甘薯薯瘟病菌RPA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

李華偉, 林志堅(jiān), 張 鴻, 劉中華, 李國良, 湯 浩, 邱思鑫

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/農(nóng)業(yè)部南方薯類科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/福建省特色旱作物品種選育工程技術(shù)研究中心,福建 福州 350013)

由青枯菌(Ralstoniasolanacearum)引起的甘薯薯瘟病是甘薯生產(chǎn)上一種重要的土傳細(xì)菌性病害，主要分布在我國的南方甘薯產(chǎn)區(qū)(福建、廣東、廣西、臺(tái)灣).甘薯薯瘟病能使甘薯減產(chǎn)30%～80%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)100%，嚴(yán)重威脅甘薯的生產(chǎn)[1-2].發(fā)病初期的典型癥狀是植株出現(xiàn)輕度萎蔫，但整個(gè)植株為綠色；發(fā)病中后期，甘薯莖稈變?yōu)楹稚⒑诤稚?，整個(gè)植株萎蔫、死亡.該病與其他甘薯細(xì)菌病害(甘薯黑腐病、甘薯莖腐病)癥狀類似或混合發(fā)生,被列為我國檢疫性植物病害[3-5].早期診斷對(duì)該病的防控尤為重要.

目前，對(duì)青枯菌常用的檢測(cè)方法有平板分離、血清學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等[6-14].平板分離是通過對(duì)病原菌進(jìn)行分離、純化，并根據(jù)菌落形態(tài)特征及生理生化特性等對(duì)病害進(jìn)行檢測(cè)，該方法需配制各種試劑，工作量大且周期長；傳統(tǒng)的血清學(xué)方法需制備抗血清，技術(shù)門檻高且不利于少量樣品的檢測(cè)；PCR和FQ-PCR方法雖然可以快速有效地檢測(cè)病原物，但需要昂貴的專業(yè)儀器，且不適合野外及基層單位應(yīng)用；FQ-LAMP是一種快速、靈敏、特異和可視化的檢測(cè)方法，聚合酶(BstDNA polymerase)可在恒溫條件下對(duì)靶基因擴(kuò)增，但LAMP在檢測(cè)過程中會(huì)產(chǎn)生氣溶膠，易出現(xiàn)假陽性.重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)是英國TwistDx Inc 公司研發(fā)的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，被認(rèn)為是可以替代PCR核酸檢測(cè)的新興技術(shù)[15].近年來，RPA技術(shù)已被廣泛用于病原菌的檢測(cè)[16-18]，但還未見利用RPA技術(shù)檢測(cè)甘薯薯瘟病菌的報(bào)道.本試驗(yàn)擬建立甘薯薯瘟病菌RPA檢測(cè)方法，為實(shí)現(xiàn)該病的早期快速診斷提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 甘薯薯瘟病菌(R.solanacearumSWRS-1、SWRS-2)、馬鈴薯青枯菌(R.solanacearumPORS-1)、番茄青枯菌(R.solanacearumTMRS-1)、辣椒青枯菌(R.solanacearumPPRS-1)、茄子青枯菌(R.solanacearumEPRS-1)、煙草青枯菌(R.solanacearumTORS-1)、甘薯黑腐菌(ErwiniacarotovoraspSWX15、SWN15)均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所分離并保存.

1.1.2 主要試劑及儀器 TwistAmpTMbasic Kit RPA 試劑盒(英國TwistDxInc公司)，細(xì)菌DNA提取試劑盒(Bacteria Genomic DNA Kit)、2×Es Taq MasterMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司).金屬浴、電泳槽(北京六一生物科技有限公司)，Veriti 96孔梯度PCR儀(AB Applied Biosystems)，超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000C(美國賽默飛世爾科技公司)，法國Vilber凝膠成像系統(tǒng)(北京五洲東方有限公司).

1.2 方法

1.2.1 病原菌采集與分離 甘薯薯瘟病樣采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所實(shí)驗(yàn)基地和福建省福鼎市疊石鄉(xiāng)甘薯田.采用TTC平板[TTC培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，牛肉浸膏3 g，瓊脂粉15 g，加蒸餾水定容至1 L，pH 7.2，高壓滅菌.每100 mL培養(yǎng)基加入400 μL已過濾除菌的1% TTC(2，3，5-氯化三苯四氮唑)溶液]方法分離并純化病原菌，經(jīng)純化的菌株保存于-80 ℃，備用.

1.2.2 病原菌培養(yǎng)及DNA提取 取保存的菌種在TTC平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落于NA培養(yǎng)基(蛋白胨5 g、牛肉浸膏3 g、葡萄糖2.5 g，加蒸餾水定容至1 L，pH 7.2)中，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h.使用DNA快速提取試劑盒提取病原菌DNA.

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)得的甘薯薯瘟病菌orf428特異基因序列，依據(jù)RPA引物設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了2對(duì)RPA擴(kuò)增引物(表1)，引物序列由福州博尚生物有限公司合成.

表1 RPA和PCR檢測(cè)引物

1.2.4 RPA反應(yīng) 取模板DNA 2 μL、Rehydration Buffer 29.5 μL、引物F和R各2.4 μL、ddH2O 11.2 μL，將配好的47.5 μL體系加入凍干的重組酶聚合酶中，最后再加入醋酸鎂溶液(MgOAc，280 mmol·L-1)2.5 μL，瞬時(shí)離心.RPA反應(yīng)的條件為39 ℃恒溫?cái)U(kuò)增20 min，冰上終止反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后，在每個(gè)反應(yīng)管中加入50 μL酚/氯仿(1∶1),10 000 r·min-1離心5 min，留取上清進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳.

1.2.5 普通PCR反應(yīng) 選用青枯菌特異性引物759F/760R[19]進(jìn)行普通PCR檢測(cè).反應(yīng)體系：2×Es Taq MasterMix 10 μL，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL.擴(kuò)增程序：預(yù)變性96 ℃，5 min；變性94 ℃，15 s；退火59 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；后延伸72 ℃，10 min.取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行電泳.

1.2.6 RPA特異性檢測(cè) 分別以2株甘薯薯瘟病菌(SWRS-1、SWRS-2)、5株其他作物青枯菌(PORS-1、TMRS-1、PPRS-1、EPRS-1、TORS-1)和2株甘薯黑腐菌(SWX15、SWN15)的DNA作為模板，以清水為對(duì)照，利用RPA反應(yīng)進(jìn)行引物特異性檢測(cè).

1.2.7 RPA靈敏度檢測(cè) 使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定甘薯薯瘟病菌DNA濃度，并將其調(diào)整為100 ng·μL-1.采用10倍梯度稀釋法分別稀釋為10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，并與普通PCR做比較.

1.2.8 RPA方法應(yīng)用 取甘薯薯瘟病菌菌液，以經(jīng)過沸水浴(10 min)處理和不做任何處理的菌液為模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增，檢測(cè)甘薯薯瘟病菌.

取田間發(fā)病組織，剪碎浸泡5～10 min，并用沸水溫浴10 min，以經(jīng)過浸泡處理的菌液為模板，分別用RPA方法和普通PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)田間病樣中的薯瘟病菌.

從本研究室抗薯瘟病鑒定圃中分別隨機(jī)取土壤和水樣3份.土壤樣品處理：每5 g土壤加10 mL無菌水，振蕩混勻，靜置30 min，取上清液，沸水溫浴10 min.水體樣品處理：取500 μL水樣，沸水溫浴10 min.以處理的土壤上清液和水樣為模板，以薯瘟菌DNA為陽性對(duì)照，無菌水為陰性對(duì)照，分別用PCR方法和RPA方法檢測(cè)土壤及水體中的薯瘟病菌.

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯薯瘟病癥狀與病原菌落特征

田間發(fā)病植株的地上部葉片萎蔫，剝開莖表皮后能看到維管束變?yōu)楹稚蚝诤稚l(fā)病嚴(yán)重的植株拐頭處干枯變黑，植株枯死(圖1A-B)；地下部發(fā)病輕微的薯塊外表無明顯癥狀，但薯蒂處呈水漬狀變褐或發(fā)黑，橫切面可看到褐色或黑色斑點(diǎn)，或連成片，有刺鼻氣味，發(fā)病嚴(yán)重的薯塊整個(gè)腐爛，發(fā)出刺鼻臭味(圖1C-D).在TTC平板上，病原菌落中間呈鮮紅色，邊緣乳白色，且流動(dòng)性強(qiáng)，倒置培養(yǎng)時(shí)容易沿皿壁向下流動(dòng)(圖1E-F).

2.2 RPA特異性

通過引物篩選試驗(yàn)，篩選出擴(kuò)增效果較好的一對(duì)引物:上游引物F為5′-TTACCAGTTAAAGAATGACCCAAGACATCCAGTG-3′,下游引物R為5′-TCCTATTACAAGAGCAATCAACCAACCTCCAAGA-3′.建立RPA檢測(cè)體系，對(duì)供試菌株的檢測(cè)結(jié)果顯示，2株經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性的甘薯薯瘟病菌的RPA擴(kuò)增結(jié)果為陽性，而其他7株菌和空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性(圖2)，說明建立的RPA檢測(cè)方法特異性較強(qiáng).

2.3 RPA靈敏度

不同濃度的病原菌DNA經(jīng)RPA反應(yīng)后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).結(jié)果表明，甘薯薯瘟病菌RPA檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)1 pg·μL-1(圖3A)，與普通PCR檢測(cè)靈敏度相當(dāng)(圖3B).

2.4 甘薯薯瘟病菌菌液檢測(cè)

以用沸水浴(10 min)處理和不經(jīng)過沸水浴處理的甘薯薯瘟病菌菌液為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).結(jié)果表明，經(jīng)過沸水浴處理后的菌液能夠擴(kuò)增出特異性條帶，而不經(jīng)過沸水浴處理的菌液不能擴(kuò)增出特異性條帶(圖4)，說明RPA能夠直接檢測(cè)經(jīng)過沸水浴處理后的甘薯薯瘟病菌菌液.

2.5 RPA檢測(cè)方法的應(yīng)用

應(yīng)用建立的RPA檢測(cè)體系，對(duì)采自福建福州、福鼎、三明、泉州、連城的8個(gè)甘薯薯瘟病樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陽性(圖5A)，與PCR鑒定結(jié)果(圖5B)一致.利用RPA方法對(duì)土壤和水樣中的薯瘟病菌進(jìn)行檢測(cè)，能檢測(cè)到3個(gè)土壤樣本和2個(gè)水體樣本中的薯瘟病菌(圖5C)，其結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果(圖5D)相當(dāng).這說明建立的RPA方法可靠，能夠用于田間樣品(薯塊、土壤、水體)的薯瘟病菌檢測(cè).

3 結(jié)論

RPA作為一種新興的檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種病原菌的檢測(cè)，如番茄黃化曲葉病毒、番茄細(xì)菌性葉斑病菌、馬鈴薯病毒病等[15,20-22].普通 PCR需經(jīng)過變性、退火、延伸等3個(gè)不同溫度階段進(jìn)行擴(kuò)增，而 RPA技術(shù)在常溫下即可進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，檢測(cè)時(shí)間大大縮短[22-23].本研究依據(jù)RPA技術(shù)原理建立一種甘薯薯瘟病菌的快速檢測(cè)方法，在39 ℃恒溫下只需20 min就能完成目標(biāo)DNA擴(kuò)增，其檢測(cè)結(jié)果與普通PCR相當(dāng).RPA檢測(cè)技術(shù)對(duì)引物的要求比較嚴(yán)格，一般的PCR引物(長度為20 bp左右)不適用于RPA，RPA引物一般需要30～38 bp的堿基.本研究根據(jù)甘薯薯瘟病菌特異基因(orf428)設(shè)計(jì)了RPA引物，并篩選出一對(duì)擴(kuò)增效果好的特異性引物，可檢測(cè)到2株供試的甘薯薯瘟病菌DNA，而對(duì)5株其他作物青枯菌和2株非青枯菌的檢測(cè)結(jié)果為陰性.甘薯薯瘟病菌與其他作物青枯菌在分類地位上同屬青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)，但青枯菌是一個(gè)復(fù)雜的菌群，具有豐富的遺傳多樣性，不同寄主上該菌的生理生化小種不同.此外，本研究建立的RPA檢測(cè)技術(shù)不需要經(jīng)過病原菌DNA提取過程，只需要將病原菌菌液或病樣浸出液置于沸水中處理10 min，即可檢測(cè)病原菌，進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間和成本.總之，本研究建立的甘薯薯瘟病菌RPA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高(1 pg·μL-1DNA)，且能夠用于檢測(cè)土壤和水體中的甘薯薯瘟病菌.