礎(chǔ)上總結(jié)發(fā)現(xiàn)，肝腎陰虛、瘀血濕熱是肝硬化多見中醫(yī)證型之一，滋養(yǎng)肝腎、活血解毒治療可以取得較好的臨床效果，本研究在長期臨床實踐的基礎(chǔ)上觀察養(yǎng)陰活血解毒方對實驗大鼠肝組織相關(guān)標(biāo)志性蛋白表達的影響，探討其抗肝纖維化的作用機理。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD大鼠共60只，體質(zhì)量150～200 g，由青島市疾病控制中心動物實驗中心提供(合格證號：sexk20180020)。

1.2 藥物

中藥：由粵北第二人民醫(yī)院中藥房提供，資格中藥師鑒定真?zhèn)?。養(yǎng)陰活血解毒方：柴胡15 g，香附12 g，川芎12 g，丹參15 g，桃仁12 g，紅花12 g，白芍15 g，熟地黃15 g，麥冬15 g，枸杞15 g，茵陳15 g，白花蛇舌草15 g。以上藥物先冷水浸泡約1 h，武火煮沸后改用文火煎至40 min，二次復(fù)煎去渣取汁，合和混均并水浴濃縮至濃度為0.75 kg/L，制成水煎夜放置冰箱備用。

西藥：秋水仙堿(浙江華海藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030016)，粵北第二人民醫(yī)院西藥房提供。換算成大鼠用藥劑量，每次用藥劑量為成人每日用藥劑量(1 mg/60 kg)的20倍，即0.25 mg/kg，蒸餾水調(diào)制，藥液濃度為0.025 g/L，冰箱貯備。

2 實驗方法

2.1 造模

按照相關(guān)文獻[6]，CCl4與花生油二者均購于廣州市光明化學(xué)股份有限公司。兩者以4∶6比例配成40%制劑，除空白對照組外，其余各組大鼠均執(zhí)行CCl4制劑腹腔注射。首次以0.5 mL/100 g體質(zhì)量劑量，后繼續(xù)以0.3 mL/100 g體質(zhì)量劑量注射，每周2次，約第4周末大鼠中期肝纖維化形成，繼續(xù)維持注射至第12周。實驗結(jié)束后以戊巴比妥鈉0.5 g加生理鹽水腹腔麻醉注射，打開腹腔，摘取肝組織-20 ℃保存，做相關(guān)指標(biāo)檢測。

2.2 給藥及分組

60只雄性SD大鼠隨機分為4組，即空白組、模型組、西藥組和中藥組，每組15只。于造模后第4周末大鼠中期肝纖維化形成[6]開始灌胃給藥?？瞻捉M和模型組以生理鹽水2mL每天2次；西藥組以秋水仙堿制劑按大鼠0.1 mg/kg體質(zhì)量劑量給藥；中藥組以中藥制劑2 mL每天2次給藥。共給藥8周。

2.3 檢測方法

肝組織羥脯氨酸含量測定采用比色法，參考相關(guān)文獻[7]。主要試劑：羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，枸櫞酸鈉緩沖液，二甲氨基苯甲醛液，Tris緩沖液等(武漢博歐特生物科技有限公司提供)；胰蛋白酶(廣州輝駿生物科技有限公司提供)。取10 g肝組織，加30 mLTris緩沖液冰浴500 r/min勻漿，加入2.5%胰蛋白酶2 mL 37 ℃水浴20 min，低溫離心固液分離。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為羥脯氨酸濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，樣品于60 ℃水浴20 min冷卻后在560 nm處測吸光度。

肝組織α-SMA、Smad3檢測采用免疫組化法(SP法)。取大鼠肝組織約1 cm×1 cm甲醛液固定，石蠟包埋切片，免疫組化染色。切片經(jīng)梯度酒精脫水，中性樹膠封固。采用HPIAS-2000型圖象分析軟件進行定量分析，每張切片選取10個視野測定其陽性細胞的灰度值與染色陽性面積。主要試劑：鼠抗人α-SMA購于深圳子科生物科技有限公司；羊抗大鼠Smad3購于上海樊克生物科技有限公司；免疫組化S-P試劑盒及其DAB顯色劑購于武漢博歐特生物科技有限公司；免疫PS試劑盒購于武漢博歐特生物科技有限公司。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 對大鼠肝組織Hyp表達的影響

見表1。與空白大鼠組比較，造模后大鼠肝組織Hyp含量表達明顯，差異有顯著性(P<0.01)。各組給藥后其Hyp的表達情況:中藥組Hyp含量明顯下降,與模型組比較P<0.05、與西藥組比較P>0.05無統(tǒng)計學(xué)意義；而西藥組與模型組比較P<0.05也有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 大鼠肝組織Hyp含量表達情況

3.2 對大鼠肝組織α-SMA、Smad3表達的影響

見表2、表3。表2為各組肝組織α-SMA、Smad3染色灰度值(表達產(chǎn)物)情況，灰度值越高，表達產(chǎn)物越少；灰度值越低，表達產(chǎn)物越多。

由表2可見，空白組灰度值與模型組比較有顯著性差異(P<0.01，P<0.01)；西藥組與模型組比較其α-SMA、Smad3灰度值也分別有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)；而中藥組在與模型組比較差異顯著(P<0.01，P<0.01)，即與西藥組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05，P<0.01)。

表2 各組肝組織α-SMA、Smad3灰度值比較

表3為各組肝組織α-SMA、Smad3染色陽性面積比較情況。由表3可見，空白組與模型組比較有顯著性差異；西藥組與模型組比較也分別有顯著性差異(P<0.01，P<0.01)；中藥組比模型組其α-SMA、Smad3染色面積差異顯著(P<0.01，P<0.01)，即與西藥組比較其Smad3染色面積也有顯著性差異(P<0.01)。

表3 各組肝組織α-SMA、Smad3染色陽性面積

4 討論

肝纖維化的共同病理特征是肝細胞外基質(zhì)尤其是膠原的過量沉積[8]。其發(fā)生發(fā)展過程，先是由于肝細胞損傷，進一步激活肝星狀細胞(HSE)，而后者又導(dǎo)致肝細胞外基質(zhì)(ECM)的不斷沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[9-10]。

α-SMA是肝組織中的一種特有標(biāo)志性蛋白，是肝星狀細胞(HSE)活化、增殖、過度分泌的顯著指標(biāo)，與肝纖維化程度存在正相關(guān)系[11]。而HSC的活化、細胞外基質(zhì)(ECM)的合成以及肝纖維化的形成發(fā)展尚必須有Smad3的參與[12]。在肝纖維化形成過程中。Smad3作為肝細胞內(nèi)主要信號傳導(dǎo)介質(zhì)，通過細胞漿至細胞核之間的信號傳遞來調(diào)控目的基因的表達，實現(xiàn)活化HSC、促進ESM合成等效應(yīng)[13]。羥脯氨酸(Hyp)是一種非必需氨基酸，是構(gòu)成組織內(nèi)膠原蛋白的主要成分之一，測定其在膠原組織中的含量是衡量膠原代謝的重要指標(biāo)[14]，肝纖維化時由于ECM內(nèi)膠原組織明顯增加導(dǎo)致Hyp含量的升高，因此直接檢測肝組織中的Hyp含量可反映出肝纖維化的程度[15]。

有研究工作提示，中醫(yī)中藥抗肝纖維化的作用機理可能通過以下途徑實現(xiàn)：(1)抑制肝星狀細胞(HSC)激活、促進其凋亡[16]；(2)阻斷由于ESC的自分泌引起的遞鏈反應(yīng)，從而阻止肝纖維化的進展[17]；(3)下調(diào) Smad3、α-SMA蛋 白表達 ，進而抑制肝星狀細胞活化，達到阻止肝纖維化進展的目的[18]。

扶正祛邪是中醫(yī)對肝纖維化的根本治療原則[19]，而肝腎陰虛、瘀血阻滯則是“指南”中中醫(yī)主要辨證分型之一[20]。肝為剛臟，體陰而用陽，我們在長期臨床工作中體會到，肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與肝腎陰虛有著密切關(guān)系，這和某研究工作相吻合[21]，即肝腎陰虛為本，瘀血濕毒是標(biāo)。養(yǎng)陰活血解毒方以當(dāng)歸、熟地黃、白芍、枸杞滋養(yǎng)肝腎；桃仁、紅花、川芎、丹參活血化瘀；柴胡、香附疏肝解郁導(dǎo)滯；茵陳、白花蛇舌草清解肝膽濕毒，臨床上可以取得很好的治療效果。

本研究工作結(jié)果顯示，中藥組對模型大鼠肝組織Hyp的表達有明顯抑制作用，與模型組比較P<0.05；西藥組與模型組比較也有顯著性差異(P<0.05)；中藥組與西藥組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。

對肝組織α-SMA、Smad3表達的影響，中藥組與模型組比較，均有顯著性差異(P<0.01)，即與西藥組比較，也分別具有顯著性差異(P<0.05)。

本研究結(jié)果顯示,養(yǎng)陰活血解毒方可明顯抑制實驗大鼠肝組織Hyp以及α-SMA、Smad3的表達，從而實現(xiàn)對肝纖維化的治療作用。