銻污染土壤微生物修復(fù)機制研究進展

許瑞， 南小龍， 蔣國清， 覃金寧， 何友宇， 熊作勝， 姜必廣， 王賓海， 李騫*

1. 中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410083；

2. 湖南省核工業(yè)地質(zhì)局三0六大隊，湖南 長沙 410083

引 言

銻(Sb)廣泛存在于土壤、水體和大氣中。Sb在環(huán)境中可以以四種價態(tài)(-III、0、III和V)存在，其中Sb(III)和Sb(V)是最普遍的。在好氧環(huán)境中，Sb(V)為優(yōu)勢種，主要以Sb(OH)6-的形式存在；在缺氧條件下以Sb(III)為主，主要以Sb(OH)3的形式存在[1]。此外，Sb也以有機化合物(甲基化物種)形式存在[2]。Sb是生物體內(nèi)一種非必需的有毒微量類金屬元素。長期暴露在高濃度的Sb污染環(huán)境中會產(chǎn)生一系列人類健康風(fēng)險，人體攝入過量Sb可能會導(dǎo)致嘔吐、腹瀉、皮疹、心臟和呼吸道等疾病[3,4]。因此，Sb及其化合物已被美國環(huán)境保護署(EPA)和歐盟委員會(CEC)列為重點污染物[5]。

環(huán)境中的Sb污染是由自然和人為活動造成的。自然來源包括火山活動和含Sb地殼巖石和礦物的風(fēng)化[6]；人為活動來源主要是采礦和冶煉[7]。此外，Sb也被廣泛用于制造阻燃劑、輕武器彈藥、半導(dǎo)體、二極管、電池、合金、顏料和催化劑等，從而加速了Sb到環(huán)境中的釋放[3]。全球每年Sb產(chǎn)量超過1.3×106t，主要生產(chǎn)國為中國、俄羅斯、塔吉克斯坦和玻利維亞等。

圖1顯示了近5年來世界各國Sb儲量。中國作為全球最大的Sb生產(chǎn)國，擁有世界上最豐富的Sb資源，包括114個Sb礦[8]，約占全球Sb總儲量的52%。我國Sb資源儲量最大的省份是湖南，該省冷水江市錫礦山是全球最大的Sb礦，Sb年產(chǎn)量占全國的三分之一，素有“世界銻都”之稱?？傮w來說，我國Sb污染土壤中主要集中在采礦和冶煉領(lǐng)域。例如，錫礦山已開采多年，大量的廢水、礦渣和堿渣被排放到附近環(huán)境中，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞[8]。因此，開發(fā)高效、環(huán)保的Sb污染土壤修復(fù)技術(shù)已成為近年來國內(nèi)外研究者研究的熱點。

圖1 世界各國Sb儲量(數(shù)據(jù)來源：美國地質(zhì)調(diào)查局，USGS)

目前，我國污染土壤修復(fù)技術(shù)體系主要由物理、化學(xué)和生物修復(fù)技術(shù)組成，主要包括化學(xué)法(土壤淋洗、固化/穩(wěn)定化、氧化/還原、離子拮抗等)[9-12]，物理法(電動修復(fù)、熱處理等)[13,14]和生物法(植物修復(fù)，微生物修復(fù)等)[15,16]。雖然物理化學(xué)法具有周期短、操作簡單、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)勢，但也存在成本高、二次污染、對土壤擾動大等不足，故而不能廣泛應(yīng)用。生物技術(shù)由于其低成本、可持續(xù)、環(huán)境友好等特點，在Sb污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用越來越受到重視，尤其是微生物介導(dǎo)法[17]。微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最具多樣性和優(yōu)勢的生物類群。據(jù)報道，微生物的代謝活動負(fù)責(zé)周期表中大約1/3元素的轉(zhuǎn)化[18]。盡管Sb具有毒性，但許多微生物仍能在Sb污染的環(huán)境中生存和繁衍。Luo等[19]利用宏基因組學(xué)和PCR技術(shù)對As和Sb污染土壤中微生物基因的表達進行了表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與As和Sb循環(huán)相關(guān)的功能基因(如arsC、arrA、aioA和arsB)的分布、多樣性和豐度與As和Sb濃度呈正相關(guān)。Majzlan等[20]在富含Sb的尾礦中發(fā)現(xiàn)Sphingomonas，Caulobacter，Janthinobacterium，Geobacter，Rhodoferax和Sulfuricurvum等多個菌屬具有較高的豐度。此外，有些細(xì)菌可以通過微生物氧化還原Sb獲得能量并支持其生長[21]。上述結(jié)果表明，微生物對Sb具有耐受性，其可能在Sb的生物地球化學(xué)循環(huán)中起著關(guān)鍵作用。雖然Sb和As在毒理學(xué)、物理和化學(xué)性質(zhì)上有一些相似之處，但對Sb生物轉(zhuǎn)化的研究仍然非常有限。另外，目前還不清楚Sb污染環(huán)境中地球化學(xué)因素對Sb行為的影響。因此，了解土壤理化性質(zhì)對Sb行為的影響以及微生物與Sb的相互作用機制，對于進一步開發(fā)Sb污染土壤的微生物修復(fù)策略具有重要意義。

近年來大多數(shù)綜述文章都集中在環(huán)境中Sb的毒理性和生物利用度等方面，關(guān)于微生物與Sb相互作用的分子機制的綜述較少。本綜述的主要內(nèi)容如下: (1) 概述了土壤理化性質(zhì)對Sb 遷移轉(zhuǎn)化行為的影響；(2) 介紹了Sb對土壤生物的毒性效應(yīng)；(3) 討論了微生物對Sb的抗性及解毒機理；(4) 分析了Sb污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)及機理。

1 土壤理化性質(zhì)對Sb遷移轉(zhuǎn)化行為的影響

土壤重金屬的行為(遷移、轉(zhuǎn)化、生物利用度和毒性等)與土壤理化性質(zhì)(如pH、氧化還原電位及其他無機或有機物等)密切相關(guān)[22]。因此，了解土壤理化性質(zhì)如何影響Sb的形態(tài)轉(zhuǎn)化、吸附和遷移對于準(zhǔn)確評估Sb污染土壤的風(fēng)險及生物修復(fù)Sb污染土壤具有重要指導(dǎo)意義。

在含氧或輕度還原土壤系統(tǒng)中，Sb(III)熱力學(xué)不穩(wěn)定，Sb主要以Sb(V)的形式存在[23]。這主要是由于Sb污染土壤系統(tǒng)中通常存在鐵錳(氫)氧化物發(fā)生氧化作用或溶解態(tài)硫化物緩慢的還原動力學(xué)及絡(luò)合作用[24]。在缺氧土壤系統(tǒng)中，Sb(III)占主導(dǎo)地位[25]。此時，微生物逐漸被迫選擇能量較低的末端電子受體進行呼吸反應(yīng)[2]。Mitsunobu等[26]考察了日本某尾礦土壤水中Sb的氧化形態(tài)。研究表明，Sb以Sb(V)的形式存在，其氧化電位范圍分布廣泛(Eh = 360 ～ 140 mV, pH 8)；Sb與土壤中含F(xiàn)e物質(zhì)豐度呈正相關(guān)，土壤中Sb的主相為Fe(III)氫氧化物。綜上，Sb(III)更容易在較低的Eh值下被氧化為Sb(V)，Sb(V)在好氧環(huán)境中比Sb(III)更穩(wěn)定。Steely等[27]研究了靶場土壤和被砷酸鉛農(nóng)藥污染的蘋果園土壤中Sb(III) 和Sb(V)與腐殖酸(HA)之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sb會與HA發(fā)生絡(luò)合作用，HA具有阻止Sb在土壤中遷移的能力，且有利于Sb(III)轉(zhuǎn)化為毒性較小的Sb(V)。Karimian等[28]指出在有機物質(zhì)存在的還原條件下，F(xiàn)e(II)的生成可能導(dǎo)致初始亞穩(wěn)態(tài)HA-Sb(V)-Fe(III)相迅速轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的相，從而降低了土壤中Sb的遷移率。此外，在土壤系統(tǒng)中，Sb(V)的遷移率在很大程度上受pH的影響[29]，即Sb(V)的遷移率在較高的pH值下增加。這主要是由于土壤中的Sb(OH)6-陰離子與黏土、鐵或鋁的含水氧化物和有機質(zhì)的表面負(fù)電荷基團之間存在靜電排斥現(xiàn)象。

金屬氧化物是土壤中一類重要的礦物，通常具有納米尺寸，對金屬污染物的反應(yīng)活性較高。針鐵礦廣泛存在于土壤和沉積物中，其對有毒金屬(膠體)在環(huán)境的轉(zhuǎn)化和遷移起著重要作用[30]。Fan等[30]考察了溶液pH、針鐵礦含量、HA等環(huán)境因素對光誘導(dǎo)亞銻酸鹽氧化的影響。結(jié)果表明，在光照條件下，亞銻酸鹽可被針鐵礦吸附和氧化，從而降低了環(huán)境風(fēng)險。Tighe和Lockwood[31]報道了在pH值為2.5～7時，95%的Sb (V)會被非晶形氫氧化鐵吸附，pH值在4左右時達到最大吸附量。同樣，赤鐵礦的表面結(jié)合位點對Sb (V)的吸附能力較強，在pH 4時吸附能力最強[32]。此外，有機物可能通過競爭吸附位點、靜電作用和形成絡(luò)合物影響金屬的遷移率[33]。據(jù)報道，土壤中存在的金屬(氫)氧化物對Sb具有很強的吸附能力，且吸附能力強弱依次為MnOOH >Al(OH)3>FeOOH。吸附過程中，pH對Sb吸附程度影響較大，在酸性條件下吸附效果較好。隨著pH值增加到6以上，吸附量逐漸減少[2]。當(dāng)pH值低于6時，超過80%的Sb (III)被上述三種物質(zhì)固定[34]。同時，陽離子和陰離子的存在可以通過影響金屬濃度和pH等促進或抑制Sb吸附[35,36]。利用光譜技術(shù)與DFT 計算相結(jié)合已發(fā)現(xiàn)一些吸附體內(nèi)部復(fù)合物的形成，如水合氧化鐵對Sb的吸附主要以單齒單核與雙齒雙核兩種構(gòu)型存在[37,38]；Sb(V)主要吸附于水鈉錳礦邊緣位點，形成單齒單核絡(luò)合構(gòu)型[39]；鋁氫氧化物吸附Sb的構(gòu)型為雙齒雙核[40]。這些吸附復(fù)合體在環(huán)境中非常穩(wěn)定，很難解吸[41]。此外，缺氧環(huán)境下，錳的氧化物可以氧化Sb (III)，反應(yīng)過程可以表示為[42]：

MnO2+Sb(OH)3+H2O→Mn(OH)2+H3SbO4

(1)

Bagherifam等[43]發(fā)現(xiàn)，天然的錳氧化物能夠降低農(nóng)業(yè)土壤中Sb的流動性和生物利用度。Xu等[44]發(fā)現(xiàn)氧化錳的主要作用是將Sb(III)氧化為Sb(V)，而氧化鐵的主要作用是吸附Sb(V)。Fu等[45]利用X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)(XAFS)研究了氧化錳(IV)在土壤中對Sb(III)的氧化作用，發(fā)現(xiàn)氧化錳(IV)在氧化Sb(III)過程中起著重要作用。Belzile等[42]發(fā)現(xiàn)無論是天然的還是合成的Fe氫氧化物，都可以在短時間內(nèi)有效地將全部Sb(III)轉(zhuǎn)化為Sb(V)。然而，在氧化過程中，微生物并沒有發(fā)揮重要的催化作用，而是在Fe氫氧化物表面進行了電子的非生物轉(zhuǎn)移。總體反應(yīng)可以表示為：

2Fe(OH)3+Sb(OH)3→2Fe(OH)2+H3SbO4+H2O

(2)

如圖2所示, 可能的反應(yīng)機制可概括為：(1) Fe(III)氫氧化物吸附亞銻酸鹽并在其表面形成一個復(fù)合體(一個Sb(III)占據(jù)兩個Fe(III)位點)；(2) Sb的兩個電子轉(zhuǎn)移到Fe原子上；(3)氧化Sb(V)和還原Fe(II)的釋放。因此，土壤中天然存在的鐵錳等(氫)氧化物對Sb的吸附和氧化是一種天然的解毒過程。

圖2 Sb(III)吸附，電子轉(zhuǎn)移及Sb(V)和Fe(II)吸附反應(yīng)示意圖[41]

綜上所述，土壤氧化還原電位會影響Sb在土壤中的存在價態(tài)，進而影響Sb的毒性和溶解度；土壤有機質(zhì)(腐殖質(zhì))和金屬(氫)氧化物可以氧化或固定Sb, 從而在一定程度上降低了Sb的活性和遷移能力；土壤pH 值可以促進金屬(氫)氧化物對Sb的吸附固定。因此，研究不同地區(qū)、不同土壤類型中Sb及其化合物與土壤中礦物和有機物之間的平衡關(guān)系以及不同土壤條件(pH、氧化還原電位等)下Sb的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，可以為有效地選擇和使用Sb污染土壤修復(fù)的方法提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

2 Sb對土壤微生物的毒性效應(yīng)

Sb進入土壤生態(tài)系統(tǒng)后，會通過Sb自身的毒性作用或與土壤多介質(zhì)組分的交互作用，對土壤生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成污染脅迫。微生物過程在維持土壤功能和健康方面起著關(guān)鍵作用，但微生物過程對環(huán)境因子的變化極其敏感[46]。Sb的遷移率和毒性很大程度上取決于其氧化形態(tài)[22]。因此，微生物轉(zhuǎn)化Sb可以影響Sb在土壤環(huán)境中的毒性；同樣，Sb又會對微生物產(chǎn)生生態(tài)效應(yīng)(如生物量、基本呼吸速率、酶活性、群落結(jié)構(gòu)和生化過程等)，而負(fù)面生態(tài)效應(yīng)會導(dǎo)致土壤微生物多樣性失衡，從而影響土壤功能[47,48]。許多研究已經(jīng)證明, 土壤酶活性可以作為重金屬污染物不利影響的敏感指標(biāo)[49,50]。例如，Sb會影響土壤氮循環(huán)，主要表現(xiàn)為脲酶和脫氫酶活性的下降[51]。研究表明，Sb(III)會影響A.tumefaciensGW4 的Ars抗性、Sb(III)氧化酶AnoA、磷酸鹽代謝、碳水化合物運輸和代謝以及脂類、嘌呤和氨基酸的代謝[3]。此外，Sb(III)對巰基有很強的親和力，可以在生物反應(yīng)中代替磷，說明Sb會抑制DNA復(fù)制和微生物代謝過程[52]，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)菌DNA突變[53]。Sb及其化合物還會破壞細(xì)胞內(nèi)離子平衡，引起細(xì)胞缺氧[54]。Obiakor等[55]發(fā)現(xiàn)，在短期暴露(2 ～ 6 h)條件下，Sb(III)對A.brasilenseSp7的毒性是Sb(V)的10倍左右。這可能與兩種價態(tài)的Sb在細(xì)胞中的滲透能力和停留時間有關(guān)，Sb(III)作為中間價態(tài)物質(zhì)很容易通過自由擴散被水甘油通道轉(zhuǎn)運而滲透細(xì)胞膜[56]。盡管目前尚不清楚細(xì)胞對Sb(V)的轉(zhuǎn)運機制[57]，但Sb(III)的易滲透性可以解釋其比Sb(V)毒性相對更高的原因。An和Kim[51]報道了在含Sb(III)的肉湯培養(yǎng)基中，Escherichiacoli，Bacillussubtilis和Streptococcusaureus的生長活性均受到了抑制。Murata等[58]也證明了在日本茨城縣土壤中的Sb(III) 會降低微生物的存活率。此外，不同價態(tài)的Sb對細(xì)菌和真菌種群的影響不同，但不論Sb(III)和Sb(V)，其對土壤微生物種群抑制率的大小順序為：細(xì)菌>真菌>放線菌[59]。Diquattro等[60]評估了銻酸鹽對不同土壤中微生物群落和土壤生化功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿性土壤中，Sb(OH)6-在短期內(nèi)嚴(yán)重抑制了土壤微生物豐度、多樣性和功能，最終影響了土壤肥力。當(dāng)Sb濃度過高時，Sb氧化細(xì)菌細(xì)胞中H2O2大量積累，H2O2可以通過多不飽和脂肪酸的過氧化作用對細(xì)胞膜的脂質(zhì)層造成氧化損傷，并破壞細(xì)菌的代謝功能，從而抑制細(xì)菌的生長[61]。

目前，有關(guān)Sb不同價態(tài)對土壤微生物的生態(tài)毒理效應(yīng)的研究還相對較少。鑒于土壤微生物在維持生態(tài)系統(tǒng)整體服務(wù)功能方面發(fā)揮著重要作用，仍需進一步研究Sb對土壤微生物生長和代謝的毒性機理。

3 微生物對Sb的抗性機制

了解微生物對Sb的抗性機制是Sb污染土壤生物修復(fù)的關(guān)鍵。微生物會利用不同的途徑來避免或減少細(xì)胞內(nèi)Sb的毒性積累，其可以通過改變膜的組成或抑制攝取來增加耐受性。如首先抑制Sb進入細(xì)胞，若Sb進入細(xì)胞，則促使Sb主動從細(xì)胞中擠出，或在細(xì)胞內(nèi)以無毒的形式將其隔離[62]。生物外排是微生物為保護自身免受Sb的毒害而采取的最重要的措施之一。目前還沒有發(fā)現(xiàn)微生物吸收Sb的專門通道，或許還沒有進化出這樣的通道，因為Sb不是微生物生長必需的微量元素[63]。基于As和Sb之間相似的化學(xué)性質(zhì)，通常認(rèn)為它們具有相同的抗性機制。編碼As(III)/Sb(III)泵蛋白的arsB基因(arsRDABC操縱子的成員)已被證明同時具有As(III)和Sb(III)抗性[64,65]。arsB編碼一個12α螺旋跨膜蛋白，該蛋白常與調(diào)節(jié)蛋白ArsR、As(V)還原酶ArsC、ATP酶ArsA和轉(zhuǎn)錄抑制蛋白ArsD結(jié)合，將As(III)和Sb(III)擠出細(xì)胞[66,67]。Butcher等[68]將T.ferrooxidans耐砷基因arsB和arsC克隆到缺失突變體ars的菌株Escherichiacoli后，發(fā)現(xiàn)其對Sb的抗性增強。盡管ars基因源于專性嗜酸細(xì)菌，但其在大腸桿菌中同樣具有抗性功能。Li等[66]從Sb礦區(qū)中分離除了6株Sb(III)氧化菌，包括Acinetobactersp. JL7,Comamonassp. JL25,Comamonassp. JL40,Comamonassp. S44,Stenotrophomonassp. JL9和Variovoraxsp. JL23。與其他Sb(III)氧化菌相比，Comamonassp. S44對As(III)的抗性較高，對Sb(III)的抗性較低，分析該菌株的基因組發(fā)現(xiàn)了4個編碼As(V)還原酶蛋白的arsC基因，這可能與高As(III)抗性有關(guān)。說明Comamonassp. S44對As和Sb的抗性機制可能存在較大差異。據(jù)報道，Acr3p及其同源物YqcL可以替代ArsB作為Sb(III)的流出泵，且Acr3p主要存在于Actinobacteria和Alphaproteobacteria中[69]，但在古生菌和真核生物中也發(fā)現(xiàn)了Acr3p，其中基因簇acr1、acr2和acr3負(fù)責(zé)Sb(III)的抗性[70]。Kang等[71]研究發(fā)現(xiàn)，Agrobacteriumtumefaciens5A中acr3的缺失導(dǎo)致了對Sb(III)的敏感性增加。Ghosh等[72]發(fā)現(xiàn)Sb(III)刺激了Saccharomycescerevisiae中acr3的表達，其基因產(chǎn)物具有Sb(III)的耐受性。

此外，Meng等[56]發(fā)現(xiàn)As(III)和Sb(III)可以通過水-甘油的跨膜輸送蛋白通道GlpF進入大腸桿菌細(xì)胞，并通過ArsB載體蛋白催化Sb(III)的外排。另外，在Saccharomycescerevisiae中，GlpF的同源物Fps1p也介導(dǎo)了Saccharomycescerevisiae對Sb(III)的吸收。fps1的缺失提高了Saccharomycescerevisiae對Sb(III)的耐受性，而該基因的組成性表達導(dǎo)致了超敏反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞暴露于Sb(III)環(huán)境時，fps1的表達被抑制，這表明一個協(xié)調(diào)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以保護細(xì)胞免受Sb(III)的毒性影響[62]。ABC超家族轉(zhuǎn)運蛋白Ycf1也可以通過液泡隔離而獲得Sb(III)耐受性的性能[73]。Kassa等[61]發(fā)現(xiàn)高濃度Sb會誘導(dǎo)Serratiamarcescens抗氧化生物標(biāo)志物如脯氨酸(PRO)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)水平顯著升高，使細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力。在Leishmania中，Sb(III)主要通過水-甘油通道蛋白AQP1進入細(xì)胞[74]。一般來說，AQP1的轉(zhuǎn)錄水平與Leishmania細(xì)胞中Sb(III)的積累和敏感性水平相關(guān)[75]。其中，ABC轉(zhuǎn)運蛋白PGPR和ABCI4參與了Sb(III)-巰基外排，從而降低了細(xì)胞內(nèi)Sb(III) 的積累[72]。據(jù)報道，Sb(V)流入細(xì)胞的途徑不同于Sb(III)[76]。然而，微生物對Sb(V)的攝取機制仍不清楚。

4 微生物修復(fù)Sb污染土壤

近年來，微生物修復(fù)Sb污染土壤技術(shù)不斷發(fā)展。整體而言，微生物修復(fù)機制與Sb形態(tài)、土壤理化性質(zhì)和微生物種類及特性密切相關(guān)。其修復(fù)機理主要包括氧化、還原、吸附和甲基化等，各機理往往共同作用、相互影響。因此，對各機理及其相互作用進行定性與定量解析仍然是目前研究的難點和熱點。此外，由于微生物修復(fù)的復(fù)雜性，需要與多學(xué)科技術(shù)如代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏基因組學(xué)、基因工程等結(jié)合使用，以明確其修復(fù)機制，進而達到穩(wěn)定修復(fù)效果。

4.1 生物氧化

Sb在土壤中主要以Sb(III)和Sb(V)兩種化學(xué)形態(tài)存在，雖然這兩種價態(tài)的Sb都是有毒的，但Sb(III)化合物的毒性是Sb(V)化合物的10倍[77]。因此，將毒性較大的Sb(III)氧化為毒性較小的Sb(V)，對Sb污染土壤修復(fù)具有重要意義。除了化學(xué)氧化劑(H2O2、碘酸鹽、鐵錳(氫)氧化物)外，微生物在Sb(III)氧化過程中也起著重要作用[3,78]。

微生物對Sb(III)的氧化可以促進Sb污染物的沉淀和原位固定，是一種很有潛力的污染土壤修復(fù)方法[77]。到目前為止，對介導(dǎo)Sb(III)氧化的細(xì)菌種類和分子機制的報道還較少。近年來，已鑒定出60多種好氧Sb(III)氧化菌，其中假單胞菌屬、單胞菌屬、農(nóng)桿菌屬和不動桿菌屬占主導(dǎo)地位[3,79]。Li等[80]發(fā)現(xiàn)了一種存在于Sb(III)氧化菌AgrobacteriumtumefaciensGW4中的氧化還原酶(AnoA)。敲除anoA基因會降低細(xì)菌對Sb(III)的抗性，使其對Sb(III)氧化能力降低約27%，而anoA基因過表達的菌株可使Sb(III)氧化能力提高約34%。此外，Li等[81]報道了aioAB是導(dǎo)致細(xì)胞周質(zhì)中Sb(III)氧化的原因。若無aioAB，更多的Sb(III)進入細(xì)胞后，Sb(III)氧化酶AnoA和參與細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的蛋白顯著增加，從而提高了Sb(III)的氧化效率。然而，當(dāng)這兩個基因被破壞時，Sb(III)氧化過程并沒有完全停止，這表明細(xì)菌氧化Sb(III)還有其他機制的存在[82]。Nguyen等[77]從Sb(III)污染土壤中分離出2株Sb(III)氧化菌(Shinellasp. NLS1和Ensifersp. NLS4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種菌株均能在營養(yǎng)受限的條件下氧化Sb(III)。其中，Shinellasp. NLS1具有aioA基因，可以充當(dāng)亞銻酸鹽氧化酶的功能，Ensifersp. NLS4不具有aioA基因，但其能夠在厭氧條件下以硝酸鹽為電子受體對Sb(III) 進行氧化，說明Sb(III)生物氧化會通過不同的途徑發(fā)生。Li等[66]報道了6種Sb(III)氧化細(xì)菌均未表現(xiàn)出As(III)氧化能力，雖然As和Sb具有相似的理化性質(zhì)。此外，Comamonassp. S44菌株的全基因組中未發(fā)現(xiàn)推測的As(III)氧化酶基因aioBA。這與Lehr等[83]報道的A.tumefaciens5A的情況不同，該菌株同時具有As(III)和Sb(III)氧化能力。這說明細(xì)菌氧化Sb(III)和As(III)存在不同的基因偶聯(lián)。此外，Sb(III)會誘導(dǎo)細(xì)菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，會產(chǎn)生大量的H2O2，H2O2可以作為氧化劑將Sb(III)氧化為Sb(V)[84]。一般來說，生物有氧呼吸不可避免地伴隨著活性氧(ROS)的產(chǎn)生。Wang等[82]提出了一種新的非酶介導(dǎo)的氧化機制，即通過破壞PseudomonasstutzeriTS44的ROS-通路保護，使H2O2積累并促進Sb(III)氧化為Sb(V)。除過氧化氫酶外，谷胱甘肽(GSH)也被認(rèn)為是細(xì)菌氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分[85]。Liu等[85]發(fā)現(xiàn)ComamonastestosteroniS44對多種重金屬具有抗性，并且能夠?qū)⒂卸镜膩嗕R酸鹽(Sb(III))氧化成毒性較小的銻酸鹽(Sb(V))。這可能是Fe-S組裝轉(zhuǎn)錄因子IscR通過調(diào)節(jié)IscS介導(dǎo)的半胱氨酸脫硫作用，促進了GSH的形成。另外，Sb(III)誘導(dǎo)iscR表達，iscR的缺失降低了細(xì)胞GSH含量。這些結(jié)果表明氧化細(xì)菌Sb(III)受到IscR的調(diào)控。IscR調(diào)控Sb(III)氧化的假設(shè)模型可概括為:(1) Sb(III)可誘導(dǎo)細(xì)菌氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生H2O2；(2) 在堿性條件下H2O2將Sb(III)氧化為Sb(V)；(3) IscR參與調(diào)控GSH的形成。然后，H2O2被過氧化氫酶KatA和GSH消耗，這也可能影響細(xì)菌氧化Sb(III)[3]。

然而，對厭氧菌氧化Sb(III)的認(rèn)識還很有限。目前僅分離出幾株厭氧或兼性厭氧Sb(III)氧化細(xì)菌[77,78,86]，這些菌株利用硝酸鹽作為電子受體氧化Sb(III)，而氧化機制仍不清楚。Li等[78]發(fā)現(xiàn)在以硝酸鹽為電子受體的缺氧條件下，Sinorhizobiumsp. GW3在培養(yǎng)過程中能夠同時氧化Fe(II)和Sb(III)；然而，在Fe(II)和硝酸鹽同時存在的情況下，Sb(III)氧化速率明顯提高。除Sb(III)氧化菌外，其他氧化性微生物也能間接促進Sb(III)在自然環(huán)境中的氧化。Bai等[87]報道了Mn氧化細(xì)菌Pseudomonassp. QJX-1能夠氧化Mn(II)形成生物源Mn氧化物(BMO)，BMO可以將Sb(III)氧化為Sb(V)，但只有Sb(III)氧化生成的Sb(V)離子能被進一步吸附到BMO表面。

綜上所述，不論在有氧和缺氧環(huán)境， Sb(III)都可以被土壤中的微生物和鐵錳(氫)氧化物等輕易氧化，這也解釋了土壤中Sb(III)濃度較低的原因。因此，未來對Sb(III)生物地球化學(xué)氧化的研究可以集中在更為復(fù)雜的自然環(huán)境中。

4.2 生物還原

微生物對Sb(V)還原是Sb在生物地球化學(xué)循環(huán)中不可缺少的過程。這些微生物過程影響了Sb的環(huán)境形態(tài)和遷移能力。迄今為止，大多數(shù)生物修復(fù)Sb污染土壤的研究主要集中于Sb(III)氧化[25,66,88], 對生物還原法修復(fù)Sb污染土壤的研究相對較少。根據(jù)熱力學(xué)平衡計算，Sb(V)在水溶液中以Sb(OH)6-(銻酸鹽)的形式存在，且在含氧土壤系統(tǒng)中相對穩(wěn)定，而在還原條件下主要以Sb(OH)3(亞銻酸鹽)的形式存在[89]。土壤中Sb(V)還原為Sb(III)的過程已被證明可以與Fe(II)的氧化進行非生物耦合[90,91]，但該過程也被證明是由微生物催化進行的[92,93]。土壤環(huán)境中普遍存在Sb氧化還原物被鐵錳(氫)氧化物吸附的現(xiàn)象[2,94]，在淹水條件下會通過還原作用溶解釋放Sb。在還原條件下，Sb(V)會被轉(zhuǎn)化為Sb(III)，而后者更容易與鐵(氫)氧化物結(jié)合而被固定[7]。因此，生物還原Sb(V)是一種很有前途的生物修復(fù)策略。Hockmann等[95]研究表明，在厭氧石灰性土壤中，本地微生物可以迅速將Sb(V)還原為Sb(III)，生成的Sb(III)隨后與鐵(氫)氧化物表面結(jié)合，使Sb固定。Lai等[96]證明了Rhizobium可以利用H2作為唯一電子供體將Sb(V)還原生成Sb(III)沉淀(Sb2O3)。Wang等[97]首次論證了硫酸鹽還原菌(SRB)可以將Sb(V)還原為Sb(III)，將硫酸鹽離子轉(zhuǎn)化為硫化物并與Sb(III)形成絡(luò)合物作為沉淀的可行性。Kulp等[93]報道了在缺氧沉積物中Sb(V)的厭氧細(xì)菌還原作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用乙酸或乳酸作為電子供體可以將Sb(V)還原成Sb(III)并與硫化物絡(luò)合析出沉淀。Nguyen等[98]從氧化銻生產(chǎn)工廠附近采集的沉積物樣本中分離出一株Sb還原細(xì)菌JUK-1，其在生長過程中會生成Sb(OH)3的沉淀。Abin和Hollibaugh[99]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)在DesulfuribacillusstibiiarsenatisMLFW-2T中發(fā)現(xiàn)了第一個呼吸型Sb(V)還原酶。該酶屬于二甲亞砜還原酶(DMSOR)家族，它包含多種能夠還原硝酸鹽、砷酸鹽、硒酸鹽、高氯酸鹽以及氧化甲酸鹽、亞砷酸鹽和亞硝酸鹽的蛋白[100]。Shi等[101]采用宏基因組學(xué)和元轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法來揭示生物反應(yīng)器中的DMSOR家族基因是否具有將Sb(V)還原的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，一些DMSOR家族基因(sbrA還原酶基因)高度轉(zhuǎn)錄，含有sbrA的假定操縱子包括編碼c型細(xì)胞色素的基因、響應(yīng)調(diào)節(jié)因子和鐵氧化還原蛋白，它們共同實現(xiàn)Sb(V)還原。然而，目前關(guān)于細(xì)菌還原Sb(V)的分子機制尚不清楚，參與這一反應(yīng)的酶也尚未確定。

此外，土壤環(huán)境中Sb的遷移率通常會受到與鐵礦物吸附或共沉淀作用的影響[1,102,103]。鐵氧化物的形成和礦物相轉(zhuǎn)化對Sb的遷移性起著重要作用[104,105]。研究表明，除Sb(V)還原菌外，微生物對Fe(III)的還原也會對Sb的遷移率產(chǎn)生很大的影響[7,106]。Li等[78]證實了由微生物(Sinorhizobiumsp. GW3)介導(dǎo)產(chǎn)生的含F(xiàn)e(III)的沉淀物可以有效地氧化和固定Sb(III)。Burton等[107]發(fā)現(xiàn)異化的Fe(III)還原菌Shewanellaputrefaciens(CN-32)介導(dǎo)的Fe(III)還原有助于在還原環(huán)境中固定Sb(V)。Arsic等[25]也發(fā)現(xiàn)了微生物介導(dǎo)的Fe(III)還原似乎與污染沉積物中Sb流動性的降低有關(guān)。

在之前的研究中，微生物Fe(III)還原對Sb遷移率的影響很少被單獨考慮(即在微生物還原的Fe(III)是唯一終端電子的條件下)。這些影響主要是從微生物介導(dǎo)的復(fù)雜環(huán)境中(例如在天然土壤和沉積物中)的研究中推斷出來的。在自然環(huán)境中，微生物對Fe(III)、Mn(IV)和Sb(V)還原通常同時發(fā)生，這可能會使得Sb與鐵礦物組合發(fā)生變化，從而導(dǎo)致Sb的滯留[107]。因此，研究Fe(III)、Mn(IV)微生物還原與Sb(III)的反應(yīng)過程，并進一步研究其在特定條件下(好氧、缺氧、其他還原性金屬離子存在)的反應(yīng)機理，有助于闡明Sb在土壤環(huán)境中的行為。這也可能是一種修復(fù)土壤中Sb污染的有效方法。

4.3 生物吸附

在微生物與Sb的相互作用過程中，生物吸附是第一步[108]。研究表明，環(huán)境微生物(如細(xì)菌、真菌、藻類)可以吸附和固定多種重金屬[109,110]。Sb的生物吸附機制主要是由于細(xì)胞壁上存在的羧基、羥基和氨基官能團通過靜電吸引、離子交換和絡(luò)合等方式吸附和固定Sb[17,111]。Gu等[112]從尾礦中分離到一種新型細(xì)菌(Acinetobactersp. JH7)，發(fā)現(xiàn)Acinetobactersp. JH7可以吸附Sb(III)。紅外光譜分析表明，-OH, C-N和C-O等官能團可能參與了Sb(III)的生物吸附。Zhang等[113]發(fā)現(xiàn)Synechocystissp.可以通過細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)和多糖吸附Sb(III)，吸附量可達4.68 mg·g-1(干重)。Zhang等[114]使用激發(fā)-發(fā)射矩陣(EEM)熒光光譜法研究了Synechocystissp.胞外聚合物物質(zhì)(EPS)與Sb(III)的絡(luò)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPS與Sb(III)之間的相互作用是自發(fā)的、吸熱的。Sb(III)與EPS的結(jié)合主要受氫鍵和范德華力的影響。紅外光譜分析表明，EPS中的多糖參與了Sb(III)與EPS的絡(luò)合。Cai等[115]研究了Bacillussubtilis對Sb(III)的吸附特性。結(jié)果表明，Bacillussubtilis在水溶液中對Sb(III)離子的生物吸附是可行的、吸熱的、自發(fā)的，其可作為一種廉價的原生細(xì)菌材料，在低溫條件下協(xié)助植物吸收弱酸性或中性pH污染土壤中的Sb。Sun[111]和Wu等[116]研究了cyanobacteriaMicrocystis對Sb(III)和Sb(V)的生物吸附過程。結(jié)果表明，cyanobacteriaMicrocystis對Sb(III)和Sb(V)有較大的吸附潛力。其中，當(dāng)pH為 4時，cyanobacteriaMicrocystis對Sb(III)的最大生物吸附量為4.88 mg·g-1(干重)；當(dāng)pH為2.8時，cyanobacteriaMicrocystis對Sb(V)的最大生物吸附量為7 340.2 mg·kg-1(干重)。Sb(III)的生物吸附符合Freundlich和Langmuir等溫線模型，Sb(V) 的生物吸附符合Freundlich等溫線模型。此外，綠色海藻(Cladophorasericea和Ulvarigida)和棕色海藻(Sargassummuticum和Ascophyllumnodosum)對Sb(III)和Sb(V)也有生物吸附能力[117,118]。

目前，雖然做了大量工作來探索微生物對Sb的吸附行為，但針對土壤細(xì)菌的研究相對較少。事實上，大多數(shù)微生物會附著在土壤細(xì)粒礦物上，從而形成微生物-礦物復(fù)合材料[119]，其是土壤重金屬的重要吸附劑[120]，并表現(xiàn)出不同于純礦物或微生物對金屬離子的吸附特性[121,122]。Lei等[108]研究了厭氧條件下耐銻土壤細(xì)菌Bacilluscereus和針鐵礦組成二元復(fù)合材料對Sb(III)的吸附行為。結(jié)果表明，針鐵礦、Bacilluscereus和細(xì)菌-針鐵礦復(fù)合材料對Sb(III)的吸附與pH無關(guān)。通過XPS光譜分析發(fā)現(xiàn)，該吸附行為主要與針鐵礦的鐵羥基官能團和細(xì)菌的羧基和氨基/酰胺基團有關(guān)。

4.4 生物甲基化

已有大量文獻證實了金屬有機化合物對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康產(chǎn)生不利影響的可能性[123]。然而，目前關(guān)于Sb甲基化化合物的生態(tài)毒理學(xué)研究還很少，但現(xiàn)有的文獻均表明甲基化Sb化合物的毒性很低[124]。Burrell等[125]測定了二苯基-、三苯基-、三甲基銻化合物的真菌毒性，發(fā)現(xiàn)只有二苯基銻化合物的EC50值低于30 mg·L-1。另外，銻化氫和三甲基銻((CH3)3Sb)被認(rèn)為具有基因毒性[126]。然而，引起DNA損傷所需的最低溶液濃度為200 μmol·L-1。但該濃度比在發(fā)酵氣體中發(fā)現(xiàn)的典型痕量三甲基銻濃度要高出許多數(shù)量級[124]。此外，三甲基二氯化銻((CH3)3SbCl2)細(xì)胞膜通透性較差，在正常暴露條件下不會引起細(xì)胞和基因毒性效應(yīng)[127]。綜上，Sb生物甲基化可以將Sb(III)轉(zhuǎn)化為毒性較小的物質(zhì)[一甲基銻(MMS)、二甲基銻(DMS)和三甲基銻(TMS)][128]。然而，一些研究者認(rèn)為Sb的生物甲基化是一個偶然的過程[129]，而不是一種解毒機制。

目前，多種微生物已被證明具有銻甲基化的能力[130,131]，主要包括：好氧絲狀真菌(Scopulariopsisbrevicaulis、Phaeolusschweinitzii)，嚴(yán)格厭氧原核生物(厭氧細(xì)菌：Clostridiumcollagenovorans、Desulfovibriovulgaris；產(chǎn)甲烷古菌：Methanobacteriumformicicum、Methanobacteriumthermoautrophicum、Methanosar-cinabarkeri)以及嚴(yán)格好氧細(xì)菌(Flavobacteriumsp.)和好氧酵母菌(Cryptococcushumicolus)，厭氧條件下生長的混合培養(yǎng)菌也顯示出了Sb甲基化活性。因此，好氧和厭氧微生物似乎都能使Sb甲基化。最初的研究主要集中在Scopulariopsisbrevicaulis上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只形成了一種揮發(fā)性物質(zhì)，即(CH3)3Sb。其中，s-腺苷蛋氨酸的前體甲硫氨酸被認(rèn)為是Scopulariopsisbrevicaulis甲基化的甲基供體[132]。在厭氧條件下生長的混合培養(yǎng)菌和好氧菌Pseudomonasfluorescens對 (CH3)3SbBr2的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)了(CH3)3Sb[131]。此外，好氧真菌Scopulariopsisbrevicaulis和Phaeolusschweinitzii在生長過程中可以將無機Sb生物甲基化形成SbH3、(CH3)2SbH、(CH3)3Sb和一些非揮發(fā)性甲基銻[133-135]，且甲基化的過程是從MMS到DMS，再到TMS[136]，此反應(yīng)過程如圖3所示。在缺氧條件下，Cryptococcushumicolus也可以與無機Sb生物甲基化形成SbH3、(CH3)2SbH、(CH3)3Sb，且Sb甲基化程度與Sb的初始底物濃度呈正相關(guān)[137]。據(jù)報道，Sb(III)比Sb(V)更易于生物甲基化。研究發(fā)現(xiàn)，Scopulariopsisbrevicaulis不能使Sb(V)甲基化[138]，或者Sb(V)甲基化效率低于Sb(III)[134]。Andrewes等[133]也發(fā)現(xiàn)了Phaeolusschweintzii對Sb(V)生物甲基化效率較低的現(xiàn)象。也有研究表明Sb(V)可以被Cryptococcushumicolus[139]和土壤及污泥細(xì)菌[131,136]生物甲基化。Duester等[140]發(fā)現(xiàn)土壤中甲基化銻的比例高于As，這與其他關(guān)于微生物培養(yǎng)過程中Sb與As生物甲基化的研究情況相反。鑒于Sb甲基化化合物在Sb的生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要性，未來仍需要從不同的生態(tài)系統(tǒng)中進行研究以更好地理解Sb生物甲基化對Sb污染環(huán)境修復(fù)的意義。

圖3 不同Sb物種的甲基化途徑[3]

5 展望

土壤Sb污染是一個全球性問題。微生物修復(fù)是目前最具發(fā)展和應(yīng)用前景的技術(shù)，但其規(guī)?；瘧?yīng)用性研究相對較少。這主要是由于微生物修復(fù)Sb污染土壤的反應(yīng)過程和機理并未完全明確，以及對應(yīng)的技術(shù)需求與管理支撐尚缺乏針對性研究。此外，由于土壤環(huán)境條件的復(fù)雜性，微生物修復(fù)Sb污染土壤需要綜合考慮Sb的生物地球化學(xué)循環(huán)、遷移率、生物利用度，以及生物修復(fù)后的相關(guān)風(fēng)險等因素。由于Sb與As具有相似的化學(xué)特性，土壤Sb污染修復(fù)可以借鑒As修復(fù)的生化途徑。然而，Sb的生物修復(fù)也會通過一些獨特的生化機制進行。為了加速Sb污染土壤的生物修復(fù)進程，在今后的研究中，應(yīng)進一步考慮以下幾個方面：

(1) 有必要探索更多的具有較高Sb(III)氧化能力的Sb 抗性菌株。另外，除了生物驅(qū)動的Sb(III)氧化外，一些非生物因素如土壤環(huán)境中的有機物、鐵錳礦物、過氧化氫和碘酸鹽等也已被證實可將Sb(III)氧化為Sb(V)。在實際環(huán)境條件下，Sb(III)氧化反應(yīng)可能是由化學(xué)和微生物協(xié)同作用引起的。因此，應(yīng)綜合考慮這兩個因素的影響。

(2) 土壤環(huán)境中Sb氧化還原物可以被鐵錳(氫)氧化物吸附，且Sb(V)被還原為Sb(III)時更容易與鐵錳(氫)氧化物結(jié)合而被固定。然而，微生物介導(dǎo)的Sb和鐵錳礦物的轉(zhuǎn)化對Sb遷移率的影響關(guān)注較少。這是理解Sb生物地球化學(xué)和Fe循環(huán)之間相互作用方面的一個關(guān)鍵缺口。這也可能是一種修復(fù)Sb污染土壤的有效方法。

(3) 目前，雖然對Sb(III) 生物甲基化已進行了研究，但Sb(III)甲基化的機制尚不清楚。此外，Sb(III)生物甲基化所產(chǎn)生的揮發(fā)性甲基和氫化物衍生物可能對環(huán)境造成危害。因此，關(guān)于Sb(III)甲基化的機制和甲基化Sb與天然膠態(tài)配體(如天然有機質(zhì)、黏土、鐵錳(氫)氧化物等)的結(jié)合仍需進一步進行研究。

(4) 考慮到Sb污染環(huán)境條件的極端復(fù)雜性，有必要對Sb污染土壤生物修復(fù)后的可持續(xù)性進行研究。因此，可以利用其他學(xué)科發(fā)展技術(shù)和微生物法聯(lián)合修復(fù)技術(shù)將Sb從土壤中提取出來，可減少生態(tài)系統(tǒng)和人類健康風(fēng)險。