MC1預(yù)處理對豆秸水解特性及產(chǎn)甲烷效率的影響

曹燕篆，張海波，蘇婉，程紅艷，閆雙堆，卜玉山，崔宗均，李佳佳

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山西 太谷030801；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津300191；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京100193）

大豆是美國、巴西、中國和阿根廷等許多國家重要的糧食來源[1]，2018年國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，我國大豆種植面積高達8 413萬hm2，產(chǎn)量為1 596萬t。大豆收獲后會產(chǎn)生大量秸稈及豆莢殼，目前只有少量秸稈被用作生活能源及動物飼料，大部分秸稈被直接丟棄或就地焚燒，不僅污染了環(huán)境，也極大地浪費了資源[2]。厭氧消化技術(shù)是實現(xiàn)有機固體廢物資源化利用和滿足可再生能源需求的重要措施[3]。

秸稈等木質(zhì)纖維素原料因其結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜、抗微生物及酶分解能力強，導(dǎo)致秸稈水解效率差、甲烷產(chǎn)量低，嚴(yán)重限制了秸稈沼氣的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。預(yù)處理技術(shù)是提高秸稈等木質(zhì)纖維素原料甲烷轉(zhuǎn)化效率的有效手段[4-5]，常見的預(yù)處理方式包括物理預(yù)處理、化學(xué)預(yù)處理及生物預(yù)處理等。物理預(yù)處理主要是通過減小秸稈粒徑、提高比表面積，從而增加纖維素與微生物或酶的接觸幾率[6]，如Dai等[7]將水稻秸稈粒徑從20 mm減小到0.075 mm，累積甲烷產(chǎn)量提高了84%。化學(xué)預(yù)處理是利用化學(xué)試劑去除木質(zhì)素等難降解物質(zhì)，以提高纖維素的酶解效率[8]，如Xiong等[2]利用熱化學(xué)方法預(yù)處理大豆秸稈，甲烷產(chǎn)量提高了62%。生物預(yù)處理是利用具有木質(zhì)纖維素降解能力的功能微生物或酶，促進秸稈的生物降解，提高秸稈的轉(zhuǎn)化效率[4]。與其他預(yù)處理方式相比，生物預(yù)處理具有能耗低、環(huán)境友好和能提高產(chǎn)甲烷菌活性等優(yōu)點，備受研究者青睞。Yan等[9]利用復(fù)合菌系BYND-5預(yù)處理水稻秸稈，甲烷產(chǎn)量提高了20%；Deng等[10]利用木霉菌RUTC30預(yù)處理大豆及水稻秸稈混合物，累積甲烷產(chǎn)量提高了807%。

微生物復(fù)合系MC1是一組能夠有效降解秸稈木質(zhì)纖維素的復(fù)合菌群[11-14]。玉米、水稻、小麥等多種農(nóng)作物秸稈，經(jīng)其預(yù)處理水解作用后，原料厭氧消化產(chǎn)甲烷性能得到有效提高[15-17]。但MC1對木質(zhì)化程度較高的大豆秸稈預(yù)處理能力及產(chǎn)甲烷效率仍未可知，且預(yù)處理過程中雜菌對MC1菌群功能的影響仍不清楚。針對大豆秸稈木質(zhì)化程度高、能源轉(zhuǎn)化效率低等問題，本研究利用復(fù)合菌系MC1對滅菌大豆秸稈（SS）及未滅菌大豆秸稈（NSS）進行12 d微生物預(yù)處理，分析大豆秸稈的水解特性及規(guī)律，揭示MC1預(yù)處理對其產(chǎn)甲烷性能的影響，從而為大豆秸稈的高效資源化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

復(fù)合菌系MC1由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院廢棄物資源利用研究室提供[18]。大豆秸稈取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗站，秸稈自然風(fēng)干后粉碎至5 mm左右。厭氧發(fā)酵接種污泥取自實驗室以牛糞為原料長期穩(wěn)定運行的厭氧發(fā)酵反應(yīng)器，秸稈及接種物性質(zhì)見表1。

表1秸稈及接種物性質(zhì)Table 1 Characteristicsof the soybean straw and inoculumused in experiment

1.2 試驗設(shè)計

MC1預(yù)處理大豆秸稈試驗：向500 mL藍蓋瓶中加入200 mL PCS培養(yǎng)基和6 g大豆秸稈，（1）SS處理組為將含有大豆秸稈的培養(yǎng)基置于121℃下滅菌20 min，然后接種MC1活化菌；（2）NSS處理組為直接接種MC1活化菌。接種量均為10%V/V，接種后置于50℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。以不添加復(fù)合菌系的SS和NSS為對照，進行為期12 d的微生物預(yù)處理試驗。每個處理重復(fù)3次，分別于預(yù)處理1、3、5、7、9、12 d取樣，測定大豆秸稈減質(zhì)量、木質(zhì)纖維素含量和預(yù)處理體系pH值、揮發(fā)性有機酸（VFAs）及溶解性化學(xué)需氧量（sCOD）含量。

預(yù)處理體系厭氧發(fā)酵試驗：以預(yù)處理體系VFAs產(chǎn)量和秸稈減質(zhì)量為依據(jù)，獲得最佳MC1預(yù)處理時間。MC1預(yù)處理大豆秸稈試驗表明預(yù)處理3 d和7 d VFAs產(chǎn)量最高，預(yù)處理12 d秸稈減質(zhì)量最多。因此將大豆秸稈按上述步驟進行3、7 d及12 d的預(yù)處理，然后向預(yù)處理體系分別加入100 mL接種污泥，并添加去離子水補至發(fā)酵體積300 mL，混勻后充氮氣3 min，確保發(fā)酵體系達到厭氧條件，置于（35±2）℃培養(yǎng)箱發(fā)酵。以不添加底物的接種污泥處理為空白，以未接種復(fù)合菌系的SS和NSS處理為對照，進行大豆秸稈及其預(yù)處理體系的產(chǎn)甲烷性能評價，每個處理重復(fù)3次，發(fā)酵過程中每日測定沼氣總產(chǎn)氣量及甲烷含量，發(fā)酵周期為23 d。

1.3 MC1預(yù)處理指標(biāo)測定

MC1預(yù)處理過程中的殘余秸稈于60℃烘干至恒質(zhì)量后稱量質(zhì)量，計算秸稈總減質(zhì)量。烘干后的秸稈粉碎過1 mm篩，稱取0.5 g至F57專用袋中，用ANKOM220型纖維分析儀測定纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量，方法參照儀器操作手冊。

預(yù)處理體系經(jīng)8 000 r·min-1離心10 min后測定相關(guān)指標(biāo)。采用pH計（日本Horiba B-212）測定pH值，采用高效液相色譜儀（島津LC-20A，日本）測定揮發(fā)性有機酸[19]，采用COD快速檢測儀（Lovibond E799718，德國）測定sCOD[20]。

1.4 氣體指標(biāo)測定及產(chǎn)甲烷動力學(xué)分析

試驗采用BMP-Test系統(tǒng)（WAL-BMP-Testsystem 3150，德國）測定厭氧發(fā)酵瓶中壓力，根據(jù)壓力差計算日產(chǎn)沼氣量；利用氣相色譜（島津GC-2014，日本）測定沼氣中甲烷含量[21]。采用動力學(xué)模型Modified Gompertz方程對各處理產(chǎn)甲烷數(shù)據(jù)進行擬合[22]，公式如下：

式中：M為t時刻的累積甲烷產(chǎn)量，mL·g-1VS；P為最大甲烷產(chǎn)量，mL·g-1VS；Rm為最大產(chǎn)甲烷速率，mL·g-1VS·d-1；λ為延滯期，d；P、Rm和λ均通過批式厭氧發(fā)酵試驗數(shù)據(jù)擬合獲得。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗中數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析使用軟件Microsoft Excel 2010、Origin 9.1和SPSS 22.0。方差分析使用Duncan的多范圍檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC1預(yù)處理過程中大豆秸稈的減質(zhì)量分析

MC1預(yù)處理過程中大豆秸稈減質(zhì)量如圖1A所示。秸稈經(jīng)過12 d的降解，SS和NSS總減質(zhì)量率分別為39.08%和34.29%，SS減質(zhì)量顯著高于NSS（P＜0.05）。秸稈木質(zhì)纖維素成分變化如圖1B所示，大豆秸稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別為47.20%、16.31%和22.48%，滅菌后略有下降，分別為42.60%、15.89%和21.72%，與滅菌前相比無顯著變化，說明滅菌對秸稈木質(zhì)纖維素成分的影響較小。12 d預(yù)處理結(jié)束后，NSS和SS的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率分別為30.1%、41.6%、17.2%和41.7%、38.5%、29.9%，表明MC1在雜菌存在的條件下仍能有效降解大豆秸稈。

2.2 大豆秸稈預(yù)處理體系pH及sCOD變化規(guī)律

大豆秸稈預(yù)處理體系pH及sCOD變化如圖2所示，pH呈先下降后升高的趨勢，其中SS預(yù)處理體系pH低于NSS（7 d除外），并在整個預(yù)處理過程中pH均維持在7.45以下。預(yù)處理3 d，SS與NSS體系sCOD的濃度均達到最大值，分別為5.87 g·L-1及5.39 g·L-1。預(yù)處理12 d，SS的sCOD濃度為4.51 g·L-1，顯著高于NSS（P＜0.05），可能與MC1對SS纖維素降解效果顯著高于NSS有關(guān)（圖1B）。

圖2大豆秸稈預(yù)處理過程中水解液pH與sCOD的變化Figure 2 The changes of pH and sCODduring straw pretreatment

圖1復(fù)合菌系MC1預(yù)處理過程中大豆秸稈的減質(zhì)量及木質(zhì)纖維質(zhì)量變化Figure 1 Weight loss of soybean straw and weight of linocellulose composition during pretreatment by MC1

2.3 大豆秸稈預(yù)處理體系揮發(fā)性有機酸的變化

MC1預(yù)處理大豆秸稈過程中產(chǎn)生的主要揮發(fā)性有機酸變化如圖3所示。預(yù)處理體系有機酸總量整體呈先升高后降低的趨勢，其中預(yù)處理12 d含量最低，說明預(yù)處理時間越長有機酸損失越大，這與預(yù)處理后期秸稈降解速率減慢，有機酸產(chǎn)生量低于微生物消耗量有關(guān)。

SS預(yù)處理體系中總有機酸含量出現(xiàn)兩個峰值，分別是預(yù)處理第3 d（2.18 g·L-1）及第7 d（1.77 g·L-1），呈現(xiàn)出M型走勢。SS水解產(chǎn)物以乙酸為主，占VFAs總量的72.4%～93.5%，預(yù)處理3 d濃度最高為1.89 g·L-1，預(yù)處理體系中未檢測到丁酸。

NSS預(yù)處理體系VFAs總量在預(yù)處理第7 d達到最高，其中乙酸占比最大，但乙酸含量比SS預(yù)處理體系低23.1%～90.0%。由此可知，雜菌會影響MC1對大豆秸稈的降解速率及降解功能的穩(wěn)定，并減少了預(yù)處理體系中VFAs的積累。與SS不同，NSS預(yù)處理體系中丁酸占VFAs總量的5.7%～20.7%，可能與秸稈自身攜帶的雜菌有關(guān)。

2.4 大豆秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣特征

由于大豆秸稈減質(zhì)量在預(yù)處理12 d最高，秸稈預(yù)處理體系VFAs產(chǎn)量在第3 d及第7 d達到最大，試驗選用預(yù)處理3、7 d及12 d的預(yù)處理體系（分別記為d3、d7及d12）作為發(fā)酵底物，對大豆秸稈厭氧發(fā)酵性能進行評價。如圖4A、圖4B所示，預(yù)處理時間相同的情況下，經(jīng)過23 d的發(fā)酵，SS預(yù)處理體系累積產(chǎn)氣量均顯著大于NSS（P＜0.05）。與未處理組（d0）相比，MC1 3 d預(yù)處理組累積產(chǎn)沼氣量及累積產(chǎn)甲烷量分別提高了34.13%及36.86%（SS）、20.65%及34.27%（NSS），其中SS-d3預(yù)處理體系獲得最大累積沼氣產(chǎn)量（499.09 mL·g-1VS）及累積甲烷產(chǎn)量（304.90 mL·g-1VS）。由此可見，MC1預(yù)處理能有效提高秸稈的產(chǎn)氣效率。

圖3秸稈預(yù)處理體系揮發(fā)性有機酸的變化Figure 3 Changes of VFAs antent of hydrolysate during straw pretreatment

不同預(yù)處理體系日產(chǎn)甲烷量如圖4C所示。在厭氧發(fā)酵第5 d，MC1預(yù)處理體系SS-d3及NSS-d3日產(chǎn)甲烷量率先達到峰值，分別為30.37 mL·g-1VS和32.12 mL·g-1VS。未經(jīng)MC1處理的對照組SS-d0和NSS-d0，在厭氧發(fā)酵第7 d達到峰值，分別為22.66 mL·g-1VS及20.96 mL·g-1VS，顯著低于秸稈3 d預(yù)處理體系。由此可見，MC1預(yù)處理在提高大豆秸稈累積甲烷產(chǎn)量的同時，加快了甲烷轉(zhuǎn)化進程。另外，12 d預(yù)處理體系日產(chǎn)甲烷量始終較低，可能是長時間預(yù)處理過程中VFAs大量損失及產(chǎn)甲烷菌可利用底物減少所致。圖4D為大豆秸稈厭氧發(fā)酵過程中平均甲烷含量，除了NSS-d12預(yù)處理體系外，其他預(yù)處理體系的甲烷含量與對照組沒有顯著差異（P＞0.05），均值為59.4%～64.4%。綜上，MC1預(yù)處理3 d能有效提高大豆秸稈產(chǎn)甲烷性能。

2.5 產(chǎn)甲烷動力學(xué)分析

表2描述了大豆秸稈MC1預(yù)處理體系產(chǎn)甲烷動力學(xué)特性。Modified Gompertz模型較好地擬合了不同預(yù)處理體系的產(chǎn)甲烷特征（R2為0.991～0.999），大豆秸稈經(jīng)MC1預(yù)處理后，其產(chǎn)氣潛力提高了14.29%～73.67%（NSS-d12除外）。3 d預(yù)處理體系的最大產(chǎn)甲烷量（P）和最大產(chǎn)甲烷速率（Rm）數(shù)值最高，表明無論是否有雜菌的存在，復(fù)合菌系MC1都能有效提高大豆秸稈產(chǎn)甲烷率。但當(dāng)預(yù)處理時間超過7 d后酸化體系產(chǎn)甲烷的延遲時間（λ）延長，且高于對照處理組。因此，本研究MC1預(yù)處理大豆秸稈的時間不宜超過3 d。

3 討論

大豆秸稈富含木質(zhì)纖維素，其結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜，在能源轉(zhuǎn)化過程中效率較低。李家威等[23]以6種雜糧秸稈為原料進行產(chǎn)甲烷試驗，發(fā)現(xiàn)大豆秸稈累積產(chǎn)氣量最低。微生物預(yù)處理能夠有效提高木質(zhì)纖維素原料的產(chǎn)甲烷效率，但雜菌對主要功能菌的繁殖代謝具有一定的影響。經(jīng)過12 d MC1預(yù)處理，滅菌及非滅菌大豆秸稈總質(zhì)量分別減少了39.08%和34.29%，且SS半纖維素降解率低于NSS，預(yù)示MC1能夠在非滅菌條件下保持生長優(yōu)勢，進而有效降解大豆秸稈。Hua等[24]的報道也證實了MC1在不滅菌的復(fù)雜環(huán)境中對秸稈具有較高的降解效率，而Yu等[14]的研究進一步發(fā)現(xiàn)MC1能夠在非滅菌環(huán)境中促進玉米秸稈的半纖維素分解。

圖4厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣結(jié)果Figure 4 Biogas production during anerobic fermentation

滅菌環(huán)境中MC1大豆秸稈預(yù)處理體系的有機酸產(chǎn)量呈現(xiàn)M型走勢，乙酸含量最高且無丁酸產(chǎn)生，這與前人的研究結(jié)果較為一致[11，24-25]。同時，本研究在非滅菌預(yù)處理體系中檢測到了丁酸，進一步證實了秸稈水解過程中產(chǎn)生的有機酸種類、濃度與微生物種類、溫度及有機物種類等因素相關(guān)[26-27]。Yan等[9]利用BYND-5預(yù)處理水稻秸稈發(fā)現(xiàn)水解液中丁酸含量最高，其次為丙酸和乙酸。Zhang等[28]利用高溫復(fù)合菌群預(yù)處理木薯渣發(fā)現(xiàn)前36 h水解液中丁酸產(chǎn)量最高，隨后乙酸濃度迅速增加。

大豆秸稈經(jīng)MC1預(yù)處理3 d，滅菌和非滅菌預(yù)處理體系比未處理的對照組累積產(chǎn)甲烷量分別提高了36.86%和34.27%，表明MC1菌群預(yù)處理有效提高了大豆秸稈的產(chǎn)氣效率。分析原因主要包括以下兩點：一是菌群預(yù)處理增加了秸稈中纖維素成分的水解，提高了發(fā)酵體系VFAs含量和底物利用率；二是菌群預(yù)處理提高了厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷菌的活性，Zhao等[29]發(fā)現(xiàn)滅菌玉米秸稈經(jīng)復(fù)合菌群預(yù)處理后，厭氧發(fā)酵過程中甲烷鬃毛菌的活性明顯提高，該菌可直接利用乙酸生成甲烷。但增加預(yù)處理時間會降低產(chǎn)氣效率，Yuan等[11]的研究證實延長預(yù)處理時間不利于有機酸積累及甲烷生產(chǎn)，并且工程實際應(yīng)用中延長酸化時間也不利于厭氧發(fā)酵的高效運行[30]。

表2不同預(yù)處理體系大豆秸稈產(chǎn)甲烷動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parametersof pretreated soybean straw during ADprocess

4 結(jié)論

（1）MC1能有效降解大豆秸稈，對滅菌秸稈纖維素及木質(zhì)素的降解量顯著高于未滅菌秸稈（P＜0.05）。MC1預(yù)處理過程中，滅菌大豆秸稈預(yù)處理體系VFAs總量高于未滅菌大豆秸稈預(yù)處理體系，其中乙酸含量最高，占比72.4%以上。由于雜菌的影響，未滅菌大豆秸稈預(yù)處理體系VFAs累積速率減緩，乙酸組分占比減少，且有丁酸產(chǎn)生。

（2）滅菌大豆秸稈預(yù)處理體系累積產(chǎn)甲烷量顯著高于未滅菌大豆秸稈預(yù)處理體系，隨著MC1預(yù)處理時間增加，甲烷產(chǎn)量降低。經(jīng)過3 d的微生物預(yù)處理作用，滅菌大豆秸稈預(yù)處理體系和未滅菌大豆秸稈預(yù)處理體系獲得最高甲烷產(chǎn)量，分別為304.90 mL·g-1VS及257.41 mL·g-1VS，分別比未經(jīng)處理的滅菌秸稈和非滅菌秸稈提高了36.86%和34.27%。

（3）產(chǎn)甲烷動力學(xué)分析表明大豆秸稈3 d預(yù)處理體系的最大甲烷產(chǎn)量和最大產(chǎn)甲烷速率均高于秸稈未處理對照組和其他秸稈預(yù)處理組，推薦MC1微生物菌群對大豆秸稈的最佳預(yù)處理時間為3 d。