不同處理梯度污水對(duì)細(xì)菌群落和酶活性的影響

吳曉斐，何源，黃治平，張丹丹，鄭宏艷，丁健

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津300191）

據(jù)《2018年中國(guó)水資源公報(bào)》[1]顯示，2018年我國(guó)年用水總量為6 015.5億m3，其中農(nóng)業(yè)年用水總量占61.4%，隨著淡水資源的短缺以及人們環(huán)保意識(shí)的提高，大家開(kāi)始尋找其他途徑以減少農(nóng)業(yè)淡水用量。因生活污水中含有大量的氮磷等植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素而使得污水灌溉進(jìn)入大眾視野，特別是農(nóng)村廁所革命后，經(jīng)三格化糞池、三聯(lián)式沼氣池和雙甕漏斗式等處理系統(tǒng)產(chǎn)生的生活污水，其含重金屬等有害物質(zhì)極少[2]，利用此類污水進(jìn)行灌溉不僅可以緩解用水壓力，還可減少農(nóng)業(yè)中化肥的使用量，降低經(jīng)濟(jì)成本及其對(duì)環(huán)境的污染。在生態(tài)系統(tǒng)中，土壤微生物在物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中占有重要地位，微生物的生物活性以及種群組成能夠反映土壤肥力及土壤質(zhì)量，當(dāng)微生物多樣性指數(shù)提高時(shí)，土壤綜合肥力指數(shù)隨之呈現(xiàn)不同形式的上升趨勢(shì)[3-4]，且土壤微生物還可以預(yù)警生態(tài)系統(tǒng)的變化[5]。土壤酶參與了土壤中的腐殖質(zhì)合成分解、有機(jī)物的水解和轉(zhuǎn)化以及各種氧化還原反應(yīng)等，土壤理化性質(zhì)的變化以及水肥管理措施、耕作措施、種植條件等，都會(huì)對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生影響，研究表明土壤脲酶、蔗糖酶和磷酸酶與土壤養(yǎng)分具有顯著正相關(guān)關(guān)系[6-7]，因而土壤酶活性是土壤肥力的指示指標(biāo)之一[8-9]。正是因?yàn)橥寥牢⑸锖兔富钚詫?duì)土壤肥力的指示作用，所以肥料的施用會(huì)對(duì)微生物豐富度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)和土壤酶活性產(chǎn)生影響[10-11]。研究認(rèn)為肥料的合理施用對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤酶活性具有積極的影響，Guo等[12]利用小麥-大豆輪作系統(tǒng)研究不同肥料組合對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明牛糞促進(jìn)了Deltaproteobacteria和Bacteroidetes的相對(duì)豐度；劉佳歡等[13]發(fā)現(xiàn)適量施用肥料對(duì)土壤微生物數(shù)量和土壤酶活性具有顯著促進(jìn)作用；但研究發(fā)現(xiàn)在使用再生水灌溉時(shí)減少氮肥的使用量更有利于土壤微生物多樣性的增加[10]。

農(nóng)村地區(qū)因存在村民居住分散、污水收集管道建設(shè)不完善、缺乏資金支持和后續(xù)的技術(shù)管理人員等問(wèn)題，所以在污水合理利用、降低生活污水處理成本及保護(hù)環(huán)境等方面有所不便，在選擇農(nóng)村污水處理技術(shù)的同時(shí)，研究在不同污水處理梯度下的污水資源化利用，即將污水處理到何種程度進(jìn)行污水回灌等資源化利用，可解決以上問(wèn)題。郭魏等[14]利用連續(xù)砂濾池工藝的尾水連續(xù)5年灌溉番茄，發(fā)現(xiàn)蔗糖酶活性有所降低，且在低氮條件下再生水灌溉對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較小，在高氮條件下再生水促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)；楊茜[15]利用生活污水原水、厭氧出水和“厭氧+人工濕地技術(shù)”尾水回灌，厭氧出水灌溉對(duì)土壤酶活性無(wú)顯著影響，但對(duì)土壤有益菌屬具有一定的促進(jìn)作用。高遠(yuǎn)等[16]則認(rèn)為A2O工藝的尾水灌溉對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量和土壤細(xì)菌群落多樣性具有抑制作用；周媛等[11]利用A/O反硝化生物濾池和臭氧氧化組合工藝的二級(jí)出水灌溉番茄，發(fā)現(xiàn)污水灌溉對(duì)土壤脲酶和淀粉酶活性有促進(jìn)作用，對(duì)土壤蔗糖酶和過(guò)氧化氫酶活性有抑制作用，且施氮處理對(duì)土壤酶活性具有顯著影響。由此可見(jiàn)，在不同污水處理工藝和肥料的共同作用下，不同處理梯度的污水對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性的影響結(jié)果不盡相同，且以往研究選取的污水處理梯度較少，多數(shù)僅選取一種或兩種污水處理梯度，缺少完整污水處理工藝下的各種污水處理梯度的研究，因此本文依據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)村實(shí)際情況，選擇適宜當(dāng)?shù)氐纳钗鬯幚砉に?，探討在各處理梯度污水資源化利用條件下，對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性負(fù)面影響較小或具有正面影響的污水處理梯度，對(duì)選取合適的農(nóng)村污水處理程度等方面具有重要意義。本研究通過(guò)小型污水處理裝置獲取不同處理程度的污水，在不同的施肥條件下，采用室內(nèi)模擬試驗(yàn)對(duì)污水灌溉的茭白-水稻輪作土壤進(jìn)行分析，探討不同處理梯度污水對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和酶活性的影響，以期為降低污水處理成本及生活污水水質(zhì)安全性回灌提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試土壤和試驗(yàn)用水

試驗(yàn)土壤取自合肥市肥西縣紫蓬鎮(zhèn)新農(nóng)村水稻田內(nèi)，除去地面雜草，收集0～25 cm層土壤。土壤收集后自然風(fēng)干，去除草根、石粒等雜物，過(guò)20目篩備用。供試土壤pH值6.35，有機(jī)質(zhì)12.77 g·kg-1，全氮0.91 g·kg-1，全磷0.46 g·kg-1，速效鉀110.44 mg·kg-1，速效磷12.34 mg·kg-1，堿解氮121.36 mg·kg-1。

生活污水原水取自安徽省合肥市蜀山區(qū)安徽中棉種業(yè)長(zhǎng)江有限責(zé)任公司污水池內(nèi)，經(jīng)小型污水處理試驗(yàn)裝置（圖1），其污水處理流程為污水池→厭氧→儲(chǔ)水池→接觸氧化→儲(chǔ)水池→土地處理系統(tǒng)→出水。

本研究的試驗(yàn)用水取自上述污水處理試驗(yàn)裝置，其中：污水處理梯度（1）為未經(jīng)處理設(shè)施處理，取自污水池的生活污水；污水處理梯度（2）為經(jīng)厭氧工藝的出水，取自三級(jí)厭氧池后的儲(chǔ)水池；污水處理梯度（3）為經(jīng)厭氧+接觸氧化工藝的出水，取自接觸氧化池后的儲(chǔ)水池；污水處理梯度（4）為經(jīng)厭氧+接觸氧化+土地處理系統(tǒng)工藝的出水，取自污水處理裝置的最終出水，（5）為清水作為對(duì)照，各污水水質(zhì)見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

室內(nèi)模擬試驗(yàn)為盆栽試驗(yàn)，用PVC板做成長(zhǎng)40 cm、寬40 cm、高50 cm的試驗(yàn)盆，在試驗(yàn)盆內(nèi)填土種植水稻和茭白。每個(gè)試驗(yàn)盆中填土30.0 kg，施用底肥后將每個(gè)盆中用清水澆透，采用茭白-水稻輪作模式進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。其中污水灌溉設(shè)5個(gè)處理：清水灌溉、處理梯度（1）出水、處理梯度（2）出水、處理梯度（3）出水和處理梯度（4）出水；施肥設(shè)兩個(gè)處理：完全不施肥W（0 kg N·hm-2）、施肥降低20%F（180 kg N·hm-2）。各處理分別用W1：不施肥水平下生活污水灌溉；FW1：施肥水平下生活污水灌溉；W2：不施肥水平下處理梯度（2）出水灌溉；FW2：施肥水平下處理梯度（2）出水灌溉；W3：不施肥水平下處理梯度（3）出水灌溉；FW3：施肥水平下處理梯度（3）出水灌溉；W4：不施肥水平下處理梯度（4）出水灌溉；FW4：施肥水平下處理梯度（4）出水灌溉；CK：不施肥水平下清水灌溉；FCK：施肥水平下清水灌溉表示。因污水中含有氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素，因此選擇的施肥量180 kg N·hm-2是本地農(nóng)田常規(guī)用量的80%。該研究共10個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

本試驗(yàn)肥料選用復(fù)合肥料（N-P2O5-K2O：15-15-15）作底肥施入盆內(nèi)，且在水稻分蘗期按75 kg·hm-2的標(biāo)準(zhǔn)追施肥料。選取長(zhǎng)勢(shì)和大小一致的茭白無(wú)性繁殖體，確保每盆存活的茭白植株為1株，待所有植物地上部分均正常生長(zhǎng)后，開(kāi)始污水灌溉，加入頻次均為每日一次，每次1.0 L，各處理灌溉時(shí)間和灌水定額相同；茭白收獲后，選取水稻秧苗以10 cm×10 cm的密度進(jìn)行移栽種植，在分蘗期保持水層1.5 cm，分蘗末期保持水層3.0 cm，其他時(shí)期保持平均水層2.5 cm。

1.3 樣品采集

水稻成熟后選取0～20 cm土壤層，采用五點(diǎn)法采集土壤，一部分新鮮土壤在0～4℃下保存用于土壤微生物的分離；另一部分新鮮土壤進(jìn)行風(fēng)干處理，用帶電玻璃棒吸附除去細(xì)根，揀去石礫及植物殘?bào)w，過(guò)1 mm和0.25 mm篩，用于土壤脲酶、蔗糖酶和堿性磷酸酶活性的測(cè)定。

圖1污水處理試驗(yàn)裝置示意圖Figure 1 Schematic diagramof sewage treatment test facility

表1試驗(yàn)用水水質(zhì)Table 1 Test water quality

1.4 土壤酶活性測(cè)定方法

土壤脲酶活性采用苯酚鈉比色法測(cè)定，土壤堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定，土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定[17]。

1.5 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.5.1 DNA提取

DNA提取參照DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取得到的DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用分光光度法（260 nm/280 nm光密度比）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.5.2 MiSeq測(cè)序

微生物多樣性檢測(cè)選取細(xì)菌16SrDNA V3～V4區(qū)，DNA樣本使用Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。細(xì)菌16SrDNA V3～V4擴(kuò)增引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）。PCR反應(yīng)體系（總體系為25μL）：12.5μL KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix、1μL Forward Primer（5μmol·L-1）、1μL Reverse Primer（5μmol·L-1）、5μL DNA（加入的DNA總量為30 ng），最后加5.5μL dd H2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，55℃退火50 s，72℃延伸45 s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。測(cè)序原始序列上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析與計(jì)算方法

在Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行Paired-end測(cè)序，根據(jù)barcodes歸類各處理組序列信息聚類為用于物種分類的OUT（Operational Taxonomic Units），OTU相似性設(shè)置為97%。對(duì)比silva數(shù)據(jù)庫(kù)，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息。利用qiime version v.1.8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平處理，并采用0.97的相似度進(jìn)行分析得到Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、Coverage指數(shù)和Shannon指數(shù)[18-20]。

Chao1指數(shù)：指示菌種豐富度，用以評(píng)估群落中的OTU數(shù)目。其公式為：

式中：Schao1為估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs為觀測(cè)到的OTU數(shù)；n1為只有一條序列的OTU數(shù)目；n2為只有兩條序列的OTU數(shù)目。

Simpson指數(shù)：用來(lái)評(píng)估群落中的優(yōu)勢(shì)種。其公式為：

式中：Ni為某一特定物種的個(gè)體的總數(shù)；N為發(fā)現(xiàn)的個(gè)體總數(shù)。

Coverage指數(shù)：觀測(cè)深度，用以表征各樣本的覆蓋率，反映了本次測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。其公式為：

式中：n1為只含一條序列的OTU數(shù)目；N為抽樣中出現(xiàn)的總的序列數(shù)目。

Shannon指數(shù)：用以反映群落中物種豐富度。其公式為：

式中：Pi為樣品中屬于第i種的個(gè)體的比例。

經(jīng)過(guò)UniFrac算法利用系統(tǒng)進(jìn)化的信息來(lái)比較樣品間物種群落差異，通過(guò)SPSS軟件對(duì)細(xì)菌多樣性指數(shù)和土壤酶活性進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌稀釋性曲線

稀釋性曲線（Rarefaction curve）即從樣品中隨機(jī)選擇一定數(shù)量的個(gè)體，計(jì)算個(gè)體代表的物種數(shù)，利用個(gè)體數(shù)量和物種數(shù)構(gòu)建曲線，從而比較具有不同數(shù)量測(cè)序數(shù)據(jù)的樣本中物種豐富度，確定樣品中測(cè)序數(shù)據(jù)的數(shù)量是否合理[21]。由圖2可知，在α=0.03的水平上，隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加，各處理的曲線均趨向平緩，這說(shuō)明本次試驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)的數(shù)量是合理的。

圖2不同處理的稀釋性曲線（α=0.03）Figure 2 Rarefaction curves of different treatments（α=0.03）

2.2 土壤細(xì)菌層次聚類分析

圖3基于bray curtis多樣本聚類樹(shù)Figure 3 Multiple copy clustering tree based on bray curtis

在多樣本聚類樹(shù)中，樹(shù)枝長(zhǎng)度代表的是樣本之間的距離，當(dāng)樣本相似度越高時(shí)，樣本越能聚集到一起[22]。如圖3所示，橫坐標(biāo)為各處理間的距離系數(shù)。以相似性0.8為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，樣本分為兩大類，一類是FW3、FW4、FW2、FW1，另一類是CK、W3、W4、FCK、W2、W1。在施肥條件下，與對(duì)照相比，污水灌溉使得細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其中FW2和FW4樣本相似度較高；在不施肥條件下，處理梯度較低的污水灌溉與清水灌溉的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化較大，W1和W2處理的樣本相似度高，W3和W4處理的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與對(duì)照相差較?。辉谕还喔葪l件下，施肥土壤和不施肥土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其中清水灌溉下的兩種土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化小于污水灌溉，處理梯度（3）灌溉下的兩種土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化小于其他處理梯度的污水灌溉處理。

2.3 不同處理梯度污水對(duì)細(xì)菌群落多樣性和群落組成的影響

2.3.1 不同處理梯度污水對(duì)土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響

Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)與群落多樣性呈正比，Simpson指數(shù)與群落多樣性呈反比，Coverage指數(shù)越高說(shuō)明樣本中序列被檢出的概率越高。由表2可知，在不施肥條件下，W2處理的Shannon指數(shù)（9.49）顯著低于其他處理，Simpson指數(shù)（0.008 4）顯著高于其他處理（P＜0.05）；在施肥條件下，不同污水灌溉的土壤細(xì)菌群落多樣性無(wú)顯著變化；同時(shí)，在相同灌溉條件下，除處理梯度（2），不施肥土壤的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于施肥土壤，Coverage指數(shù)略低于施肥土壤；處理梯度（1）、處理梯度（3）和處理梯度（4）的土壤中，不施肥的Simpson指數(shù)低于施肥土壤，處理梯度（2）和清水灌溉的土壤中，不施肥的Simpson指數(shù)高于施肥土壤。

2.3.2 不同處理梯度污水對(duì)土壤細(xì)菌在門水平上相對(duì)豐度的影響

在施肥和未施肥的土壤中共同檢測(cè)出了12種菌門，包括變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放 線 菌 門（Actinobacteria）、Parcubacteria、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、擬桿菌門（Bacteroidetes），Other為相對(duì)豐度低于1%的微生物。

由圖4可知，在施肥的條件下，變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度最高，其次是綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）；與對(duì)照相比，隨著污水處理強(qiáng)度的增加，變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度逐漸提高，在FW1處理（24.39%）下最低，低于對(duì)照土壤的29.28%；而FW1處理土壤中綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對(duì)豐度（27.10%、16.35%）均高于其他處理，與對(duì)照相近；污水灌溉對(duì)放線菌門（Actinobacteria）有促進(jìn)作用，F(xiàn)W1和FW4的促進(jìn)作用較強(qiáng)，相對(duì)豐度增幅為95.90%和62.87%，F(xiàn)W2和FW3的促進(jìn)效果較弱，相對(duì)豐度增幅為37.27%和20.11%；污水灌溉對(duì)厚壁菌門（Firmicutes）也具有一定的促進(jìn)作用，且FW2、FW3及FW4的促進(jìn)能力較強(qiáng)，相對(duì)增幅為146.91%、142.59%和132.10%。

表2不同處理對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響Table 2 Effects of different treatments on soil bacterial community diversity

在未施肥條件下，污水灌溉和清水灌溉的土壤中放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度低于施肥條件下的土壤，提高了硝化螺旋菌門（Nitrospirae）的相對(duì)豐度；與施肥土壤相比，W1抑制了綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對(duì)豐度，兩種菌門相對(duì)豐度降幅為13.58%和9.30%，其他3種處理梯度出水則提高了綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對(duì)豐度，與之相反的是W1對(duì)變形菌門（Proteobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和螺旋體菌門（Saccharibacteria）的相對(duì)豐度有促進(jìn)作用，其他3種處理梯度出水和清水灌溉的土壤對(duì)這3種菌門具有抑制作用；其他菌門相對(duì)豐度變化不明顯。

2.3.3 不同處理梯度污水對(duì)土壤細(xì)菌在屬水平上相對(duì)豐度的影響

由圖5可知，在施肥土壤中，F(xiàn)W1中厭氧菌屬（Anaerolinea）的相對(duì)豐度（2.27%）略高于其他處理；污水灌溉降低了土壤中厭氧黏細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter）的相對(duì)豐度，其中FW3對(duì)其抑制作用最強(qiáng)，相對(duì)豐度降低74.61%；與FCK相比，污水灌溉對(duì)Haliangium和Geobacter有抑制作用，其中FW4處理中兩種菌屬相對(duì)豐度的降幅為2.46%和9.06%，抑制作用最低，F(xiàn)W1處理中兩種菌屬相對(duì)豐度的降幅為56.64%和63.65%、FW3處理中的降幅為66.34%和28.43%，F(xiàn)W1和FW3處理對(duì)其抑制作用較強(qiáng)；污水灌溉提高了芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對(duì)豐度，F(xiàn)W2對(duì)兩者的促進(jìn)作用最好，相對(duì)豐度升高100%和261.40%，F(xiàn)W1、FW3和FW4次之；與FCK相比，F(xiàn)W3顯著提高了Candidatus_Nitrotoga的相對(duì)豐度，升幅為588.69%，而其他污水處理對(duì)Candidatus_Nitrotoga有抑制作用，F(xiàn)W1對(duì)Candidatus_Nitrotoga有顯著的抑制作用，降幅為97.35%。

圖4土壤細(xì)菌在門水平上的相對(duì)豐度Figure 4 Relative abundance of soil bacteriaat phylum level

圖5土壤細(xì)菌在屬水平上的相對(duì)豐度Figure 5 Relative abundance of soil bacteria at genus level

與施肥土壤相比，在未施肥土壤中污水灌溉提高了厭氧黏細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter）、Sideroxydans和Haliangium的相對(duì)豐度，分別增加了0.12%～0.92%、0.13%～1.05%、0.30%～0.95%，降低了鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對(duì)豐度，降低了0.28%～1.74%，但清水灌溉卻對(duì)鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對(duì)豐度有促進(jìn)作用，增加了0.81%。

2.4 不同處理梯度污水對(duì)土壤酶活性的影響

由表3得出，與施肥土壤相比，處理梯度（1）灌溉使得不施肥土壤中堿性磷酸酶活性降低；除此以外，在同一處理梯度污水灌溉下，不施肥土壤中的脲酶、蔗糖酶和堿性磷酸酶活性大于施肥土壤相應(yīng)的酶活性。不施肥土壤的堿性磷酸酶活性表現(xiàn)為W2＞W(wǎng)4＞W(wǎng)1＞W(wǎng)3＞CK，與施肥土壤中的變化趨勢(shì)一致，污水灌溉對(duì)土壤堿性磷酸酶活性具有促進(jìn)作用，在不同施肥條件下處理梯度（2）灌溉中的堿性磷酸酶活性相對(duì)于對(duì)照分別提高了55.40%和46.67%，促進(jìn)作用最強(qiáng)。不施肥土壤脲酶活性表現(xiàn)為W4＞W(wǎng)1＞W(wǎng)3＞W(wǎng)2＞CK，與清水灌溉相比，污水灌溉對(duì)不施肥土壤脲酶活性有促進(jìn)作用，且隨著污水處理強(qiáng)度的增加，土壤脲酶活性先降低后升高，在W2處理中脲酶活性最低，為106.49 U·g-1；施肥土壤中脲酶活性表現(xiàn)為FW1＞FCK＞FW4＞FW2＞FW3，F(xiàn)W3處 理 相 對(duì) 于FCK降 低 了25.85%，抑制了脲酶活性，其余幾個(gè)處理對(duì)施肥土壤脲酶活性無(wú)顯著影響。不施肥土壤的蔗糖酶活性表現(xiàn)為W2＞W(wǎng)1＞W(wǎng)3＞W(wǎng)4＞CK，施肥土壤蔗糖酶活性表現(xiàn)為FW3＞FW1＞FW2＞FW4＞FCK，污水灌溉土壤中蔗糖酶活性大于清水灌溉的土壤蔗糖酶活性。

3 討論

本研究表明，在施肥水平下，不同處理梯度的污水灌溉對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性影響均不顯著，與Ibekwe等[23]研究結(jié)果類似。但現(xiàn)在多數(shù)研究[5，24]認(rèn)為污水灌溉可提高土壤微生物多樣性，這可能有以下幾個(gè)原因：一是由于本次研究?jī)H有一次茭白-水稻輪作的生長(zhǎng)周期（8個(gè)月左右），與Bastida等[5]、Dang等[24]研究中的3年到30年灌溉周期相比，本次試驗(yàn)灌溉周期較短；二可能是土壤質(zhì)量、灌溉方式等問(wèn)題。在不施肥土壤中，W2降低了土壤中的細(xì)菌多樣性，其他3種污水在一定程度上表現(xiàn)出抑制作用，但與清水灌溉并無(wú)顯著差異，這可能是因?yàn)樵诓皇┓实耐寥乐?，植物更多地從污水和土壤中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而W2中的植物生長(zhǎng)更旺盛，所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也就更多，從而導(dǎo)致土壤肥力下降，而研究證明微生物豐富度及多樣性指數(shù)與土壤綜合肥力指數(shù)具有冪函數(shù)關(guān)系，當(dāng)微生物多樣性提高時(shí)，土壤綜合肥力指數(shù)也隨著提高，而土壤綜合肥力指數(shù)主要用以指示土壤肥力質(zhì)量，土壤微生物多樣性包含細(xì)菌群落多樣性在內(nèi)，因此土壤細(xì)菌多樣性增加有利于提高土壤肥力[4,25]，所以使得W2灌溉土壤中細(xì)菌多樣性降低。但研究發(fā)現(xiàn)在同一灌溉條件下，降低肥料的使用會(huì)刺激微生物對(duì)碳、氮的反應(yīng)[26]，因此可以增加細(xì)菌群落多樣性，這與郭魏[10]的結(jié)論相似。

土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)變化是在水質(zhì)和施肥互作下的群體性反應(yīng)，這種變化由優(yōu)勢(shì)種群的變化及某一部分非優(yōu)勢(shì)種群的有無(wú)來(lái)表現(xiàn)[27]。本次研究中發(fā)現(xiàn)，施肥的土壤中污水灌溉的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與清水灌溉相比發(fā)生了改變，土壤細(xì)菌在門水平上相對(duì)豐度變化較大，但在屬水平上優(yōu)勢(shì)種（unidentified）未發(fā)生明顯改變。這表明相對(duì)于清水灌溉，污水灌溉促進(jìn)了土壤中變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度，且隨著污水處理梯度的減弱、污水濃度的增加，土壤中污水濃度與變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)（FW3處理除外）；污水灌溉降低了土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）的相對(duì)豐度，提高了放線菌門（Actinobacteria）相對(duì)豐度，其中施肥土壤中的酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）相對(duì)豐度隨處理梯度的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，不施肥土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）隨著污水濃度的增加相對(duì)豐度先增加后減少的趨勢(shì)，不施肥土壤中污水濃度與放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度具有正相關(guān)性。變形菌門（Proteobacteria）中的固氮菌可固定土壤中的氮元素，這說(shuō)明當(dāng)污水處理梯度增加、污水濃度變低時(shí)，污水灌溉通過(guò)提高有益菌屬的相對(duì)豐度，促進(jìn)土壤中氮元素轉(zhuǎn)化的有關(guān)過(guò)程，但高濃度污水對(duì)其提高率較低，可能是因?yàn)槲鬯械奈⑸镫S灌溉進(jìn)入土壤，對(duì)土壤微生物產(chǎn)生了抑制作用；放線菌門（Actinobacteria）可以參與土壤中有機(jī)物的分解和氮循環(huán)[28-29]，這說(shuō)明污水灌溉可以促進(jìn)放線菌門（Actinobacteria）生長(zhǎng)繁殖，從而促進(jìn)了土壤有機(jī)物的分解，提高了土壤養(yǎng)分水平，其中生活污水原水灌溉更有利于放線菌門（Actinobacteria）生長(zhǎng)。酸桿菌門（Acidobacteria）可以降解植物殘?bào)w、參與單碳化合物降解，為土壤提供養(yǎng)分[30]，污水灌溉通過(guò)抑制酸桿菌門（Acidobacteria）的活性在一定程度上抑制了土壤中的碳循環(huán)過(guò)程，其中在施肥土壤中處理梯度（3）、在不施肥土壤中處理梯度（1）對(duì)其抑制作用較強(qiáng)。

表3不同污水濃度灌溉對(duì)土壤酶活性的影響Table 3 Effects of irrigation with different sewage concentrations on soil enzyme activity

土壤脲酶可以催化尿素，提高土壤供氮能力；土壤蔗糖酶使蔗糖加速分解，增加土壤中易溶性物質(zhì)[8]；土壤磷酸酶促進(jìn)了有機(jī)磷的脫磷過(guò)程，促進(jìn)磷元素的有效性[18]，土壤微生物通過(guò)分泌酶的形式參與到土壤各種反應(yīng)過(guò)程中。脲酶、蔗糖酶和磷酸酶與土壤中碳、氮、磷循環(huán)具有密切聯(lián)系，其變化反映了土壤養(yǎng)分的動(dòng)態(tài)變化情況[31]，因此土壤酶可以反應(yīng)微生物在土壤各項(xiàng)生化反應(yīng)中的強(qiáng)度及方向[32]。潘能等[33]研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)田土壤經(jīng)再生水灌溉后，土壤蔗糖酶、堿性磷酸酶和脲酶活性均有一定程度的提高；韓洋等[34]研究發(fā)現(xiàn)再生水對(duì)土壤蔗糖酶活性有促進(jìn)作用，García-Orenes等[35]研究發(fā)現(xiàn)污水灌溉提高了土壤脲酶和堿性磷酸酶活性。本研究表明，在施肥水平下，污水灌溉均促進(jìn)了土壤堿性磷酸酶和蔗糖酶的活性，在完全不施肥水平下，污水灌溉對(duì)3種酶活性均有不同程度的促進(jìn)作用。原因是相較于清水，污水中含有更多的氮、磷營(yíng)養(yǎng)元素和更多種類的微生物，這些物質(zhì)隨灌溉進(jìn)入到土壤中，提高了土壤微生物群落多樣性，從而使得堿性磷酸酶活性和蔗糖酶活性增加。但處理梯度（3）顯著降低了施肥土壤中脲酶活性，其他污水處理對(duì)脲酶活性無(wú)顯著影響，且處理梯度（3）使得施肥土壤中與氮有關(guān)的變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度顯著降低，這可能是因?yàn)樘幚硖荻龋?）中Candidatus Nitrotoga的相對(duì)豐度高于其他污水處理5.88%～269.41%，Candidatus Nitrotoga屬于亞硝酸鹽氧化細(xì)菌，亞硝酸鹽氧化細(xì)菌主要作用是將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮[36]，而郭魏等[10]研究發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮含量與土壤脲酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，因此導(dǎo)致其脲酶活性和變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度降低，其他處理中的微生物相對(duì)豐度相差較小，導(dǎo)致其他污水處理對(duì)脲酶活性無(wú)顯著影響。同時(shí)在同一灌溉條件下，不施肥土壤中3種酶活性大于施肥土壤中酶活性，對(duì)比施肥處理，減少常規(guī)肥刺激了微生物對(duì)氮磷的反應(yīng)，提高了3種酶活性，這與以往研究結(jié)果[16]相似。

4 結(jié)論

（1）在施肥條件下，不同處理梯度下的污水灌溉對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性無(wú)顯著影響；完全不施肥條件下，處理梯度（2）降低了土壤中的細(xì)菌群落多樣性；在同一灌溉條件下，降低肥料的使用可以增加細(xì)菌群落多樣性。

（2）污水灌溉對(duì)細(xì)菌門水平上的優(yōu)勢(shì)種影響較大，對(duì)細(xì)菌屬水平上的優(yōu)勢(shì)種影響較小。隨著污水處理梯度的提高，變形菌門（Proteobacteria）活性提高，有利于土壤氮元素的轉(zhuǎn)化；污水灌溉在不同施肥水平上促進(jìn)了土壤中放線菌門（Actinobacteria）的生長(zhǎng)繁殖，處理梯度（1）對(duì)其促進(jìn)作用最強(qiáng)，更有利于植物結(jié)瘤固氮、提高土壤肥力；污水灌溉中酸桿菌門（Acidobacteria）的活性顯著低于清水灌溉，對(duì)土壤物質(zhì)循環(huán)造成一定影響。

（3）隨著污水處理梯度的加強(qiáng)，堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)出先增加后減少再增加的趨勢(shì)，蔗糖酶顯現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，且均高于對(duì)照，其中處理梯度（2）綜合效果更優(yōu)；土壤脲酶活性表現(xiàn)為先降低后增加的趨勢(shì)，除施肥條件下處理梯度（3）外，其他處理對(duì)施肥土壤脲酶活性影響不顯著；在同一灌溉條件下，不施肥土壤中3種酶活性大于施肥土壤中酶活性[處理梯度（1）堿性磷酸酶活性相當(dāng)]。

（4）綜合考慮，在不施肥水平下使用生活污水原水灌溉、在施肥水平下施用厭氧處理出水灌溉對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化、提高酶活性更有利。